De bouw van een Collageen Hydrogel voor de levering van Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

1. Isoleren Adipose-stamcellen (ASC)

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

1. Isoleer rat perirenal en epididymis vet en wassen met een gebufferde zoutoplossing steriele Hank's (HBSS) met 1% foetaal bovine serum (FBS) zoals eerder beschreven ^6.
2. Gehakt het weefsel en breng 1-2 g in 25 ml HBSS met 1% FBS in een 50 ml buis en centrifugeer bij 500 g gedurende 8 min bij kamertemperatuur.
3. Verzamelen de vrij zwevende vetweefsel laag overdracht 125 ml erlenmeyer en 25 ml collagenase type II (200 U / ml) in HBSS gedurende 45 min bij 37 ° C te behandelen op een schudapparaat (125 rpm).
4. Verwijder de vloeibare fractie (onder olie en vetlaag) en zuig achtereenvolgens 100-um en 70-um nylon zeef. Centrifugeer het filtraat bij 500 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zuig de supernatant en tweemaal wassen met 25 ml pellet HBSS.
5. Resuspendeer de celpellet in 50 ml kweekmedium (MesenPRO RS basismedium) aangevuld met MesenPRO RS groeisupplement, antibiotica antimycotische (100 U / ml penicilline G 100 ug / mL streptomycine sulfaat en 0,25 ug / ml amfotericine B) en 2 mM L-glutamine en pipet cellen in 2 T75 kolf (25 ml / kolf).
6. Cultuur de ASC in een _5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C (passage 2-4 ASC worden gebruikt voor alle experimenten).

2. Voorbereiden Chitosan microsferen (CSM)

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

1. CSM worden bereid door een water-in-olie emulsies proces met een ionisch gelering waarbij gebruik onze eerdere protocol ^6. Emulgeren van een waterige oplossing van chitosan (6 ml van 3% w / v chitosan in 0,5 M azijnzuur) in een 100 ml van een oliefase mengsel van sojaolie, n-octanol (1:2 v / v) en 5% sorbitan-mono-oleaat (span 80) emulgator met overhead (1700 rpm) en magnetische roerstaaf (1000 rpm) tegelijkertijd in tegengestelde richting. Deze dubbele mengmethode zorgt ervoor dat micellen vroeg voor verknoping optreedt gevormd kunnen in oplossing blijven en niet naar de bodem. Bovendien is de magnetische roerstaaf helpt bij het de-aggregatie van chitosan tijdens micel vorming en rigidization.
2. Het mengsel wordt constant geroerd gedurende ongeveer 1 uur tot een stabiele water-in-olie emulsie wordt verkregen. Ionische verknoping wordt gestart door de toevoeging van 1,5 ml 1% w / v kaliumhydroxide in n-octanol elke 15 min wordt 4 h (24 ml totaal).
3. Na voltooiing van de verknopingsreactie langzaam bezinken de oliefase van het mengsel dat CSM onmiddellijk de bollen op 100 ml aceton. Was de bollen met aceton tot aan de olie-fase wordt volledig verwijderd.
4. Droog de herstelde bollen in een vacuüm exsiccator en analeyze zonder verdere verwerking. De gemiddelde deeltjesgrootte CSM, oppervlakte milligram en de toestel kubieke volume werd bepaald met deeltjesgrootte-analysator.
5. Voor verdere experimenten was CSM driemaal met steriel water om residueel zouten te verwijderen en absolute alcohol steriliseren.

3. Bepalen van het aantal vrije aminogroepen in CSM

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

1. Bepaal het aantal vrije aminogroepen in CSM na ionische verknoping met de trinitro benzeensulfonzuur (TNBS) zuur assay van Bubins en Ofner ^7. Incubeer 5 mg microsferen met 1 ml 0,5% TNBS oplossing in een 50 ml glazen buis gedurende 4 uur bij 40 ° C en hydrolyseren met de toevoeging van 3 ml 6N HCl bij 60 ° C gedurende 2 uur.
2. Koel de monsters tot kamertemperatuur en extraheren van de vrije TNBS door toevoeging van 5 ml gedeioniseerd water en 10 ml ethylether.
3. Verwarm een ​​5 ml aliquot van de waterfase tot 40 ° C in een waterbad gedurende 15 minuten om eventuele ether, afkoelen tot kamertemperatuur, verdampen en verdund met 15 ml water.
4. Meet de absorptie bij 345 nm met een spectrofotometer TNBS oplossing zonder chitosan als blanco en chitosan voor CSM preparaat in de totale aantal aminogroepen bepalen. Schatting van het aantal vrije aminogroepen van de CSM ten opzichte van chitosan.

