Microcapsule di alginato come piattaforma 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) per diverse linee

Tutte le procedure riportate di seguito vengono eseguite con tecniche asettiche all'interno di una II classe biosicurezza Cabinet. Reagenti e attrezzature usati sono elencati nelle tabelle seguenti.

1. Preparazione del 1,1% alginato (w / v)

1. Aggiungere 0,275 g di alginato di sodio purificato (elevato contenuto di acido glucuronico ≥ 60%, viscosità> 200 mPa s, e endotossina ≤ 100 EU / g) in uno sterile tubo da 50 ml e aggiungere 25 ml di soluzione sterile 0,1% di gelatina preparata in precedenza (0,5 g gelatin/500 ml milli-Q H ₂ O e sciolto in autoclave).
2. Vortex la provetta per circa 30 secondi per sciogliere parzialmente la polvere di alginato quindi posizionare il tubo in un mixer orbitale a 10 xg per il pernottamento (temperatura ambiente).
3. Aggiungere 2,778 ml del 9% sterile di NaCl (4,5 g di NaCl/50 ml Milli-Q H ₂ O) a 25 ml di soluzione di alginato. Vortex la provetta per circa 30 secondi, seguito da centrifugazione a 95 xg per 5 min.
4. Conservare la soluzione di alginato a 4 °; C per la conservazione a breve termine (1-2 mesi) oppure a -20 ° C per la conservazione a lungo termine (circa un anno).

2. Preparazione di CaCl ₂ Bath Precipitazioni

1. Sciogliere 14.7 g di CaCl ^_2. 2H ₂ O e 2,38 g di HEPES in 1 litro di Milli-Q H ₂ O.
2. Regolare il livello di pH a 7,4.
3. Sterilizzare la soluzione con un filtro di 0,22 micron.
4. Bagno precipitazione può essere conservato a temperatura ambiente (6-12 mesi).

3. Preparazione della soluzione decapsulating

1. In 500 ml di Phosphate Buffered Saline Dulbecco (D-PBS), aggiungere 50 ml di EDTA 0,5 M e 5 ml di HEPES 1M.
2. Sterilizzare usando un filtro di 0,22 micron o autoclave a 121 ° C per 20 min.
3. Conservare la soluzione decapsulating a temperatura ambiente (6-12 mesi).

4. Preparazione del siero di ricambio (SR) Medium

1. Prima di incapsulamento, preparare media SR in anticipo, come dedescritto nella tabella di reagenti e attrezzature specifiche.

5. Preparazione di Inhibitor ROCK (Y-27632)

1. Diluire Y-27.632 in polvere 0,1% albumina sierica umana (HSA) in D-PBS per ottenere una soluzione 5 mM.

6. Preparazione di hESC per l'incapsulamento

1. Pre-trattare le cellule con mezzi di coltura additivato con il 10 pM di inibitore ROCK (RI) per due ore a 37 ° C (riparo dalla luce).
2. Dopo il trattamento RI, lavare le cellule con D-PBS due volte e rimuovere le cellule da piastre di coltura enzimaticamente con accutase per 10 min a 37 ° C.
3. Raschiare delicatamente le cellule con il raschietto pipetta o cellulare e raccogliere in una provetta da 15 ml. Neutralizzare il accutase con il mezzo SR in rapporto 1:1.
4. Per preparare una sospensione di cellule singole, filtrare le cellule neutralizzati usando un filtro 40 um e raccogliere in un nuovo tubo da 50 ml centrifuga.
5. Calcolare il numero totale di cellule in soluzione con un emocitometro. Centrifugare la sospensione cellulare 95 xg per 5 minuti e accuratamente scartare il surnatante dopo. Lavare le cellule con pre-riscaldata 0,9% NaCl. Centrifugare 95 xg per 5 minuti e scartare il surnatante.

