Costruire un idrogel collagene per la fornitura di Stem Cell-loaded Chitosan Microsfere

1. Isolanti derivate da tessuto adiposo cellule staminali (ASC)

Nota: Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.

1. Isolare adiposo perirenale e epididimale di ratto e lavare con soluzione salina sterile tamponata di Hank (HBSS) contenente 1% siero bovino fetale (FBS) come descritto in precedenza ^6.
2. Tritare il tessuto e trasferire 1-2 g in 25 ml di HBSS contenente 1% FBS in una provetta da 50 ml e centrifugare a 500 g per 8 minuti a temperatura ambiente.
3. Raccogliere il fluttuante strato di tessuto adiposo e trasferimento pallone Erlenmeyer da 125 ml e trattare con 25 ml di collagenasi di tipo II (200 U / mL) in HBSS per 45 min a 37 ° C in un agitatore orbitale (125 rpm).
4. Cautela rimuovere la frazione liquida (sotto olio e strato adiposo) e filtrare sequenzialmente attraverso un filtro di nylon da 100 um e 70 um-maglia. Centrifugare il filtrato a 500 g per 10 min a temperatura ambiente, aspirare il supernatant e lavare il pellet due volte con 25 ml di HBSS.
5. Risospendere il pellet di cellule in 50 mL di mezzo di crescita (RS MesenPRO medio basale) supplementato con supplemento MesenPRO crescita RS, antibiotico-antimicotico (100 U / mL di penicillina G, 100 pg / mL di streptomicina solfato, e 0,25 mg / ml di anfotericina B) , e 2 mM L-glutammina e cellule pipettare in fiasche T75 2 (25 ml / beuta).
6. La cultura il ASC in un 5% CO ₂ incubatore umidificato a 37 ° C (Passaggio 2-4 sono utilizzati ASC per tutti gli esperimenti).

2. Preparazione Chitosan Microsfere (CSM)

Nota: Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.

1. CSM sono preparate da un acqua-in-olio processo di emulsionamento con una tecnica coacervazione ionico usando la nostra precedente protocollo ^6. Emulsionare una soluzione acquosa di chitosano (6 mL del 3% w / v chitosano in 0,5 M acido acetico) in 100 ml di una miscela costituita fase olio di soiaolio, n-ottanolo (1:2 v / v) e il 5% sorbitan-monooleato (Span 80) emulsionante, usando testa (1700 rpm) e agitazione magnetica (1000 rpm) simultaneamente, in direzioni opposte. Questo metodo di duplice assicura la miscelazione che micelle formate presto prima reticolazione avviene può rimanere in soluzione e non si depositano sul fondo. Inoltre, l'agitazione magnetica bar aiuti in de-aggregazione chitosano durante la formazione delle micelle e rigidization.
2. La miscela viene mantenuta sotto agitazione per circa 1 ora fino uno stabile acqua-in-olio è ottenuto. Reticolazione ionica è iniziata con l'aggiunta di 1,5 ml di 1% w / v di idrossido di potassio in n-ottanolo ogni 15 min per 4 h (24 mL totale).
3. Dopo completamento della reazione di reticolazione, lentamente decantare la fase olio della miscela contenente CSM e aggiungere immediatamente le sfere a 100 mL di acetone. Lavare le sfere con acetone finché la fase olio viene completamente rimosso.
4. Asciugare le sfere recuperate in un essiccatore a vuoto e analeyze senza ulteriori elaborazioni. La dimensione media delle particelle CSM, superficie per milligrammo e l'unità di volume cubico è stata determinata utilizzando dimensione analizzatore di particelle.
5. Per gli esperimenti successivi, lavare CSM tre volte con acqua sterile per eliminare i sali residui e sterilizzare con alcool assoluto.

3. Determinazione del numero di gruppi amminici liberi in CSM

Nota: Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.