4. Laden ASC in CSM

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

1. Equilibreer 5 mg gesteriliseerd CSM uit paragraaf 2.5 in steriele HBSS 's nachts en toe te voegen aan een 8-um poriegrootte membraan cultuur plaat insert (24-wells plaat).
2. Nadat de CSM hebben zich op het membraan voorzichtig zuig de HBSS en voeg 300 ul groeimedium aan de binnenzijde van het inzetstuk en 700 ul van groeimedia met the buitenkant van de insert.
3. Hersuspenderen ASC de juiste concentratie (1 x 10 ⁴ 4 x 10 ⁴⁾ in 200 pi groeimedium en zaad via CSM in de petrischaal inzetstuk. Het eindvolume van medium in de cultuur inzetstuk, na het zaaien, 500 ul.
4. Incubeer de ASC geplaatste CSM gedurende 24 uur in een _5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.

5. Bepalen van het percentage van de ASC laden en levensvatbaarheid van de cellen in CSM

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

1. Na de incubatie, het verzamelen van de ASC-loaded CSM in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis zonder verstoring van de cellen die zijn gemigreerd naar de insert membraan.
2. Verwijder het resterende medium en voeg 250 ul vers groeimedium de buis.
3. Om elke buis voeg 25 ul MTT (3 - [4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide bromide]oplossing (5 mg / ml) en incubeer 4 h in een _5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
4. Na incubatie verwijderen medium, voeg 250 ul dimethyl sulfoxide en vortex het mengsel gedurende 2-5 minuten de formazan complex oplosbaar.
5. Centrifugeer de CSM bij 2700 x g gedurende 5 minuten, en bepaal de supernatant absorptie gemeten bij 570 nm met behulp van 630 nm als referentie.
6. Bepaal het aantal cellen in verband met de CSM ten opzichte van de extinctie van bekende nummers van levensvatbare ASC.

6. Kenmerkend ASC-CSM-Embedded Collageen Gel

Opmerking: Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld.

1. Mix ASC geladen CSM (5 mg met ≈ 2 x 10 ⁴ cellen) met type 1 collageen (7,5 mg / ml) uit rattenstaart pees volgens de werkwijze van Bornstein ⁸ en fibrilleren nadat de pH op 6,8 met 2 N NaOH. Voeg de gefibrilleerde collageen ASC-CSM mengsel tot een 12-well plaat en gedurende 30 minuten bij een _5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
2. Na volledige fibrillatie incuberen de collageen ASC-CSM gels tot 14 dagen in een _5% CO2 bevochtigde incubator bij 37 ° C.
3. Afgifte en migratie van cellen uit CSM in de gel waargenomen met behulp van standaard microscopische technieken.

7. Representatieve resultaten

In de huidige studie hebben we een in vitro strategie om stamcellen van chitosan microsferen (CSM) te leveren in een collageen gel schavot. Poreuze CSM van uniforme grootte (175-225 micrometer in diameter) en samenstelling werden bereid en gebruikt als cel dragers (figuur 2). Bij incuberen ASC de CSM de cellen gevoegd in een concentratie van 2 x 10 ⁴ cells/5mg van CSM. De cellen waren in staat om zich over de microsfeer, terwijl de uitbreiding van filopodiain het poreuze spleten van de microsfeer (figuur 3). Wanneer de cel geladen CSM werden gemengd met het collageen gel, de cellen onmiddellijk begonnen migreren naar de gels (figuur 4).

Tabel 1. Biologische voordelen voor het gebruik van chitosan en collageen in een stamcel leveringssysteem.

Figuur 1. Schematische afbeelding van de algemene strategie voor de dubbel gebruik van de ASC-CSM geladen collageen steigers. Figuren 2, 3 en 4 zijn geannoteerd in het schema om te helpen met de interpretatie van de beelden.

