Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Alle der unten beschriebenen Verfahren werden unter aseptischen Bedingungen in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank durchgeführt. Reagenzien und Geräte verwendet werden in der untenstehenden Tabelle aufgelistet.

1. Herstellung von 1,1% Alginat (w / v)

1. In 0,275 g gereinigtes Natriumalginat (high Glucuronsäure-Gehalt ≥ 60%, Viskosität> 200 mPa · s, und Endotoxin ≤ 100 EU / g) in einem sterilen 50 ml-Röhrchen und 25 ml sterilem 0,1% Gelatinelösung früheren (0,5 g hergestellt gelatin/500 ml Milli-Q-H ₂ O gelöst und durch Autoklavieren).
2. Vortex das Rohr für ca. 30 Sekunden, um die teilweise aufzulösen Alginatpulver legen Sie dann das Rohr auf einer Orbitalmischer bei 10 xg über Nacht (Raumtemperatur).
3. In 2,778 ml von 9% steriler NaCl (4,5 g NaCl/50 ml Milli-Q-H ₂ O) in 25 ml Alginatlösung. Vortex das Rohr für etwa 30 Sekunden durch Zentrifugation bei 95 × g für 5 min.
4. Bewahren Sie die Alginat-Lösung bei 4 °, C für die kurzfristige Lagerung (1-2 Monate) oder bei -20 ° C für die langfristige Lagerung (ungefähr ein Jahr).

2. Vorbereitung von CaCl ₂ Fällbad

1. Man löst 14,7 g CaCl ^_2. 2H ₂ O und 2,38 g HEPES in 1 Liter Milli-Q H ₂ O.
2. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4.
3. Sterilisieren Sie die Lösung mit dem 0,22 um-Filter.
4. Fällbad kann bei Raumtemperatur (6-12 Monate) gelagert werden.

3. Herstellung von Lösung Entkapseln

1. In 500 ml Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (D-PBS), 50 ml 0,5 M EDTA und 5 ml 1 M HEPES.
2. Sterilisieren mit einem 0,22 um Filter oder Autoklaven bei 121 ° C für 20 min.
3. Bewahren Sie die decapsulating Lösung bei Raumtemperatur (6-12 Monate).

4. Vorbereitung von Serum-Ersatz (SR) Medium

1. Vor der Einkapselung vorbereiten SR Medium im Voraus, da debeschrieben in der Tabelle von spezifischen Reagenzien und Geräte.

5. Vorbereitung der ROCK-Inhibitor (Y-27632)

1. Verdünnte Y-27632 Pulver in 0,1% humanes Serumalbumin (HSA) in D-PBS, um einen 5 mM Lösung herzustellen.

6. Vorbereitung für die Verkapselung von HES

1. Pre-behandeln die Zellen mit Kulturmedien mit 10 uM von ROCK-Inhibitor (RI) für zwei Stunden bei 37 ° C (vor Licht schützen) ergänzt.
2. Nach der Behandlung RI, waschen Sie die Zellen mit D-PBS zweimal verdrängen die Zellen von Kulturplatten enzymatisch mit Accutase für 10 min bei 37 ° C
3. Vorsichtig kratzen die Zellen mit der Pipette oder Zellschaber und sammeln sich in einem 15 ml-Tube. Neutralisieren Sie die Accutase mit SR Medium im Verhältnis 1:1.
4. Um eine einzelne Zellsuspension herzustellen, filtern Sie die neutralisierte Zellen unter Verwendung eines 40 um Filter zu sammeln und in einem frischen 50 ml Zentrifugenröhrchen.
5. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen in der Lösung unter Verwendung eines Hämozytometers bestimmt. Zentrifugieren der Zellsuspension 95 xg für 5 min und vorsichtig den Überstand verwerfen danach. Waschen Sie die Zellen mit vorgewärmten 0,9% NaCl. Zentrifugieren 95 xg für 5 min und den Überstand verwerfen.

