Intravitale Microscopie van de milt: Kwantitatieve Analyse van Parasite Mobiliteit en Blood Flow

Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gemeld bij ^7.

1. Animal infectie met groen fluorescerend eiwit (GFP) transgene parasieten

1. P. yoelii-GFP transgene lijnen van 17XL en 17x werden gegenereerd met behulp van dezelfde vectoren, gericht op de strategie en protocollen beschreven elders P. berghei ^8. Ze drukken de mutant 3 variant van GFP ⁹ onder de alomtegenwoordige promotor van P. berghei rek factor 1 (Pbeef1a), die constitutieve expressie van GFP leidt naar cytosol parasiet gedurende de gehele intra-erytrocytaire ontwikkeling cyclus.
2. Injecteren dieren intraperitoneaal met geparasiteerd rode bloedcellen (pRBCs) van P. yoelii-GFP transgene lijnen 17XL en 17x verkregen uit de staart bloed van de donor muizen op 5-10% parasitemie en verdund in PBS. Gebruik een dosis van 5x10 ⁵ pRBCs / muis om een perifere parasitemie van 1% te bereiken op dag 3 post-infectiop (pi).
3. Op dag 3 pi, controleer dan parasitemie van muizen geïnfecteerd met beide parasiet lijnen hetzelfde is door het doen van een bloeduitstrijkje met een daling van de staart van het bloed, gevolgd door Giemsa kleuring en observatie onder een lichtmicroscoop met een 100x olie doelstelling. Parasitemie wordt geschat door de berekening van het percentage van de pRBCs over het totale RBC's in drie optische gebied van ongeveer 300 RBC.
4. Controle dieren ingespoten met FITC-gelabelde rode bloedcellen kan worden gebruikt om de beweging van deze cellen te karakteriseren in normale milten.

2. Etikettering van de rode bloedcellen met FITC en injectie van dieren controle

1. Verzamel 1 ml van het totaal bloed door het hart het doorprikken van een Balb / c muis in 200 ui PBS met ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA) (100 g / L, pH 7,4) en was de RBC pellet in PBS / EDTA (0,1 g / L, pH 7,4) door middel van centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten (min) bij kamertemperatuur (RT).
2. Resuspendeer 200 ul van de RBC pellet in 300 μ l PBS / EDTA (0,1 g / L, pH 8) met FITC (10 g / L) en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker onder zacht schudden. Na die tijd is het supernatant verwijderd en de cellen vijf keer gewassen (300 xg, 5 min, RT) in PBS / EDTA (0,1 g / L, pH 7,4).
3. Voor in vivo experimenten, Verdun 10 ul van de FITC-gelabelde RBC pellet in 200 ui PBS en intraveneus injecteren om een ​​Balb / c muis om 1% FITC-RBC bereiken in omloop.

3. Chirurgische procedures

1. Bereid injecteerbare verdoving bestaat uit 100 mg / kg ketamine en 5 mg / kg Midazolam per dosis volgens het gewicht van het dier. Injecteer de muis intraperitoneaal met een dosis van de verdoving. Readminister de helft van de dosis om de 30 min te onderhouden met de muis full-time verdoofd.
2. Houd de muis warm en controleer of de muis is volledig verdoofd (meestal na 50 tot 20 min) door knijpen de voet pad voordat u verder gaat.
3. Om tevergemakkelijken intraveneuze toediening van stoffen die in de loop van het experiment, canule de staartader van de muis met behulp van een 27G canule. Controleer of de naald goed gepositioneerd is in de ader door het injecteren van 20 tot 50 pi zoutoplossing buffer en sluit deze met tape. Als het belemmert, stroomopwaarts herhaal de canulatie van de ader. Wees voorzichtig om niet te introduceren luchtbellen.
4. Expose het onderste deel van de milt via een kleine incisie in de huid en spieren aan de linker dorsale zijde van het dier. Plaats de milt waar minder adem beweging wordt waargenomen en toe te passen PBS aan de oppervlakte blootgesteld aan het schoon houden van de muis haar en gehydrateerd.
5. Seal een cover-slip van 60x24mm met cyanoacrylaat lijm (Super Glue-3 Loctite) om de huid rond de milt visualisatie mogelijk te maken.