7. Incapsulamento delle celle

1. Preparare una siringa da 1 ml collegata a un tubo di plastica morbida 14G x 2 "catetere IV. Questo viene utilizzato per aspirare la sospensione cellulare da caricare al pompa a siringa come mostrato nella Figura 1.
2. Risospendere le cellule con preriscaldata soluzione di alginato ad una densità di 1,25 milioni di cellule / ml alginato. Mescolare delicatamente con la siringa ed evitare di creare bolle.
3. Impostare il generatore tallone, pompa a siringa e il flussometro come mostrato nella Figura 1. Maggiori dettagli di questi dispositivi sono elencati nella Tabella di reagenti e attrezzature specifiche.
4. Con le cellule aspirato nella siringa, scartare il tubo di plastica del catetere IV e collegare la siringa alla macchina incapsulamento. Assicurarsi che vi sia spazio a 10 centimetri essere tra la fine della macchina incapsulamento e il punto di raccolta, come mostrato nella Figura 1.
5. Incapsulare le cellule impostando la pompa a siringa a 20 ml / h, portata d'aria a 8 L / min e una pressione di 100 kPa (la dimensione di capsule può essere modificata modificando la portata d'aria).
6. Raccogliere le cellule incapsulate in una capsula di Petri (100 x 15 mm) riempita con 20 ml di pre-riscaldato bagno precipitazione per 7 minuti per stabilizzare le capsule.
7. Trasferire le cellule incapsulate aspirando piano in provette per centrifuga da 50 ml contenenti 20 ml di 0,9% NaCl.
8. Lasciare le capsule a depositarsi nella parte inferiore del tubo poi delicatamente scartare il surnatante. Ripetere il processo di lavaggio con NaCl 0,9%.
9. Risospendere le cellule incapsulate in preriscaldata terreno di coltura supplementato con RI (10 pM), il trasferimento in un pallone di coltura e incubate a 37 ° C / 5% CO _2.

8. Differenziazione delle hESC incapsulato in neuroni DA

1. Seme della linea cellulare topo stromale, PA6 cellule ad una densità di 1,0 x 10 ⁴ per cm ² in 0,1% di gelatina rivestita T75 pallone e le condizioni PA6 cellule in mezzo differenziamento DA neurale (Tabella Materials) 24 ore prima della differenziazione.
2. Trasferire le capsule ad una provetta da centrifuga da 50 ml e consentire loro di depositarsi nella parte inferiore del tubo.
3. Eliminare il supernatante e risospendere le capsule in PA6 cella climatizzata di media differenziazione DA neurale.
4. Cultura del hESC incapsulato con il monostrato cellulare PA6 (9 x 10 ⁶ hESC per 7,5 x 10 ⁵ cellule PA6) per 28 giorni con un cambiamento dei media il giorno 4 e ogni altro giorno successivo (cambiare solo la metà del terreno di volta in volta).
5. Dopo 3 settimane in coltura con cellule PA6, integrare il mezzo DA differenziamento neurale con 100 ng / ml SHH e 100 ng / ml FGF8a per la settimana rimanente.

   9. Decapsulation di hESC Encapsulated

   1. Aspirare le capsule in una provetta da centrifuga da 15 ml e consentire loro di depositano sul fondo della provetta. Poi scartare il surnatante con cura.
   2. Lavare le capsule con D-PBS due volte. Lasciare le capsule si depositano sul fondo della provetta quindi rimuovere il supernatante.
   3. Aggiungere 5 ml di soluzione decapsulating alle capsule. Mescolare la sospensione accuratamente tramite aspirazione prima di incubazione a temperatura ambiente per 4-5 min.
   4. Centrifugare le cellule decapsulati a 95 xg per 3 min e scartare il surnatante.
   5. Lavare il pellet di cellule con D-PBS seguita da centrifugazione a 95 xg per 3 min. Ripeti.
   6. Le cellule decapsulate possono essere ulteriormente coltivate come monostrato o utilizzati per l'analisi a valle.

