Alginat mikrokapselkomposition som en 3D-plattform för förökning och differentiering av mänskliga embryonala stamceller (hESC) till olika linjer

Alla anvisningarna nedan utförs med aseptisk teknik inuti en klass II-biosäkerhet kabinett. Reagens och begagnade utrustningar anges i tabellerna nedan.

1. Framställning av 1,1% alginat (vikt / volym)

1. Tillsätt 0,275 g renat natriumalginat (hög glukuronsyra halt ≥ 60%, viskositet> 200 mPa s och endotoxin ≤ 100 EU / g) i en steril 50 ml rör och tillsätt 25 ml steril 0,1%-ig gelatinlösning framställdes tidigare (0,5 g gelatin/500 ml _milli-Q-H2O och löstes genom autoklavering).
2. Vortex röret under cirka 30 sekunder för att partiellt upplösa alginat pulver placera sedan röret på en orbitalblandare vid 10 OOOxg under natten (rumstemperatur).
3. Tillsätt 2,778 ml 9% steril NaCl (4,5 g NaCl/50 ml _milli-Q-H2O) till 25 ml av alginatlösning. Vortex röret under cirka 30 sekunder följt av centrifugering vid 95 OOOxg under 5 minuter.
4. Lagra alginat-lösning vid 4 °, C för kortvarig förvaring (1-2 månader) eller vid -20 ° C för långsiktig lagring (ca ett år).

2. Framställning _av CaCl2 utfällningsbad

1. Lös 14,7 g _{^CaCl2. 2 H2O} och 2,38 g HEPES i 1 liter milli-Q-H ₂ O
2. Justera pH-nivån till 7,4.
3. Sterilisera lösningen med användning av en 0,22 | im filter.
4. Utfällningsbadet kan lagras vid rumstemperatur (6-12 månader).

3. Framställning av Decapsulating lösning

1. I 500 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (D-PBS), tillsätt 50 ml 0,5 M EDTA och 5 ml 1 M HEPES.
2. Sterilisera med användning av en 0,22 | im filter eller autoklav vid 121 ° C under 20 minuter.
3. Lagra decapsulating lösningen vid rumstemperatur (6-12 månader).

4. Beredning av serum Replacement (SR) Medium

1. Före inkapsling, förbereda SR medium i förväg deskrivs i Tabell över specifika reagens och utrustning.

5. Beredning av ROCK Inhibitor (Y-27.632)

1. Späd Y-27.632 pulver i 0,1% humant serumalbumin (HSA) i D-PBS för att göra en 5 mM lösning.

6. Framställning av hESC för inkapsling

1. Pre-behandling av cellerna med odling media kompletterade med 10 pM av ROCK-inhibitor (RI) i två timmar vid 37 ° C (skyddas mot ljus).
2. Efter RI behandling, tvätta cellerna med D-PBS två gånger och avlägsna cellerna från odlingsplattorna enzymatiskt med Accutase under 10 min vid 37 ° C.
3. Försiktigt skrapa av cellerna med pipett eller cellskrapa och samlas i en 15 ml-rör. Neutralisera Accutase med SR medium i förhållandet 1:1.
4. För att framställa en enkelcellsuspension, filtrera de neutraliserade celler med användning av en 40 ^ m filter och samlas i en färsk 50 ml centrifugrör.
5. Beräkna det totala antalet celler i lösningen med användning av en hemacytometer. Centrifugera cellsuspensionen 95 OOOxg under 5 min och noggrant avlägsna supernatanten efteråt. Tvätta cellerna med förvärmd 0,9% NaCl. Centrifugera 95 OOOxg under 5 min och avlägsna supernatanten.

7. Inkapsling av celler

1. Framställ en 1 ml spruta fäst till en plastslang 14G x 2 "IV-katetern. Detta används för att aspirera cellsuspensionen som skall lastas på sprutpumpen såsom visas i figur 1.
2. Återsuspendera cellerna med förvärmd alginat-lösning vid en densitet av 1,25 miljoner celler per ml alginat. Blanda försiktigt med sprutan och undvika att skapa bubblor.
3. Inrättat vulsten generatorn, sprutpump och luftflödesmätare såsom visas i figur 1. Ytterligare detaljer för dessa anordningar visas i tabell av specifika reagens och utrustning.
4. Med cellerna sögs in i sprutan, kassera den plaströr av IV kateter och fäst sprutan till inkapsling maskinen. Kontrollera att det finns en 10 cm gap Tween slutet av inkapslingen maskinen och uppsamlingspunkten som visas i figur 1.
5. Inkapsla celler genom inställning av sprutpumpen vid 20 ml / h, luftflöde vid 8 L / minut och ett tryck av 100 kPa (storleken av kapslar kan ändras genom ändring av luftflödet).
6. Samla de inkapslade cellerna till en petriskål (100 x 15 mm) fylld med 20 ml förvärmt utfällningsbad under 7 min för att stabilisera kapslarna.
7. Överföra de inkapslade cellerna genom försiktig uppsugning i 50 ml centrifugrör fyllda med 20 ml 0,9% NaCl.
8. Tillåta kapslarna att sedimentera till botten av röret sedan försiktigt avlägsna supernatanten. Upprepa tvättförfarandet med 0,9% NaCl.
9. Resuspendera de inkapslade cellerna i förvärmd odlingsmediet kompletterats med RI (10 pM), överföring till en odlingskolv och inkuberades vid 37 ° C / _5% CO2.