4. Beeldvorming van het leven parasieten in de milt

1. Intravitale microscopie experimenten werden uitgevoerd in een Leica TCS-SP5 confocale microscoop (LeicaMicrosystemen, Heidelberg, Duitsland), uitgerust met een incubatie-systeem met temperatuurregeling, een APO 63x glycerol immersie objectief lens (NA 1.3), resonantie scanner op 8000 lijnen / s en een Argon (488 nm) en HeNe (594 nm, 633 nm) lasers. Extra lasers, zoals de blauwe diode (405 nm) en diode-pomp-solid-state (561 nm), kunnen nodig zijn voor excitatie van sondes vermeld in tabel 1.
2. Leg het dier op het podium van de microscoop met de cover-milt gleed naar beneden aan de doelstelling. Een algemeen beeld van de microcirculatie structuur van de milt kan optioneel worden gevisualiseerd met behulp van een 20x doelstelling. RBC reflectie contrast zal nuttig zijn om verschillende regio's van belang te selecteren om de afbeelding bij hogere vergroting achteraf.
3. Focus van de geselecteerde regio's van belang met 63x glycerol immersie objectief met behulp van weefsel autofluorescentie. GFP parasieten in acht worden genomen die door verschillende gebieden van de milt.
4. Fluorescentie is opgenomen op twee verschillende channels (excitatie / emissie golflengte 488/505-580 nm voor FITC / GFP en 488/570-630 nm voor weefsel autofluorescentie) met de pinhole ingesteld op 3,0 Airy-eenheden. RBC reflectie (488/480-495 nm), samen met fluorescente kleurstoffen om het bloed te vasculatuur (zie tabel 1) label, worden gebruikt om aanvullende informatie over de zone in beeld wordt gebracht en in de bloedstroom hieronder beschreven experimenten te verkrijgen.
5. Maak foto's door middel van vijf Z-stacks die een diepte van 8 micrometer vanwege de drie-dimensionaliteit van het orgel, met een snelheid van 8 kHz tot video's van 1,5 min te genereren.
6. Video's opnemen van de verschillende zones van de milt voor kwantitatieve analyse.

5. Intravitale microscopie van de microvasculatuur van de milt en het imago acquisitie voor de bloedstroom meten

1. Vital fluorescerende probes opgelost in een isotone zoutoplossing kan worden geïnjecteerd om de staart ader tijdens het experiment het imago van de bloedvaten en krijgen inzicht in de structuur van de milt. Een lijstvan sondes en hun toepassing wordt weergegeven in tabel 1 ^10.
2. Om het etiket van het vasculaire systeem met fluorescerende dextran, voor te bereiden 1 mg van 70 kDa dextran met Texas Red gelabelde in 100 pi zoutoplossing buffer.
3. Gebruik de gecanuleerde staartader aan de TL-dextran injecteren om het dier in beeld wordt gebracht.
4. Horizontaal stellen de schepen, in de richting van laser scanning, optische veld rotatie (niet van invloed zijn snelheid). Gebruik xy en xt lijn scanmodi in het centrale lumen van het vat. Gebruik bidirectionele scannen met een lijn gemiddeld 32 met een snelheid van 8 kHz tot een beeld van 512x512 pixels te verkrijgen.
5. Acquire beelden van schepen op drie verschillende kanalen (excitatie / emissie golflengte 488/505-580 nm, 594/605-660 nm, 488/480-495 nm voor FITC / GFP, dextran-Texas Red en rode reflectie, respectievelijk).
6. Foto's maken van schepen met verschillende diameters en over de verschillende fasen van de hartcyclus om te compenseren voor schommelingen. In deze beelden zullen de strepen als gevolg van bewegende cellen die worden gebruikt om de bloedstroom ¹¹ kwantificeren.