Figuur 2. Schematische weergave afgebeeld het proces zaaien stamcellen op chitosan microsferen. De process gaat co-kweken van ASC met CSM in een 8 - um poriegrootte membraan cultuur plaat insert. Na 24 uur worden de microsferen uit de insert en klaar voor het inbedden in een matrix biomateriaal.

Figuur 3. Morfologische karakterisatie van CSM-geladen met ASC. Paneel A toont een licht microfoto van ASC-loaded CSM, terwijl paneel B toont hetzelfde beeldveld bovenop met een beeld verkregen door confocale fluorescentie microscopie. ASC werden geleverd met calceïne AM (groen). Paneel C toont een beeld van een SEM-opname van een onbelaste microsfeer, terwijl het paneel D toont cellen geladen op de microsfeer (sterretjes). De TEM beeld paneel E toont een dwarsdoorsnede van een onbelaste microsfeer. Een veelheid van poriën en spleten liggen verspreid over het microsfeer. Paneel F toont een doorsnede-doorsnede microsfeer met cellen (pijlen) verbonden en verlenging filopodia de creondeugden. Originele vergrotingen: A & B = 70X, C = 500x, D = 2.000 x, E & F = 2.500 x.

Figuur 4. Migratie van ASC de CSM de driedimensionale collageen scaffold. Panelen A en B tonen de CSM met cellen migreren uit de buurt van microsfeer en in de collageen matrix op dag 3 (A, pijlen). Paneel B toont een soortgelijk cultuur na 12 dagen. Transmissie electronenmicroscopie (TEM) beelden worden weergegeven in C, D en E. Asterisks in C en D tonen een microsfeer die cross-doorsnede is met cellen migreren afstand van de microsfeer (pijlen). Hogere vergroting van het paneel D is afgebeeld in panel E, en toont cel filopodia aan de collageen fibrillen (inzet). Originele vergroting: A & B = 100x, C & D = 6.000 x, E = 20.000 x, inzet = 150.000 x.

Figuur 5.Schematische afbeelding van de enorme gebruik van CSM in de regeneratieve geneeskunde en drug delivery.

Een belangrijke hindernis in stamcel-gebaseerde therapie is het ontwikkelen van efficiënte methoden voor de levering van cellen aan de bepaalde gebieden voor reparatie. Als gevolg van patiënt tot patiënt variabiliteit, het weefseltype, letsel grootte en diepte; moet de methodiek van het leveren van stamcellen worden bepaald op een case-by-case basis. Hoewel het inbedden van stamcellen binnen een matrix en leveren ze aan de wond lijkt een volgende logische aanpak voor tissue engineering, enkele technische hindernissen blijven. Dit omvat het vermogen van de ingebedde cellen te hechten aan de matrix en een biocompatibel omgeving waarin de cellen hechten, prolifereren en opnieuw een geschikt micro voor anoikis ^9-10. Dit proces vereist de cellen om upregulate hun matrix remodeling machines, een proces dat dagen kan duren vóór het gewenste cel processen van proliferatie, migratie en differentiatie van de stamcellen te bereiken. Om deze problemen te omzeilen, we have een methode ontwikkeld om voorspanning stamcellen op chitosan microsferen voor inbedden ervan in een geschikte matrix te herstellen van het beschadigde weefsel. Met unieke ionische verknoping methoden om de microsferen bereiden, protocol kan> 90% van de microsferen bereiden binnen 175-225 micrometer diameter, waardoor het genereren van een uitstekende micro-grootte drager voor cellen. Belangrijker na verknoping de microsferen blijven positief geladen, wat zeer bevorderlijk voor celhechting. Deze eigenschappen kunnen microsfeer stamcellen snel vastgemaakt aan de CSM. Eenmaal gehecht, deze stamcellen geladen microsferen zijn stabiel en in staat om ruimtelijke structuren in de steiger, zoals collageen hydrogels, om het beschadigde weefsel na te bootsen bereiken. Kortom, dit protocol biedt een nieuwe methode om ASC laden op CSM en illustreert dat cellen op de microsferen kunnen migreren met behoud van hun stamcellen fenotype. De poreuze CSM beschreven vormen eenuitstekende micro-omgeving voor ASC bevestiging en nog steeds mogelijk de cellen te migreren in de omringende matrix.