7. Verkapselung der Zellen

1. Eine 1 ml-Spritze an einem weichen Kunststoffschlauch 14G x 2 "IV-Katheter. Dies wird verwendet, um die Zellsuspension auf der Spritzenpumpe geladen werden, wie in 1 gezeigt anzusaugen.
2. Die Zellen mit vorgewärmter Alginatlösung in einer Dichte von 1,25 Millionen Zellen / ml Alginat. Vorsichtig mit der Spritze zu mischen und zu vermeiden Blasen zu erzeugen.
3. Einrichten des Wulstes Generator, Spritzenpumpe und die Luft-Durchflußmesser wie in 1 gezeigt. Weitere Details dieser Vorrichtungen sind in Tabelle der Reagenzien und Geräten angegeben.
4. Mit den Zellen in die Spritze gesaugt, verwerfen Sie den Kunststoffschlauch von IV-Katheter und legen Sie die Spritze mit der Kapselung Maschine. Stellen Sie sicher, dass es eine 10 cm Abstand sein zwischen das Ende der Einkapselungsmaschine und die Sammelstelle wie in 1 gezeigt.
5. Kapseln der Zellen, indem die Spritzenpumpe mit 20 ml / h, Luftdurchsatz in 8 l / min und einem Druck von 100 kPa (die Größe der Kapseln können durch Veränderung der Luftmenge geändert werden).
6. Sammeln Sie die verkapselten Zellen in eine Petrischale (100 x 15 mm) mit 20 ml vorgewärmten Fällbad für 7 min, um die Kapseln zu stabilisieren gefüllt.
7. Übertragen Sie die verkapselten Zellen durch leichtes Ansaugen in 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 20 ml 0,9% NaCl gefüllt.
8. Willkommen, dass die Kapseln in den Boden des Röhrchens absetzen dann vorsichtig der Überstand verworfen. Wiederholen Sie den Waschvorgang mit 0,9% NaCl.
9. Resuspendieren Sie die verkapselten Zellen in vorgewärmten Kulturmedium mit der RI (10 uM), Transfer in eine Kulturflasche ergänzt und bei 37 ° C / 5% CO _2.

8. Differenzierung von hES-Encapsulated zu DA-Neuronen

1. Samen der Maus Stroma-Zelllinie, PA6 Zellen bei einer Dichte von 1,0 x 10 ⁴ pro cm ² in 0,1% Gelatine beschichteten T75-Kolben und den Zustand der Zellen in PA6 DA neuronalen Differenzierung Medium (Tabelle Materialien) 24 Stunden vor der Differenzierung.
2. Übertragen der Kapseln in einen 50 ml-Zentrifugenröhrchen und es ihnen ermöglichen, in den Boden des Rohrs zu regeln.
3. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Kapseln in PA6 Zelle klimatisierte DA neuronalen Differenzierung Medium.
4. Kultur der gekapselte hESC mit der PA6 Zellmonolayer (9 x 10 ⁶ hESCs pro 7,5 x 10 ⁵ PA6-Zellen) für 28 Tage mit einem Medienwechsel an Tag 4 und jeden zweiten Tag danach (ändern nur die Hälfte des Mediums jedes Mal).
5. Nach 3 Wochen in Kultur mit PA6-Zellen, zu ergänzen, die neurale Differenzierung DA-Medium mit 100 ng / ml SHH und 100 ng / ml FGF8a für die restliche Woche.

   9. Decapsulation von Encapsulated hESC

   1. Saugen Sie die Kapseln in einem 15 ml-Zentrifugenröhrchen und es ihnen ermöglichen, am Boden des Röhrchens zu begleichen. Dann vorsichtig den Überstand verwerfen.
   2. Waschen Sie die Kapseln mit D-PBS zweimal. Lassen Sie die Kapseln am Boden des Röhrchens absetzen entfernen Sie dann den Überstand.
   3. 5 ml decapsulating Lösung für die Kapseln. Mischen Sie die Suspension gründlich durch Absaugen vor der Inkubation bei Raumtemperatur für 4-5 min.
   4. Zentrifugieren Sie die nebennierenlosen Zellen bei 95 xg für 3 min und den Überstand verwerfen.
   5. Waschen des Zellpellets mit D-PBS, gefolgt von Zentrifugation bei 95 × g für 3 min. Wiederholen.
   6. Die nebennierenlosen Zellen können weiter kultiviert als Mono-oder verwendet für Downstream-Analyse.