6. Beeldverwerking en kwantitatieve analyse van de parasiet de mobiliteit met behulp van software ImageJ

1. Maak een real-time video van de reeks beelden gegenereerd met ImageJ software (versie 1.39o, Wayne Rasband, NIH, www.macbiophotonics.ca ).
2. Open het ". Lif" bestand in ImageJ houden "xyzct" volgorde en gescheiden kanalen.
3. Registreer nuttige informatie uit de metadata file: dblvoxelX-voxel-width, dblvoxelY-voxel-hoogte, dblvoxelZ-voxel-diepte-en frame-interval tussen opeenvolgende Z-frames en tussen de stapels. Deze informatie zal worden gebruikt voor de kalibratie.
4. Trek autofluorescentie (kanaal 2) aan de GFP-parasiet beelden (kanaal 1). Filter de beelden met Gaussiaans vervagen = 1. Gelieve te herinneren dat het gebruik van filter Gaussiaans vervagen in beelden dient te worden aangegeven voor PUBLICATIEns. Bestand opslaan "animal1_m1_substract.seq".
5. Een Z-gecodeerde kleur video is gemaakt als ondersteunend materiaal voor de kwantitatieve analyse van de parasiet mobiliteit, omdat het single-deeltje identificatie te vergemakkelijken in de snel bewegende deeltjes en Z-beweging karakterisering.
6. Zet de stack naar Afbeelding 5D, met de derde dimensie worden de Z en de vierde dimensie wordt de tijd. Geef een andere kleur aan elke Z en overlay.
7. Het project al de Z met maximale intensiteit over alle termijnen om een ​​Z-gecodeerde kleur video te maken. Opslaan als "animal1_m1_Z_color.avi".
8. Delen en te etiketteren van alle deeltjes die in de eerste 10 keer frames van de video lijkt op basis van het aantal frames van de woonplaats (van 1 tot 10). In elke video, zal 20 deeltjes worden gevolgd na de verkregen proporties. In totaal zullen 120 parasieten worden gekwantificeerd uit 3 dieren, met behulp van zes video's / dieren die verschillende zones van de milt.
9. Het verslag van de frames van de woonplaats op elke Zen over de gehele film voor alle deeltjes te worden gekwantificeerd.
10. Voer 4D (x, y, z, t) handmatig bijhouden van deeltjes met behulp van de MTrackJ plugin (geschreven door E. Meijering). Open het bestand "animal1_m1_substract.seq" als afbeelding 5D en stel beeld eigenschappen met behulp van de gegevens geregistreerd voor van pixel breedte, hoogte, diepte (in pm) en stapel interval (in seconden). Configureer de instellingen voor als volgt: "verplaatsen naar de volgende keer" en "toe te passen lokale cursor-bright centroid/25x25pixel". Configure weergave van: "show oorsprong", "show image", "show actieve track", "Toon alleen sporen aanwezig zijn in de huidige kanalen", "show alleen maar weg wijzen op de huidige tijd".
11. Voeg een track voor elk deeltje. Denk beweging in Z-as alleen als verplaatsing is hoger is dan 6 micrometer (gemiddelde diameter voor een pRBC). Volg het deeltje over een maximum van 100 frames.
12. Sla de x, y, z en t-coördinaten gemeten vanaf de track als "animal1_m1_p1 '. Xls.
13. Maatregelen voor de verplaatsing (D = SQRT ((x _finale-X _inital) ² + (y-y _{finale inital)} ² + (z _{finale-z inital)} ^2); weglengte (P = Σ _{n = 0 → finale} SQRT ((x _{n +1-x n)} ² + ( y _{n +1-y n)} ² + (z _{n +1-z n)} ²⁾ met n waarbij zij voor elke positie gevolgd, gemiddelde snelheid en het verblijf tijd kan worden berekend met behulp van de waarden van x, y, z, t coördinaten gevolgd gekalibreerd op basis van de geregistreerde gegevens. directionaliteit van de deeltjes wordt gedefinieerd als het quotiënt van de verplaatsing versus weglengte met waarden van bijna 1, waarin gerichte beweging en waarden van bijna 0 aangeeft ingetogen beweging ^12. Een sjabloon voor de berekeningen wordt vergemakkelijkt ingesloten.

