Альгината микрокапсулы в качестве 3D-платформа для распространения и дифференциации эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) для разных линий

Все описанные ниже проводятся с использованием асептических методов внутри класса II биобезопасности Кабинета министров. Реактивы и оборудования, используемого перечислены в таблице ниже.

1. Подготовка 1,1% альгината (вес / объем)

1. Добавить 0,275 г очищенного альгинат натрия (с высоким содержанием глюкуроновой кислоты ≥ 60%, вязкость> 200 мПа с, а эндотоксина ≤ 100 EU / г) в 50 мл стерильной трубки и добавить 25 мл стерильного 0,1% раствора желатина подготовленные ранее (0,5 г gelatin/500 мл Milli-Q H ₂ O и растворяется автоклавирование).
2. Вихревые трубки в течение примерно 30 секунд, чтобы частично растворяются альгинат порошок затем поместить трубку на орбитальном смесителе в 10 мкг на ночь (комнатной температуры).
3. Добавить 2,778 мл 9% стерильный NaCl (4,5 г NaCl/50 мл Milli-Q H ₂ O) в 25 мл альгинат решение. Вихревые трубы в течение 30 секунд с последующим центрифугированием при 95 мкг в течение 5 мин.
4. Хранить раствор альгината при 4 °; C для кратковременного хранения (1-2 месяца) или при -20 ° С для длительного хранения (около года).

2. Подготовка CaCl ₂ Осадки ванной

1. Растворите 14,7 г CaCl ^_2. 2H ₂ O и 2,38 г HEPES в 1 литре Milli-Q H ₂ O.
2. Отрегулируйте уровень рН до 7,4.
3. Стерилизовать решения с использованием 0,22 мкм фильтр.
4. Осадки ванной можно хранить при комнатной температуре (6-12 месяцев).

3. Подготовка Decapsulating решения

1. В 500 мл фосфат Дульбеко буферном растворе (D-PBS), добавляют 50 мл 0,5 М ЭДТА и 5 мл 1 М HEPES.
2. Стерилизовать использованием 0,22 мкм фильтр или автоклаве при температуре 121 ° С в течение 20 мин.
3. Хранить decapsulating раствора при комнатной температуре (6-12 месяцев).

4. Подготовка сыворотки замены (SR) средней

1. До инкапсуляции, подготовить SR средние заранее, так как де-описаны в таблице конкретных реагентов и оборудования.

5. Подготовка ингибиторов ROCK (Y-27632)

1. Развести Y-27632 порошка в 0,1% сывороточного альбумина человека (HSA) в D-PBS, чтобы 5 мМ раствора.

6. Подготовка чЭСК для инкапсуляции

1. Предварительная обработка клеток с культивированием СМИ с добавлением 10 мкМ ROCK ингибитор (RI) в течение двух часов при температуре 37 ° C (защиты от света).
2. После того, как RI лечение, мытье клеток с D-PBS в два раза и выбить из клеток культуры пластин ферментативно с accutase в течение 10 мин при 37 ° C.
3. Аккуратно очистить клетки с скребок пипетки или клетки и собирают в 15 мл трубку. Нейтрализовать accutase с SR среды в соотношении 1:1.
4. Для подготовки суспензии отдельных клеток, фильтровать нейтрализованы клеток с использованием 40 мкм фильтр и собрать в свежем 50 трубы центрифуги мл.
5. Подсчитать общее количество клеток в использовании решение hemacytometer. Центрифуга клеточной суспензии 95 мкг в течение 5 мин и тщательно отбросить супернатант после этого. Вымойте клеток с предварительно нагретым 0,9% NaCl. Центрифуга 95 мкг в течение 5 мин и отказаться от супернатант.

7. Инкапсуляции клеток

1. Подготовить 1 мл шприц прилагается к мягкой пластиковой трубки из 14G х 2 "катетер. Это используется для аспирации суспензии клеток должны быть загружены на шприцевой насос, как показано на рисунке 1.
2. Ресуспендируют клеток с предварительно нагретым альгинат решение при плотности 1,25 млн. кл / мл альгината. Аккуратно перемешайте со шприцем и избежать создания пузырей.
3. Установите шарик генератор, шприцевой насос и расходомера воздуха, как показано на рисунке 1. Более подробную информацию об этих устройств приведены в таблице конкретных реагентов и оборудования.
4. С клетки атмосферный в шприц, отказаться от пластиковой трубки катетер и приложить шприц к инкапсуляции машины. Убедитесь, что есть 10 см зазора между концу инкапсуляции машины и сборный пункт, как показано на рисунке 1.
5. Инкапсуляция клеток путем установки шприца на 20 мл / ч, расход воздуха на 8 л / мин и давлении 100 кПа (размер капсулы может быть изменена путем изменения расхода воздуха).
6. Соберите инкапсулированные клетки в чашке Петри (100 х 15 мм), заполненной 20 мл подогретого осадков ванну в течение 7 мин для стабилизации капсулы.
7. Передача инкапсулированные клетки, осторожно стремление в 50 мл пробирок заполнены с 20 мл 0,9% раствора NaCl.
8. Позвольте капсулы, чтобы обосноваться в нижней части трубы, то мягко отказаться от супернатант. Повторите процесс стирки с 0,9% NaCl.
9. Ресуспендируют инкапсулированные клетки в предварительно нагретой культивирования среде с RI (10 мкм), передача в культуру колбу и выдерживают при 37 ° C / 5% CO _2.