8. Differentiering av inkapslad hESC till DA-neuroner

1. Frö mus stromacellinje, PA6-celler vid en densitet av 1,0 x 10 ⁴ per cm ² i 0,1% gelatin-belagda T75-flaska och konditionera PA6-celler i DA neurala differentieringsmedium (Material Tabell) 24 timmar före differentiering.
2. Överföra kapslarna till en 50 ml centrifugrör och tillåta dem att sedimentera till botten av röret.
3. Avlägsna supernatanten och återsuspendera kapslarna i PA6 cell-conditioned DA neural differentiering medium.
4. Kultur den inkapslade hESC med PA6 cellmonolagret (9 x 10 ⁶ hESCs per 7,5 x 10 ⁵ PA6 celler) under 28 dagar med en media förändring på dag 4 och varannan dag därefter (ändra bara hälften av mediet varje gång).
5. Efter 3 veckor i odling med PA6 celler, komplettera DA neurala differentieringen medium med 100 ng / ml SHH och 100 ng / ml FGF8a för den återstående veckan.

   9. Decapsulation av inkapslad hESC

   1. Aspirera kapslar in en 15 ml centrifugrör och tillåta dem att sedimentera på botten av röret. Sedan kasta supernatanten försiktigt.
   2. Tvätta kapslarna med D-PBS två gånger. Låta kapslarna sedimentera på botten av röret avlägsna supernatanten.
   3. Tillsätt 5 ml decapsulating lösning till kapslar. Blanda suspensionen grundligt via sugning före inkubation vid rumstemperatur under 4-5 min.
   4. Centrifugera decapsulated cellerna vid 95 xg under 3 min och avlägsna supernatanten.
   5. Tvätta cellpelleten med D-PBS följt av centrifugering vid 95 x g under 3 minuter. Upprepa.
   6. De decapsulated celler kan vidare odlas i ett monoskikt eller används för efterföljande analys.

   10. Representativa resultat

   Diameter alginat mikrokapslar är 400-500 nm. Antalet celler i kapseln var bedömdaed genom att beräkna det totala antalet celler dividerat med det totala antalet kapslar per körning. Därför var ca 5,0 x 10 ^4-celler per kapsel uppskattas. Från detta antar vi att det maximala antalet celler kapseln kan innehålla ungefär 1,0 x 10 ^5. Viabiliteten hos inkapslade hESC är> 80% (figur 2) såsom bestämts genom användning av med användning av karboxifluorescein-diacetat succinimidly ester (CFDA) / propidiumjodid (PI)-analys. Vi har optimerats villkoren för hESC inkapsling genom minskning av alginatkoncentration från 2,2% ned till 1,1% och genom att ändra utfällningsbadet från bariumklorid till kalciumklorid. Från dessa villkor, visade vi att endast de celler som inkapslade med 1,1% kalciumalginat kunde överleva, föröka sig och bilda EB in vitro ^1. För att ytterligare optimera tillståndet, effekterna av odling media och RI var Y-27.632 undersöktes. De data som presenteras i Figur 2 och 3 visar att RI prevented dissociation-inducerad apoptos och underhållas cellviabiliteten och främjas kluster bildas ^1,6. Dessutom var livskraft inkapslade hESC odlas i HFF-CM + RI betydligt högre än andra grupper utan RI tillskott, men det var inte signifikant annorlunda än inkapslade hESC odlas i SR + RI. På liknande sätt ökade celltillväxt med användning av BrdU-analys från 25% till 75% som enskilda celler utvecklade i kluster (figur 3). Apoptos analysen genom TUNEL avslöjade att de enskilda cellerna i mikrokapslar odlade i SR medium var apoptotiska (data visas ej), medan de hämtade kluster från HFF-CM var mestadels negativa för TUNEL. I viss mån främjat HFF-CM kompletteras med bFGF också överlevnaden och spridningen av inkapslade hESCs i frånvaro av Y-27.632. Men behandling med Y-27.632 före (2 timmar) och efter inkapsling (för ytterligare 4 dagar) markant ökad lönsamhet, tillväxt och kluster av inkapslat hESCi 1,1% kalciumalginat mikrokapslar.