7. Berekening van de volumestroom doorbloeding

1. Volumetrische bloedstroom wordt geschat op Q = V * π * D _v ² / 4, met V, erythrocyt snelheid over de doorsnede eennd D _v, lumen vat diameter ^11.
2. Voor het berekenen van V, het meten van de hoeken (θ) van vijf deeltjes strepen met heldere reflectie (RBC) en vier deeltjes strepen met groene fluorescentie (pRBC-GFP) in elk xt afbeelding met behulp van ImageJ software. Meet lumen schip diameter op de xy beeld.
3. De snelheid wordt dan uitgedrukt als V = 1/tan (θ) * D _e / _v D te normaliseren voor de rode bloedlichaampjes (D _e = 6 pm) en lumen schip diameters.
4. Kwantificeren een minimum van drie schepen met verschillende diameters en vijf xt beelden voor elk schip.

8. Statistische analyse

1. Voor statistische analyse, plot gerichtheid, gemiddelde snelheid en de verblijftijd, dichtheid distributies en gebruik maken van de gelijkheid-van-medianen test in STATA (IC10) om de verschillen tussen de twee parasiet lijnen te beoordelen.

9. Representatieve resultaten

Intravitale imaGing van de GFP parasieten in de milt bleek verschillen in mobiliteit tussen de twee stammen van parasieten. Kwantitatieve analyse van de mobiliteit parameters van enkele parasieten aangegeven verminderde snelheid, gebrek aan richting en aangevuld verblijftijd van parasieten van muizen geïnfecteerd met 17x stam. Bovendien werd volumetrische bloedstroom in schepen niet veranderd tussen de stammen ^7. De technische procedure is weergegeven in figuur 1A. Figuur 1B toont een algemeen beeld van een normale milt van een muis geïnjecteerd met FITC-gelabelde rode bloedcellen, met een zoom in naar de rode pulp en een ander om een ​​schip (Figuur 1B, zoom in 1 en 2, respectievelijk). Vasculatuur werd bewezen door het injecteren van 70 kDa dextran-Texas Red, samen met erythrocyt reflectie contrast. Andere fluorescerende kleurstoffen samengevat in tabel 1 kan worden gebruikt om informatie over het orgel in beeld wordt gebracht, zoals Hoechst (figuur 1C, 1D) te krijgen.

Real-time beeldvorming van parasieten van de 17XL en de 17x-stam is gepresenteerd in Movies 1 en 2,met een aantal 17x-pRBC (Movie 2) met een rollende-cirkel gedrag. Kwantitatieve analyse van de mobiliteit parameters werd bereikt door het volgen van de individuele parasieten met behulp van de Z-gecodeerde kleurenafbeeldingen. Figuur 2A toont een Z-projectie van een Z-gecodeerde kleur stack, waar het omringd deeltje verschijnt bewegen in verschillende vlakken. Figuur 2B en 2C vertegenwoordigen de tracks voor verschillende parasieten in de 17x en 17XL infectie, respectievelijk. Resultaten van richting en verblijftijd van alle gekwantificeerde de deeltjes zijn gepresenteerd als een dichtheid verdeling kaart van parasiet bevolking in figuur 2D en 2E, respectievelijk. Voor het bewaken van de bloedstroom in de milt met behulp van microscopie intravitale werden de strepen verkregen in xt beelden van de centrale lumen van schepen als gevolg van de erytrocyten beweging gemeten snelheid ¹¹ berekenen. De beelden tonen een xy scan van een schip (figuur 2F) met de bijbehorende xt line scan (figuur 2G).

Tabel 1. Fluorescerende probes voor intravitale microscopie. Vital fluorescente kleurstoffen met verschillende lokalisaties die kunnen worden gebruikt om de milt in vivo label. Bekrachtiging / emissie (Exc / em) varieert voor gebruik met een-foton (of twee-foton microscopie) zijn voorzien. De aangegeven dosering is opgelost in 0,1-0,2 ml zoutoplossing buffer en geïnjecteerd om de staartader van de muis. [Nd: niet bepaald in deze studie.