1. Determinare il numero di gruppi amminici liberi presenti nel CSM dopo la reticolazione ionica utilizzando il trinitro benzensolfonico (TNBS) dosaggio di acido Bubins e Ofner ^7. Incubare 5 mg di microsfere con 1 mL di soluzione 0,5% TNBS in una provetta di vetro da 50 ml per 4 ore a 40 ° C e idrolizzare con l'aggiunta di 3 ml di HCl 6N a 60 ° C per 2h.
2. Raffreddare i campioni a temperatura ambiente, ed estrarre i TNBS libere aggiungendo 5 ml di acqua deionizzata e 10 ml di etiletere.
3. Riscaldare Un'aliquota di 5 ml della fase acquosa a 40 ° C a bagnomaria per 15 minuti per evaporare qualsiasi etere residuo, raffreddare a temperatura ambiente, e diluire con 15 ml di acqua.
4. Misurare l'assorbanza a 345 nm con uno spettrofotometro con TNBS senza soluzione chitosano come vuoto e il chitosano utilizzata per la preparazione CSM per determinare il numero totale di gruppi amminici. Stimare il numero di gruppi amminici liberi del CSM rispetto al chitosano.

4. Caricamento in ASC CSM

Nota: Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.

1. Equilibrare 5 mg di CSM sterilizzato dalla sezione 2.5 in HBSS sterili durante la notte e aggiungere ad un inserto di 8 micron dimensione dei pori della membrana piastra di cultura (24 pozzetti).
2. Dopo aver risolto il CSM sulla membrana, aspirare accuratamente le HBSS e aggiungere 300 ml di terreno di crescita all'interno dell'inserto e 700 microlitri di terreni di crescita per the fuori dell'inserto.
3. Risospendere ASC alla concentrazione adeguata (1 x 10 ⁴ a 4 x 10 ⁴⁾ in 200 pl di mezzo di crescita e seme sulla CSM all'interno dell'inserto piastra di coltura. Il volume finale del mezzo all'interno dell'inserto coltura, dopo la semina, è 500 pl.
4. Incubare la testa di serie ASC sul CSM per 24 ore in un 5% di CO ₂ incubatore umidificato a 37 ° C.

5. Determinazione della percentuale di caricamento ASC e la vitalità cellulare in CSM

Nota: Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.

1. Dopo l'incubazione, raccogliere le ASC-caricato CSM in un contenitore sterile da 1,5 ml provetta senza disturbare le cellule che sono migrate nella membrana di inserimento.
2. Rimuovere il mezzo residuo e aggiungere 250 microlitri di terreno di crescita fresco al tubo.
3. Per aggiungere ciascun tubo 25 pl MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro]soluzione di (5 mg / mL) e incubare per 4 h in un 5% CO ₂ incubatore umidificato a 37 ° C.
4. Dopo l'incubazione, rimuovere il supporto, si aggiungano 250 microlitri di dimetilsolfossido e miscelare l'impasto per 2-5 min per solubilizzare il complesso formazan.
5. Centrifugare il CSM a 2700 g per 5 min, e determinare l'assorbanza supernatante misurata a 570 nm usando 630 nm come riferimento.
6. Determinare il numero di cella associato con il CSM rispetto al valore di assorbanza ottenuto da un numero noto di vitale ASC.

6. Caratterizzare ASC-CSM-Embedded Collagen Gel

Nota: Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato.

1. Mix ASC-caricato CSM (5 mg contenente ≈ 2 x 10 ⁴ cellule) con collagene di tipo 1 (7,5 mg / mL) estratto da tendine coda di ratto secondo il metodo di Bornstein ⁸ e fibrillano dopo aver regolato il pH a 6,8 con NaOH 2 N. Aggiungere il fibrillato collagene-ASC-CSM miscela a 12-pozzetti e incubare per 30 min in un 5% CO ₂ incubatore umidificato a 37 ° C.
2. Dopo completa fibrillazione, incubare le collagene-ASC-CSM gel fino a 14 giorni in un 5% CO ₂ incubatore umidificato a 37 ° C.
3. Rilascio e migrazione di cellule dal CSM nel gel sono state osservate usando tecniche di microscopia standard.

7. Risultati rappresentativi

In questo studio, abbiamo sviluppato una strategia in vitro per fornire cellule staminali da microsfere di chitosano (CSM) in un scaffold di collagene gel. CSM poroso di dimensioni uniformi (175-225 micron di diametro) e la composizione sono stati preparati e utilizzati come vettori cellulare (Figura 2). Dopo incubazione con il ASC CSM, le cellule attaccate ad una concentrazione di 2 x 10 ⁴ cells/5mg di CSM. Le cellule erano in grado di diffondere sul microsfere, mentre si estende filopodianelle fessure porose della microsfera (Figura 3). Quando la cellula-caricato CSM sono stati miscelati con il gel di collagene, le cellule immediatamente cominciarono a migrare nei gel (Figura 4).