   Tidigare har vi visat att inkapslade hESC framgångsrikt kan differentieras till definitiv endoderm ^1. Här har vi granskat tillämpningen av cellinkapslingsorgan som en 3D-plattform för att differentiera inkapslade hESC in DA-neuroner. hESC, som bildas embryoidkroppar (EB) i kapslar var direkt differentierad och decapsulation under de beskrivna betingelserna uppvisade en progressiv neuronal morfologi (fig. 4) efter 2-3 dagars odling med mer än 90% viabilitet. Genuttrycksanalys visade en nedreglering av pluripotenta markör, Oct4 medan neuroprogenitor markör PAX6 och DA neuronal markör, TH hade uppregleras efter 7 dagars differentiering (figur 5A). Immunfluorescensfärgning avslöjade att differentierad hESC var PAX6-positiva (> 80%) men Oct4-negativa dag 7. Ytterligare differentierad hESC visade TH-positiva (> 90%) neuroner efter 21 dagar (figur 5B). Western blot-analys visade ocksåen uppreglering av TH expression från dag 14 (figur 5C) medan Pax6-expression var nedregleras efter dag 21. I jämförelse, cellerna odlas under två-dimensionell (2D) miljö under liknande betingelser (t.ex. Rl förbehandling under 2 timmar och RI efter behandling under 3 dagar före differentiering) bibehöll en hög procentandel av Pax6-positiva celler (> 80 %) under hela perioden differentiering och var inte lika effektiv i att differentiera till TH-positiva celler (<60%) såsom i 3D-miljö som tillhandahålls av inkapsling (figur 5A och C).

Flera studier med mus embryonala stamceller och hESC har visat fördelarna med 3D kultur systemet i biomaterial och vävnadsteknik ^2,3. Vi använde mikrokapslar kalciumalginat som en lämplig 3D plattform för att studera hESC utbredning och differentiering i jämförelse med barium alginat då hESC visade signifikant högre överlevnad då inkapslade i kalciumalginat än barium alginat. Detta odlingssystem möjliggör också en hög densitet cellkultur och utbyte av näringsämnen och syre tvärs över membranet ^7. Spontan differentiering i kapslarna tidigare har observerats och det antas att när odifferentierad hESC fortsätter att proliferera i kapslarna, de celler som slutligen skulle utbrytning av kapslarna och formen teratom ^1. En annan klinisk tillämpning av inkapsling är att tillhandahålla immunskydd av transplanterade celler från värden mottagaren. Det förväntas att transplantation av hESC och thEIR derivat kan leda till immunologisk avstötning eftersom den låga nivån av expression av MHC klass I-antigener av odifferentierade hESC ökas efter differentiering ^8. Det har också dokumenterats att transplantation vanligen utnyttjar högre koncentrationer av alginat för att kringgå den immunavstötningsprocess ^2,9. Vår studie använder en lägre koncentration av alginat (1,1%), som är mer lämplig för in vitro-odling och differentiering av hESC. Det är ännu inte avgöra om den lägre koncentrationen av alginat har vi använt skulle olaglig ett liknande immunsvar liksom tidigare rapporter samt behålla cellviabiliteten bör dessa inkapslade hESC att transplanteras i immunkompetenta värd.

Vår optimerad inkapsling protokoll för inkapsling hESC producerar kapslar storlek 400-500 m diameter. Kapslar, vilka är mindre än 400 | im tenderar att ha färre celler medan större kapslar (> 500 ^ m) Resulton en överbefolkning av celler. hESC inkapsling kräver en enda cell formation, som också främjar cell apoptos ^6. Vi har visat här att inkapslade hESC kan fortsätta att överleva, proliferera och bilda EB. Detta förstärks av förbehandling av hESC med RI före inkapsling, vilket resulterar i> 80% hESC livskraftig. Därför har vi etablerat en modell för kultur hESC i 3D odlingsbetingelser, och har utökat dessa studier för riktad differentiering till DA neuron. Även cellinkapsling teknik har fått stor välkänd för cellodling och endodermalt differentiering, neural differentiering under dessa förhållanden har inte studerats grundligt ^10,11. Vi har visat här att det finns en ökad uttryck av Pax6 och TH med användning av gen-och proteinuttryck analyser efter 7 dagar i jämförelse med 2D differentiering systemet, vilket antyder att 3D-miljö befrämjar bättre DA neuronal härstamning från pluripotent tillstånd. Men ytterligare analyser framgångsrikah som dopamin utsöndring test och transplantation analys krävs för att fullständigt karaktärisera de differentierade cellerna. Generera robusta funktionella DA neuron effektivt är ett viktigt krav om cellterapi vid Parkinsons sjukdom är att bli en verklighet. Vår 3D-plattform som föreslås om samodling med DA neurala inducerande celler, PA6 celler och hög densitet cellodling system för DA neuronal differentierad hESC via inkapsling är ett försök i den riktningen.