   10. Repräsentative Ergebnisse

   Der Durchmesser der Alginat-Mikrokapseln ist 400-500 um. Die Anzahl der Zellen innerhalb der Kapsel war eine Schätzung dered durch Berechnen der Gesamtzahl der Zellen durch die Gesamtzahl von Kapseln pro Lauf unterteilt. Daher wurden etwa 5,0 × 10 ⁴ Zellen pro Kapsel geschätzt. Daraus gehen wir davon aus, dass die maximale Anzahl von Zellen kann die Kapsel enthalten etwa 1,0 x 10 ⁵ ist. Die Lebensfähigkeit der verkapselten hESC ist> 80% (Abbildung 2) wie durch Verwendung Carboxyfluoresceindiacetat succinimidly Ester (CFDA) / Propidiumiodid (PI)-Assay bestimmt. Wir haben die Bedingungen von HES-Kapselung durch eine Verringerung der Alginat-Konzentration von 2,2% auf 1,1% gesunken und durch Änderung der Fällbad von Bariumchlorid zu Calciumchlorid optimiert. Von diesen Bedingungen haben wir gezeigt, dass nur die Zellen, die mit 1,1% Calciumalginat verkapselt waren, konnten überleben, vermehren sich und bilden EBs in vitro ^ein. Zur weiteren Optimierung der Bedingungen, die Auswirkungen von Kulturmedien und RI, Y-27632 wurden untersucht. Die Daten, wie in Abbildung 2 und 3 zeigen, dass die präsentierte RI Prévented Dissoziation-induzierten Apoptose und die Lebensfähigkeit der Zellen aufrecht erhalten und gefördert Clusterbildung ^1,6. Außerdem war die Lebensfähigkeit der verkapselten hESC in HFF-CM + RI kultiviert deutlich höher als andere Gruppen ohne RI-Supplementierung, aber das war nicht signifikant unterschiedlich zu gekapselten hESC in SR + RI kultiviert. In ähnlicher Weise erhöhte Zellproliferation mit BrdU-Assay von 25% bis 75% als einzelne Zellen in Cluster (3), entwickelt. Apoptoseassay durch TUNEL zeigte, dass die einzelnen Zellen in Mikrokapseln in der SR-Medium apoptotischen waren (Daten nicht gezeigt), während die abgerufenen Cluster der HFF-CM waren überwiegend negativ für TUNEL. Bis zu einem gewissen Ausmaß, HFF-CM mit bFGF ergänzt gefördert das Überleben und die Proliferation von eingekapselten HES in Abwesenheit von Y-27632. Die Behandlung mit Y-27632 vor (2 Stunden) und nach der Verkapselung (für weitere 4 Tage) deutlich verbesserte Lebensfähigkeit, der Vermehrung und Clusterbildung von verkapselten hESCin 1,1% Calcium-Alginat-Mikrokapseln.

   Bisher haben wir gezeigt, dass gekapselten hESC erfolgreich auf definitive Entoderm ¹ unterschieden werden. Hier untersuchten wir die Anwendung der Verkapselung von Zellen als 3D-Plattform, um gekapselte hESC in DA-Neuronen zu differenzieren. hESC, die Embryoidkörpern (EB) in Kapseln gebildet waren direkte differenzierte und auf Entkapselung unter den beschriebenen Bedingungen zeigten eine progressive neuronale Morphologie (Abbildung 4) nach 2-3 Tagen Kultur mit mehr als 90% Lebensfähigkeit. Genexpressionsanalysen zeigten eine Down-Regulation von pluripotenten Marker, während OCT4 neuroprogenitor Marker, PAX6 und DA neuronalen Marker, TH wurden nach 7 Tagen der Differenzierung (5A) hochreguliert. Immunfluoreszenz-Färbung zeigte, dass differenzierte HES PAX6-positiv (> 80%), aber OCT4-negativ waren am Tag 7. Weitere differenzierte hES zeigte TH-positiv (> 90%) Neuronen nach 21 Tagen (Abbildung 5B). Western-Blot-Analyse zeigte auch,eine Hochregulation der Expression TH ab Tag 14 (5C), während PAX6 Expression wurde nach Tag 21 nach unten reguliert. Im Vergleich dazu die Zellen unter zweidimensionalen (2D)-Umgebung unter ähnlichen Bedingungen kultiviert (zB RI Vorbehandlung für 2 Stunden und RI Nachbehandlung für 3 Tage vor der Differenzierung) gehalten einen hohen Prozentsatz von Pax6-positiven Zellen (> 80 %) während der Differenzierung und Zeit waren nicht so effizient bei der Differenzierung zu TH-positiven Zellen (<60%) wie in 3D-Umgebung durch Kapselung (5A und C) zur Verfügung gestellt.