   10. Risultati rappresentativi

   Il diametro delle microcapsule è alginato di 400-500 micron. Il numero delle cellule all'interno della capsula era estimated calcolando il numero totale di cellule diviso per il numero totale di capsule per corsa. Pertanto, a circa 5,0 x 10 ⁴ cellule per capsula è stato stimato. Da questo, si presume che il numero massimo di cellule della capsula può contenere è di circa 1,0 x 10 ^5. La redditività di hESC incapsulato è> 80% (Figura 2) come determinato utilizzando con diacetato carbossifluoresceina succinimidly estere (CFDA) / ioduro di propidio (PI) test. Abbiamo ottimizzato le condizioni di incapsulamento hESC diminuendo la concentrazione di alginato dal 2,2% al 1,1% e modificando il bagno precipitazione da cloruro di bario cloruro di calcio. Da queste condizioni, abbiamo dimostrato che solo le cellule che sono state incapsulate con alginato di calcio 1,1% potrebbe sopravvivere, proliferare e formare EBs in vitro ^1. Per ottimizzare ulteriormente la condizione, gli effetti dei mezzi di coltura e RI, Y-27.632 sono stati esaminati. I dati presentati in Figura 2 e 3 dimostrano che prevente RId dissociazione apoptosi indotta e mantenuta la vitalità cellulare e la formazione di cluster promosso ^1,6. Inoltre, la vitalità di hESC coltivate in incapsulato HFF-CM RI + era significativamente più alta rispetto agli altri gruppi senza supplementazione RI, ma questo non era significativamente diversa da incapsulato hESC coltivate in RI SR +. Analogamente, la proliferazione cellulare mediante saggio BrdU aumentata dal 25% al ​​75% come singole cellule sviluppate in cluster (Figura 3). Apoptosi da TUNEL rivelato che le singole cellule in microcapsule coltivate in mezzo SR erano apoptotico (dati non mostrati), mentre i cluster recuperati dalla HFF-CM erano negative per lo più TUNEL. In una certa misura, HFF-CM supplementate con bFGF anche promosso la sopravvivenza e la proliferazione delle hESC incapsulati in assenza di Y-27.632. Tuttavia, il trattamento con Y-27.632 prima (2 ore) e dopo l'incapsulamento (per altri 4 giorni) marcatamente migliorata viabilità, la proliferazione e la formazione dei cluster hESC incapsulatoin microcapsule 1,1% di calcio alginato.

   In precedenza abbiamo dimostrato che hESC incapsulato può essere successo differenziate per endoderma definitivo ^1. Qui, abbiamo esaminato l'applicazione di incapsulamento delle cellule come una piattaforma 3D per differenziare hESC incapsulato in neuroni DA. hESC, che formavano corpi embrionali (EB) in capsule erano diretti differenziata e decapsulation alle condizioni descritte hanno mostrato una progressiva morfologia neuronale (Figura 4) dopo 2-3 giorni di coltura con oltre il 90% vitalità. Analisi di espressione genica ha mostrato una down-regulation dei marker pluripotenti, OCT4 mentre marker neuroprogenitor, PAX6 e marker DA neuronale, TH sono up-regolati dopo 7 giorni di differenziazione (Figura 5A). Colorazione immunofluorescenza ha rivelato che hESC differenziata erano PAX6-positivi (> 80%), ma OCT4-negativi al giorno 7. Ulteriori hESC differenziato mostrato TH-positivi (> 90%) neuroni dopo 21 giorni (Figura 5B). Western blot ha dimostratoun up-regolazione dell'espressione dei TH dal giorno 14 (Figura 5C), mentre PAX6 espressione era down-regolato dopo giorno 21. In confronto, le cellule coltivate in ambiente bidimensionale (2D) in condizioni analoghe (RI esempio pretrattamento per 2 ore e RI post-trattamento per 3 giorni prima differenziazione) mantenuta un'alta percentuale di cellule positive PAX6-(> 80 %) per tutto il periodo di differenziazione e non erano così efficienti nella differenziazione di cellule TH-positive (<60%) come in ambiente 3D fornito da incapsulamento (Figura 5A e C).