Tabella 1. Vantaggi biologici per l'uso di chitosano e collagene in un sistema di erogazione di cellule staminali.

Figura 1. Schema raffigurante la strategia globale per il doppio uso di ASC-CSM scaffold di collagene caricati. Figure 2, 3 e 4 sono annotati entro lo schema di assistere con l'interpretazione delle immagini.

Figura 2. Rappresentazione schematica raffigurante il processo di seminare cellule staminali su microsfere di chitosano. Il process comporta co-coltura con ASC CSM in un 8 - micron dimensione dei pori della membrana inserto cultura piatto. Dopo 24 ore, le microsfere vengono rimossi dal dell'inserto e sono pronti per l'incorporamento in una matrice biomateriale.

Figura 3. Caratterizzazione morfologica dei CSM-caricato con ASC. Pannello A raffigura una micrografia luce di ASC-caricato CSM, mentre il pannello B mostra lo stesso campo di vista con sovrapposta un'immagine ottenuta mediante microscopia confocale a fluorescenza. ASC sono stati precaricato con calceina AM (verde). Pannello C illustra un'immagine di un'immagine SEM di una microsfera scarico, mentre il pannello D mostra cellule caricati sul microsfera (asterischi). L'immagine TEM in E pannello mostra una sezione trasversale di una microsfera scarico. Una moltitudine di pori e fessure si trovano in tutta la microsfera. Pannello F mostra una sezionata microsfere con cellule (frecce) collegato e si estende filopodia nella creazionevizi. Ingrandimenti originali: A & B = 70X; C = 500x, D = 2.000 x; E & F = 2.500 x.

Figura 4. Migrazione del ASC dal CSM nel tridimensionale collagene scaffold. Pannelli A e B raffigurano il CSM, con cellule che migrano lontano da microsfere e nella matrice di collagene il giorno 3 (A, frecce). Panel B mostra una cultura simile dopo 12 giorni. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) le immagini sono raffigurati in C, D, E. e asterischi in C e D mostrano una microsfera che è stata sezionata con cellule abbandonando la microsfera (frecce). Ingrandimento superiore del pannello D è rappresentato nella E pannello, e mostra filopodia cella attaccati alle fibrille di collagene (inserto). Ingrandimento originale: A & B = 100x, C & D = 6.000 x, x E = 20.000, incasso 150.000 = x.

Figura 5.Schematico che illustra gli usi vaste CSM nella medicina rigenerativa e la consegna della droga.

Uno degli ostacoli principali delle cellule staminali in terapia a base di sta sviluppando metodi efficienti per la consegna delle cellule alle regioni determinate per la riparazione. Grazie al paziente a paziente variabilità, il tipo di tessuto, dimensioni e profondità lesione, la metodologia di cellule staminali che forniscono devono essere determinati caso per caso. Anche se l'incorporamento cellule staminali all'interno di una matrice e di consegnarli al sito della ferita sembra essere un approccio logico successivo per l'ingegneria tissutale, alcuni avanzamenti scientifici e tecnici. Ciò include la capacità delle cellule incorporati per collegare alla matrice biocompatibile e fornire un ambiente in cui le cellule possono attaccare, proliferare e ristabilire un microambiente adatto prima anoikis ^9-10. Questo processo richiede le celle di upregulate loro macchine rimodellamento della matrice, un processo che può richiedere giorni prima di compiere i processi cellulari desiderati di proliferazione, migrazione e differenziazione delle cellule staminali. Per aggirare questi problemi, ci have sviluppato un metodo per le cellule staminali precarico su microsfere di chitosano prima di incorporarli in una matrice appropriata per la riparazione del tessuto danneggiato. Utilizzando il cross-linking unico ionico metodi per preparare le microsfere, il protocollo è in grado di preparare> 90% delle microsfere per essere entro 175-225 micron di diametro, generando così un eccellente micro-dimensioni carrier per le cellule. Ancora più importante, dopo reticolazione, le microsfere rimangono carica positiva, che è altamente favorevole per l'adesione delle cellule. Queste caratteristiche microsfere consentono alle cellule staminali per allegare rapidamente sul CSM. Una volta collegato, queste cellule staminali caricato microsfere sono stabili e in grado di raggiungere disposizioni spaziali all'interno del ponteggio, come idrogel collagene, per imitare il tessuto lesionato. In sintesi, questo protocollo fornisce un nuovo metodo per caricare ASC sul CSM e dimostra che le cellule su microsfere in grado di migrare pur preservandone la fenotipo delle cellule staminali. Il CSM poroso descritto fornire unmicroambiente eccellente per ASC fissaggio e ancora permettere alle cellule di migrare nella matrice circostante.