8. Дифференциация Encapsulated чЭСК Д. А. Нейроны

1. Семенной мыши стромальной клеточной линии, ПА6 клеток при плотности 1,0 х 10 ⁴ на см ² в 0,1% желатином покрытием колбы T75 и состояние ПА6 клеток в DA нейронных дифференциации среднего (материалы см. таблицу) за 24 часа до дифференциации.
2. Передача капсулы по 50 мл центрифужные пробирки и дать им возможность обосноваться в нижней части трубы.
3. Удалите супернатант и ресуспендируют капсулы в PA6 камера с кондиционером DA нейронных среднего дифференциации.
4. Культура инкапсулированные чЭСК с ПА6 клеточный монослой (9 х 10 ⁶ ЭСК в 7,5 х 10 ⁵ клеток ПА6) в течение 28 дней с изменением средств массовой информации на 4-й день и через день после этого (изменится только половину средней каждый раз).
5. Через 3 недели в культуре клеток с ПА6, дополнять DA нейронных среднего дифференцирование 100 нг / мл SHH и 100 нг / мл FGF8a на оставшуюся неделю.

   9. Декапсуляция инкапсулированных чЭСК

   1. Аспирируйте капсулы в 15 мл центрифужные пробирки и дать им возможность поселиться в нижней части трубы. Затем отбросить супернатант тщательно.
   2. Вымойте капсулы с D-PBS в два раза. Пусть капсулы оседают на дне пробирки затем удалите супернатант.
   3. Добавьте 5 мл decapsulating решение капсулы. Смешать подвески тщательно через стремление до инкубации при комнатной температуре в течение 4-5 мин.
   4. Центрифуга декапсулируются клеток на 95 мкг в течение 3 минут и удалите супернатант.
   5. Промойте осадок клеток с D-PBS с последующим центрифугированием при 95 мкг в течение 3 мин. Повторите.
   6. Декапсулируются клеток может быть дальше, как культурный монослоя или использовать для последующих анализа.

   10. Представитель Результаты

   Диаметр альгината микрокапсулы составляет 400-500 мкм. Количество клеток в капсулу было оцеред путем подсчета общего количества клеток, поделенное на общее количество капсул в перспективе. Таким образом, около 5,0 х 10 ⁴ клеток в капсуле был оценен. Из этого мы исходим из того, что максимальное количество ячеек, капсула может содержать примерно 1,0 х 10 ^5. Жизнеспособность инкапсулированные чЭСК составляет> 80% (рис. 2), определяется с помощью использования карбоксифлуоресцеина диацетата succinimidly эфира (CFDA) / пропидия йодид (PI) анализа. Мы оптимизировали условия чЭСК инкапсуляции за счет уменьшения концентрации альгината с 2,2% до 1,1%, а за счет изменения осадков ванны из хлористого бария хлорида кальция. Из этих условий, мы показали, что только те ячейки, которые инкапсулируются с 1,1% альгинат кальция может выжить, размножаются и образуют ЭТ в пробирке ^1. Для дальнейшей оптимизации условий, влияние средств массовой информации и культивирования Р.И., Y-27632 были исследованы. Данные, представленные на рисунке 2 и 3 показывают, что RI preventeг диссоциации-индуцированного апоптоза и поддерживать жизнеспособность клеток и способствует формированию кластера ^1,6. Кроме того, жизнеспособность капсулированных чЭСК культивировали в HFF-CM RI + была значительно выше, чем в других группах без RI добавок, однако это существенно не отличаются от инкапсулированного чЭСК культивировали в РИ SR +. Кроме того, клеточную пролиферацию использовании BrdU анализа увеличилась с 25% до 75%, как отдельные клетки превратились в кластеры (рис. 3). Апоптоз анализ по TUNEL показал, что отдельные клетки в микрокапсулы культивировали в среде SR были апоптоза (данные не представлены), а полученный кластеров HFF-CM были в основном отрицательными TUNEL. В определенной степени, HFF-CM дополнить bFGF также способствовало выживанию и распространению инкапсулированные ЭСК в отсутствие Y-27632. Тем не менее, обращение с Y-27632 до (2 часа) и после инкапсуляции (для 4 дополнительных дней) заметно усиливаются жизнеспособность, пролиферацию и формирование кластера чЭСК инкапсулированныхв 1,1% микрокапсулы, альгинат кальция.