Diversi studi che utilizzano cellule staminali embrionali di topo e hESC hanno dimostrato i benefici del sistema di coltura 3D in biomateriali e ingegneria dei tessuti ^2,3. Abbiamo usato microcapsule di alginato di calcio come una piattaforma adatta 3D per studiare la propagazione hESC e la differenziazione rispetto a quanto hESC alginato di bario hanno mostrato significativa redditività superiore quando incapsulati in alginato di calcio di alginato di bario. Questo sistema consente inoltre una coltura ad alta densità di coltura cellulare e scambio di nutrienti e ossigeno attraverso la membrana ^7. Differenziazione spontanea nelle capsule è stato precedentemente osservato e si presume che come hESC indifferenziato continuano a proliferare all'interno delle capsule, le cellule sarebbe poi rottura delle capsule e teratoma modulo ^1. Un'altra applicazione clinica di incapsulamento è quello di fornire protezione immunitaria di cellule trapiantate dal destinatario host. Si prevede che il trapianto di hESC e Thderivati ​​della REI può portare al rigetto immunologico in quanto il basso livello di espressione di antigeni MHC di classe I di hESC indifferenziata è aumentata dopo la differenziazione ^8. È stato inoltre documentato che il trapianto utilizza di solito più alta concentrazione di alginato, al fine di eludere il processo di rigetto immunitario ^2,9. Il nostro studio utilizza una concentrazione inferiore di alginato (1,1%) che è più adatto per la coltura in vitro e la differenziazione di hESC. E 'ancora da stabilire se la concentrazione più bassa di alginato abbiamo usato sarebbe illecita una risposta immunitaria simile come in precedenza rapporti, nonché il mantenimento della vitalità cellulare qualora queste hESC incapsulato essere trapiantate in un ospite immunocompetente.

Il nostro protocollo di incapsulamento ottimizzato per l'incapsulamento hESC dimensioni produce capsule 400-500 micron di diametro. Capsule che sono inferiori a 400 micron tendono ad avere un minor numero di celle mentre le grandi capsule (> 500 micron) result in una sovrappopolazione di cellule. incapsulamento hESC richiede una formazione singola cellula, che promuove anche l'apoptosi delle cellule ^6. Abbiamo dimostrato qui che hESC incapsulato può continuare a sopravvivere, proliferare e formare EB. Questo è arricchita da pre-trattando il hESC con RI prima di incapsulamento, con conseguente> hESC 80% è percorribile. Così, abbiamo stabilito un modello per la cultura hESC in condizioni di coltura 3D e hanno esteso questi studi per la differenziazione in neuroni DA diretto. Sebbene tecnica di incapsulamento delle cellule è stato ampiamente noto per la coltura cellulare e la differenziazione endodermico, differenziamento neurale in queste condizioni non è stato studiato a fondo ^10,11. Abbiamo mostrato che vi è un aumento dell'espressione PAX6 e TH usando analisi di espressione genica e proteine ​​dopo 7 giorni rispetto al sistema di differenziazione 2D, suggerendo che l'ambiente 3D favorisce una migliore lignaggio DA neuronale stato pluripotente. Tuttavia, ulteriori analisi such come prova la secrezione di dopamina e il dosaggio trapianto sono tenuti a caratterizzare completamente le cellule differenziate. Generazione robusti DA neuroni funzionali in modo efficiente è un requisito essenziale se la terapia cellulare per la malattia di Parkinson è quello di diventare una realtà. La nostra piattaforma 3D, come proposto di co-coltura con cellule che inducono DA neurali, PA6 cellule e ad alta densità sistema di coltura cellulare di hESC DA neuronale differenziata mediante incapsulamento è uno sforzo verso quella direzione.