Figuur 1. Intravitale microscopie van de milt. A. Leica TCS-SP5 confocale microscoop met een muis die op het podium van de microscoop. De muis heeft het onderste deel van de milt blootgesteld en afgesloten met een cover-slip. B. Afbeelding van een representatief deel van de milt van een niet-geïnfecteerde dieren ingespoten met FITC-gelabelde rode bloedcellen en70 kDa dextran-Texas Red aan het vaatstelsel te visualiseren. Reflectie (geel), zijn dextran (blauw) en FITC-RBC (groen) weergegeven. Blow-ups in witte dozen vertegenwoordigen open-circulatie (1) en close-circulatie (2) gebieden. Open-circulatie (C) en close-circulatie (D) gekleurd met 70 kDa dextran (rood) en Hoechst 33342 (blauw).

Figuur 2. Kwantificering van parasiet de mobiliteit en de bloedstroom. AC. Kwantitatieve analyse van deeltjes beweging in de vier dimensies (4D) wordt vergemakkelijkt door het gebruik van kleur-gecodeerde beeldverwerking. A. Tracking werd uitgevoerd met de diepte-informatie van de Z-gecodeerde kleurenfoto's, weergegeven met behulp van maximale intensiteit projectie van vijf verschillende dieptes. Witte rechthoek geeft het hetzelfde deeltje op verschillende Z in een keer punt. Verschillende posities zijn het gevolg van de tijd verstrijkt tussen de verkrijgingsprijsvan verschillende Z-beelden. Diepte-code:. Geel (0 um), oranje (2 micrometer), roze (4 pm), blauw (6 micrometer), groen (8 micrometer) B, C. Tijd projecties van deeltje beweging met elk tijdsinterval kleur als: grijs (0-2,4 sec), cyaan (2.4-4.8 sec), magenta (4.8-7.0 sec), rood (7.0 tot 9.4 sec) en geel (9,4-11,8 sec). Witte lijn stelt 4D handmatig bijhouden van de deeltjes van 17x (11,8 s) (B) en 17XL (4,8 sec) (C) met behulp van GFP parasieten MTrackJ. D, E. Verdeling van de dichtheid van GFP deeltjes door de waarden van gerichtheid (D) en verblijftijd (E). Gegevens komen overeen met 120 deeltjes van elke regel van parasieten en 100 FITC-gelabelde rode bloedcellen van drie onafhankelijke experimenten geanalyseerd met de gelijkheid-van-medianen test. De 17X/17XL/FITC-RBCs medianen zijn 0.53/0.75/0.85 (D) en 4.61/0.67/0.9 sec (E). Verschillen tussen de twee lijnen in Rong> (D) en (E) zijn statistisch significant (p <0,001). Verschillen tussen FITC-gelabelde rode bloedcellen en 17XL parasieten zijn niet statistisch significant (P> 0,05). F, G. Milt bloedstroom metingen. Vertegenwoordiging van xy beeld (F) en xt image (G) van een line-scan van de centrale lumen van hetzelfde schip (witte lijn). Spleen schip met plasma met 70 kDa dextran (rood), pRBC (groen) en erytrocyten reflectie (blauw).

Films 1 en 2. Time-lapse intravitale microscopie beelden van de muizen milt geïnfecteerd met 17XL (1) of 17x (2) GFP-transgene parasieten op 10% parasitemie (Z-maximale projectie). Parasiet en weefsel autofluorescentie worden getoond in groen en rood respectievelijk. Schaal staven geven 10 urn en het tijdsinterval is in sec.
v "> Klik hier om een ​​film te kijken.
Klik hier om Movie 2 kijken.