Mehrere Studien mit embryonalen Stammzellen der Maus und menschlichen embryonalen Stammzellen haben die Vorteile der 3D-Kultur-System in den Bereichen Biomaterialien und Tissue Engineering ^2,3 demonstriert. Wir verwendeten Kalzium-Alginat-Mikrokapseln als eine geeignete Plattform, um 3D-Vermehrung und Differenzierung embryonaler Stammzellen im Vergleich zu Barium-Alginat studieren seit hESC zeigten signifikant höhere Rentabilität als in Calciumalginat als Barium-Alginat verkapselt. Diese Kultur System ermöglicht auch eine hohe Dichte der Zellkultur und Austausch von Nährstoffen und Sauerstoff, über die Membran ^7. Spontane Differenzierung in den Kapseln wurde zuvor beobachtet, und es wird angenommen, dass als undifferenzierte HES innerhalb der Kapseln proliferieren weiter, würden die Zellen schließlich Ausbruch der Kapseln und Form Teratom ^1. Eine weitere klinische Anwendung der Kapselung ist Immunschutz von transplantierten Zellen von dem Host-Empfänger bereitzustellen. Es wird erwartet, dass die Transplantation von embryonalen Stammzellen und thEIR Derivate können zu einer immunologischen Abstoßung führen, da das niedrige Niveau der Expression von MHC Klasse I-Antigene undifferenzierter embryonaler Stammzellen nach der Differenzierung ⁸ erhöht wird. Es wurde auch dokumentiert, dass die Transplantation verwendet üblicherweise höhere Konzentrationen an Alginat, um die Immunabwehr zu umgehen Verfahren ^2,9. Unsere Studie verwendet eine niedrigere Konzentration von Alginat (1,1%), die besser geeignet für die in vitro Kultur und Differenzierung von embryonalen Stammzellen ist. Es ist noch bestimmt werden, ob die geringere Konzentration von Alginat haben wir verwendet würde eine ähnliche illegale Immunantwort wie zuvor Berichte sowie die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen diese gekapselten hESC in einem immunkompetenten Wirt sollte transplantiert werden.

Unsere optimierte Kapselung Protokoll zur Verkapselung von menschlichen embryonalen Stammzellen produziert Kapseln Größe von 400-500 Mikrometer Durchmesser. Kapseln, die kleiner als 400 mu m tendenziell weniger Zellen haben, während größere Kapseln (> 500 pm) Result in einer Überbevölkerung von Zellen. hES-Kapselung erfordert eine einzelne Zelle die Bildung, die auch fördert Zell-Apoptose ^6. Wir haben hier gezeigt, dass gekapselten hESC fortgesetzt werden kann, um zu überleben, vermehren sich und bilden EB. Dies wird durch eine Vorbehandlung des hESC mit RI vor der Einkapselung, was zu> 80% hESC der Tragfähigkeit verbessert. Damit haben wir ein Modell zur Kultur embryonaler Stammzellen in 3D-Kulturbedingungen etabliert und erweitert diese Studien für die gerichtete Differenzierung in DA-Neuronen. Obwohl Zellverkapselung Technik wurde in großem Stil für die Zellkultur und entodermale Differenzierung neuraler Differenzierung unter diesen Bedingungen bekannt wurde nicht gründlich studiert ^10,11. Wir haben hier, dass es eine erhöhte Expression von Pax6 und TH mit Gen-und Proteinexpression Analysen nach 7 Tagen im Vergleich zu 2D-Differenzierung System, was darauf hindeutet, dass die 3D-Umgebung besser DA neuronale Linie fördert aus pluripotenten Zustand gezeigt. Allerdings sind weitere Analysen erfolgreichh als Dopaminsekretion Test und Transplantation Assay benötigt für die vollständige Charakterisierung der differenzierten Zellen. Generierung robuster funktionale DA-Neuronen effizient ist eine wesentliche Voraussetzung, wenn der Zelltherapie zur Behandlung der Parkinson-Krankheit ist eine Realität werden. Unsere 3D-Plattform, wie etwa Co-Kultivierung mit DA neuronalen Zellen induzieren, PA6-Zellen und High-Density-Zellkultur-System von DA neuronalen differenzierte hES über Verkapselung vorgeschlagen ist ein Versuch in diese Richtung.