Samenvatting:

Kritische stappen

• Gebruik een uniforme grootte microsferen sinds variatie in de diameter van directe invloed beschikbare oppervlakte voor celhechting per milligram microsferen.
• Maak een uniforme bed van microsferen binnen de cultuur inzet om een ​​optimale uniforme bevestiging van cellen aan de CSM.
• Dat het volume van de media toegevoegd aan de buitenzijde en de celkweek inzetstuk is dan de meniscus van de put. Gewoonlijk een binnenste: buitenste volumeverhouding van 1:2 is, want dit vergemakkelijkt cellen verbonden aan de microsferen.
• Verdeel de cel geladen microsferen gelijkmatig binnen het schavot. Als de verdeling van de ASC-CSM is te dicht is, zullen de cellen niet migreren van hun microsferen.
• De gewenste hoeveelheid van CSM en distributiedrage dichtheid is afhankelijk van toepassing en beschadigde weefsel gebied.

Beperkingen

• Deze methode is beperkt tot het totale oppervlak op de microsferen. Indien een groter aantal cellen gewenst, meer microsferen nodig om de oppervlakte te vergroten.
• Het proces kan cellen worden uitgezaaid de voorgevormde microsferen en is niet bedoeld voor cel inkapseling doeleinden.
• De chitosan microbolletjes die in dit proces kan ondersteunen verankering-afhankelijke cellen, maar niet andere cellen typen.
• Aangezien chitosan microsferen zijn ontwikkeld met behulp van een 0,5 M azijnzuur oplossing geëmulgeerd in een olie mengsel (sojaolie: n-octanol) en teruggewonnen met organische oplosmiddelen niet de mogelijkheid actieve therapeutische groepen kwetsbaar de bovengenoemde voorwaarde.
• De CSM zijn voornamelijk bedoeld om cellen / drugs in een kortere tijdsduur (5-10 dagen) te leveren als gevolg van de snellere afbraakrate, anders dan voor langdurige beschikbaarheid.

Eventuele wijzigingen en veelzijdigheid (figuur 5)

• Microsphere grootte kan worden aangepast aan de totale oppervlakte te wijzigen. Zo kan microsfeer grootte worden gereduceerd tot het oppervlak / mg CSM, waardoor de totale oppervlakte van het aantal cellen die kunnen hechten aan de microsferen te verhogen, resulterend in een verhoogde celbelasting per microsfeer verhogen.
• Chitosan microsferen kunnen worden gebruikt als drager voor andere celtypen (endotheelcellen, pericyten, fibroblast, enz.) geladen.
• Cell geladen gebieden (of een of meerdere celtypes) worden ingebed specifieke locaties van steigers. Deze strategie zal helpen bij de bouw van meercellige tissue-engineered steigers voor weefselregeneratie.
• Naast cel levering, microsferen ook worden gebruikt om therapeutische middelen leveren (dat wil zeggen, groeifactoren, differentiatie inductoren, en / of antibiotica). Deze geneesmiddel beladen microsferen kunnen ook worden gebruikt in combinatie met cellen geladen microsferen in een scaffold de heling en regeneratieprocessen te versterken.

Problemen oplossen

• Bij de voorbereiding van de CSM als een grote variatie in grootte optreedt, waarna een aantal onderdelen kan worden aangepast aan de gewenste CSM maat ¹¹ opleveren.
  • Viscositeit van de oplossing chitosan. Vers bereide voorraad voorkeur aan de oplossing voortdurend viscositeit van partij-tot-partij preparaat
  • Het volume van de oppervlakte-actieve stof (span 80) gebruikt om de emulsie te bereiden.
  • Zorg ervoor dat de snelheid van de overhead roerder constant blijft gedurende het gehele proces (snelheid kan variëren met stroomschommelingen
  • Tijdens het schudden bijbrengen atmosferische lucht kan leiden tot turbulentie en de grootte variatie (dit kan worden vermeden door keep de vloeistof rimpel, welke vormen tijdens het roeren, net over de bladen van de overhead roerder.
• Om een ​​optimale belasting van de cel microsferen waarborgen kan een calorimetrische MTT assay uitgevoerd. Dit zal een geschatte aantal levensvatbare cellen per geladen milligram microsferen.
• Voorkomen samenklonteren van cel geladen microsferen door schorten in een klein volume celkweekmedia alvorens ze te mengen in een steiger zoals collageen hydrogel.