De implementatie van intravitale microscopie van de milt in dit knaagdier malaria model opende de mogelijkheid van onderzoek naar de dynamische passage van parasieten door dit orgaan dat tot op heden beschouwd als een "black-box" te wijten aan technische overwegingen. Hier werd een grote inspanning te maken aan een kwantitatieve methode die vergelijkende analyse van verschillende parasieten lijnen op de single en de bevolking niveaus mogelijk aan te passen. In tegenstelling tot andere weefsels en cellen die eerder was afgebeeld in malaria ^3,5, beeldvorming van de passage van pRBCs door de milt moet rekening houden met de drie-dimensionaliteit en compartimentering van het orgel, de aanwezigheid van verschillende oplages met snelle en langzame flux ^13, evenals de snelle erytrocyten snelheden. Met dit doel werd een specifieke methodologie met behulp van online beschikbaar ImageJ software ontwikkeld om een ​​parasiet tracking, mobiliteit analyse en vergelijking tussen lijnen op de populatio mogelijkn niveau. Echter, de toepassing van automatische software die identificatie en het volgen van enkele parasieten in deze context lost nog steeds nodig. Van de nota zijn de parameters die gebruikt worden om de mobiliteit te beschrijven parasiet al eerder beschreven in andere studies om lymfocyten werving en de hechting in vivo ^12,14,15 rapport. Daarom moet deze methodologie en parameters worden beschouwd als een nieuw instrument om de in vivo studies van de therapietrouw in malaria. In de toekomst zullen we gebruiken deze technologie om inzicht te krijgen in de Immunobiologie en parasieten-milt cellen interacties met imaging infectie in transgene muizen die fluorescerende reporter genen in verschillende cellen. Bovendien kan het genereren van transgene parasieten te drukken fluorescerende markers andere dan GLM worden gebruikt in combinatie om de afbeelding dual infecties in dit model.

In vivo beeldvorming is een krachtig hulpmiddel om de dynamische wisselwerking van parasieten studie binnen hun gastheren. Echter, er exist een aantal factoren die van invloed cel mobiliteit die moeten worden gehouden. Veranderingen in het weefsel architectuur in reactie op infectie met verschillende Plasmodium-stammen kunnen cel-passage en interactie te wijzigen met het weefsel ^7,16 en de rheologische eigenschappen van rode bloedcellen, evenals veranderingen in de hematocriet-of andere hematologische parameters, kan invloed hebben op de doorbloeding en dus ook de interactie van cellen met het weefsel. Om deze reden adviseren wij schip de bloedstroom te analyseren met de bijgeleverde procedure. Om te voorkomen dat eventuele verstorende effecten, we afgebeeld de milt van geïnfecteerde muizen op een tijdstip wanneer hematocriet, reticulocytemia en parasiet tropisme is vergelijkbaar in beide infecties ^7.

De resolutie van deze techniek maakt het mogelijk voor de observatie van een fluorescerende cellen die door de milt op vroegere tijdstippen (<1% parasitemie). Er werd echter kwantitatieve analyse van het dynamisch gedrag van parasieten uitgevoerdop 1% parasitemie, waren toen voldoende aantallen pRBCs waargenomen dat door de milt op het moment vervalt die het mogelijk maken het volgen van enkele cel beweging. In films 1 en 2, die overeenstemmen met de dieren op 10% parasitemie toonden we aan het algemene patroon van de parasiet passage door de milt in elke infectie, maar kwantitatieve analyse van het verplaatsen van cellen werd uitgevoerd in films van dieren op 1% parasitemie, waar enkele cellen zijn gemakkelijk te volgen. Door de snelle drie-dimensionale beweging van geïnfecteerde rode bloedcellen, konden we geen onderscheid maken tussen ontwikkelingsstadia van de parasiet, als verschillende fluorescentie-intensiteiten kon worden toegeschreven aan verschillende dieptes of doordringbaarheid van de laser.

Met deze procedure kan fluorescerende cellen worden gevisualiseerd in de subcapsulaire zone van de milt, hoofdzakelijk samengesteld uit rode pulp ^17. Door het gebruik van plasma kleurstoffen, kunnen we onderscheid maken tussen de snelle / gesloten en slow / open circulaties van de rode pulp. Andere studieshebben gemeld beeldvorming van fluorescerende T-cellen in het witte vruchtvlees met behulp van confocale ¹⁸ of twee-foton microscopie ^19, de laatste met een grotere penetratie. In die, off-line analyse en ex vivo karakterisering van de zone in beeld wordt gebracht is een belangrijke factor om accuraat te interpreteren de gegevens. Dus, inspanningen om de microcirculatie structuur van de milt, evenals de ontwikkeling van probes die specifieke cellen en structuren label verlichten, zijn van belang voor de studie van de parasiet-gastheer interacties te vergemakkelijken.