   Ранее мы показали, что инкапсулированные чЭСК можно успешно дифференцировать к окончательному энтодермы ^1. Здесь мы рассмотрели применение клеточной инкапсуляции в 3D платформу дифференцировать инкапсулированные чЭСК в нейроны DA. чЭСК, которые сформировали эмбриоидные тела (ИС) в капсулах были прямыми и дифференцированных по декапсуляция в условиях, описанных показал прогрессивный нейронной морфологии (рис. 4) через 2-3 дней культуры с более чем 90% жизнеспособность. Анализ экспрессии генов показал вниз регулирования плюрипотентных маркеров, в то время как OCT4 neuroprogenitor маркер, PAX6 и DA нейронов маркер, TH выросли, регулируется через 7 дней дифференциации (рис. 5а). Иммунофлуоресцентного окрашивания показали, что дифференцированные чЭСК были PAX6-положительным (> 80%), но OCT4-отрицательных в день 7. Далее дифференцированный чЭСК показал TH-положительным (> 90%) нейронов после 21 дней (рис. 5В). Вестерн-блот анализ также показал,до регуляции TH выражение из 14-й день (рис. 5С), а PAX6 выражение было вниз регулируется после 21-й день. Для сравнения, клетки культивируют в двумерной (2D) среды при аналогичных условиях (например, RI предварительной обработки в течение 2 часов и RI после лечения в течение 3 дней до дифференциации) поддерживается высокий процент PAX6-положительных клеток (> 80 %) в течение всего периода дифференциации и были не столь эффективны в дифференциации на TH-позитивных клеток (<60%), а в 3D-среде, создаваемой инкапсуляции (рис. 5A и C).

Ряд исследований с использованием эмбриональных стволовых клеток и чЭСК продемонстрировали преимущества 3D-системы культуры в биоматериалов и тканевой инженерии ^2,3. Мы использовали микрокапсулы альгинат кальция в качестве подходящего 3D платформой для изучения распространения чЭСК и дифференциации по сравнению с барием альгината с чЭСК показали значительно более высокие жизнеспособность, когда заключены в альгинат кальция, чем барий альгината. Эта культура также позволяет с высокой плотностью культуре клеток и обмен питательных веществ и кислорода через мембрану ^7. Спонтанное дифференциации внутри капсулы ранее наблюдались и предполагается, что недифференцированные чЭСК продолжают распространяться в капсулах, клетки в конечном итоге прорыв капсулы и формы тератома ^1. Другое клиническое применение инкапсуляции заключается в обеспечении иммунной защиты трансплантированных клеток от принимающей получателя. Предполагается, что трансплантация чЭСК и йОДП производные могут привести к иммунологических отказ, так как низкий уровень экспрессии МНС класса I антигенов недифференцированных чЭСК увеличивается после дифференцирования ^8. Кроме того, было документально подтверждено, что трансплантация обычно используют более высокие концентрации альгината, чтобы обойти иммунную процесс отказа ^2,9. Наше исследование использует более низкая концентрация альгината (1,1%), который больше подходит для в пробирке культуру и дифференциации чЭСК. Это еще предстоит определить, является ли низкая концентрация альгината мы использовали бы незаконным подобный иммунный ответ, как ранее отчетов, а также поддержания жизнеспособности клеток если эти инкапсулированные чЭСК быть пересажены в иммунокомпетентных хозяина.

Наши оптимизированный протокол инкапсуляции для инкапсуляции чЭСК производит капсулы размером 400-500 мкм диаметром. Капсулы которых меньше 400 мкм, как правило, имеют меньшее количество клеток, больше капсул (> 500 мкм) Resulт в перенаселения клеток. чЭСК инкапсуляции требует одного формированию клеток, что также способствует апоптоза клеток ^6. Мы показали здесь, что инкапсулированные чЭСК может продолжать жить, размножаться и образуют EB. Это усиливается предварительной обработки чЭСК с RI до инкапсуляции, в результате чего в> 80% чЭСК быть жизнеспособным. Таким образом, мы создали модель культуры чЭСК в 3D условиях культуру и расширили эти исследования для направленной дифференцировки в нейроны DA. Хотя метод инкапсуляции клетка была широко известна для культивирования клеток и эндодермы дифференциации, нейронная дифференциация в этих условиях не были изучены ^10,11. Мы показали, что здесь имеется повышенная экспрессия PAX6 и TH использованием анализа генов и экспрессии белков через 7 дней, по сравнению с 2D-системы дифференциации, предполагая, что 3D-среда способствует лучшему DA нейронов линии плюрипотентных от государства. Тем не менее, дальнейших успехов анализч, как допамин тест секреции и трансплантации анализа необходимо в полной мере характеризуют дифференцированных клеток. Создание надежных функциональных нейронов DA эффективно является важным требованием при клеточной терапии для лечения болезни Паркинсона в том, чтобы стать реальностью. Наши 3D-платформы, предлагаемые о совместном культивировании с Д. нервных клеток вызывающих, ПА6 клеток и высокой плотности культуры клеток системы дифференцированных нейронов DA чЭСК через инкапсуляции усилия, направленные на этом направлении.