Sommario:

Passaggi critici

• Utilizzare uniformemente dimensionati microsfere dal variazione del diametro influenza direttamente superficie disponibile per l'adesione delle cellule per milligrammo di microsfere.
• Preparare un letto uniforme di microsfere all'interno dell'inserto cultura ottimale attacco uniforme delle cellule al CSM.
• Assicurarsi che il volume di mezzi aggiunto al pozzetto esterna dell'inserto coltura cellulare è superiore al menisco interno del bene. Tipicamente, uno interno: esterno rapporto in volume di 1:2 è appropriato, ciò facilita le cellule fissaggio al microsfere.
• Distribuire la cella microsfere caricate in modo uniforme all'interno del patibolo. Se la distribuzione di ASC-CSM è troppo denso, le cellule non migrano dalla loro microsfere.
• La quantità desiderata di CSM e di distribuzionebuto densità dipende l'applicazione e l'area tessuto danneggiato.

Limitazioni

• Questo metodo è limitata alla superficie totale disponibile sul microsfere. Se un numero elevato cella è desiderata, più microsfere sono necessarie per aumentare la superficie.
• Il processo consente alle cellule di essere seminate al microsfere preformato e non per scopi di incapsulamento delle cellule.
• Il chitosano microsfere sviluppato in questo processo può supportare ancoraggio-dipendenti cellule ma non altri tipi di cellule.
• Poiché chitosano microsfere sono sviluppate utilizzando una soluzione 0,5 M di acido acetico, emulsionato in una miscela di olio (olio di soia: n-ottanolo) e recuperato mediante solvente organico non consente frazioni attive terapeutiche vulnerabile alla condizione di cui sopra.
• Il CSM sono principalmente destinati a fornire cellule e farmaci a una durata di tempo più breve (5-10 giorni) a causa della sua precoce decadimentorate, a differenza di quelle destinate per la disponibilità di lunga durata.

Eventuali modifiche e versatilità (Figura 5)

• Dimensione microsfere possono essere modificati per alterare la superficie totale. Ad esempio, la dimensione delle microsfere può essere ridotta per aumentare la superficie / mg di CSM, che a sua volta aumenta la superficie totale e il numero di cellule che possono attaccarsi alle microsfere, con un conseguente aumento della cella di carico per microsfere.
• Chitosano microsfere può essere utilizzato come vettore per caricare altri tipi cellulari (cellule endoteliali, periciti, fibroblasti, ecc).
• Cell-caricati sfere (sia singoli tipi-o più celle) può essere integrato all'interno di posizioni specifiche di ponteggi. Questa strategia aiuterà nella costruzione di multicellulari tissutale scaffolds per la rigenerazione dei tessuti.
• Oltre alla consegna cella, microsfere possono anche essere usati per fornire farmaci terapeutici (cioè, fattori di crescita, differenziazione, induttori e / o antibiotici). Questi farmaci caricato microsfere possono anche essere utilizzati in combinazione con cellule caricato microsfere all'interno un'impalcatura per migliorare la guarigione e processi di rigenerazione.

Risoluzione dei problemi

• Dopo la preparazione il CSM, se una variazione di grandi dimensioni si verifica, allora un numero di elementi può essere regolata per ottenere dimensione desiderata CSM ^11.
  • Viscosità della soluzione di chitosano. Azioni preparate al momento è preferito mantenere la soluzione in viscosità costante da lotto a lotto di preparazione
  • Regolare il volume di tensioattivo (span 80) usato per preparare l'emulsione.
  • Garantire la velocità del agitatore rimane costante durante il processo (velocità può variare con cali di tensione
  • Durante l'agitazione aria atmosferica impartisce può causare variazioni turbolenze e dimensioni (ciò può essere evitato keep il ripple liquido, che si forma durante agitazione, appena oltre le lame del agitatore di testa.
• Per garantire la cella di carico ottimale delle microsfere, un saggio MTT calorimetrico può essere eseguita. Questo darà un numero stimato di cellule vitali caricate per milligrammo di microsfere.
• Evitare grumi di cellule caricate microsfere sospendendole in un piccolo volume di terreni di coltura cellulare prima di mescolarli in un esempio un idrogel collagene ponteggio.