Konstruere en Kollagen Hydrogel for levering av Stem Cell-lastet Chitosan Mikrokuler

1. Isolere adipose-avledet stilk celler (ASC)

Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.

1. Isoler rotte perirenal og epididymal adipose og vask med sterilt Hank bufret salt-løsning (HBSS) inneholder 1% fosterets storfe serum (FBS) som tidligere beskrevet ^seks.
2. Finhakk vev og overføre 1-2 g til 25 ml HBSS inneholder 1% FBS inn en 50 ml tube og sentrifuger ved 500 gr i 8 min ved romtemperatur.
3. Samle frittflytende fettvev lag og overføring til 125 mL erlenmeyerkolbe og behandle med 25 mL collagenase type II (200 U / ml) i HBSS for 45 min ved 37 ° C på en orbital shaker (125 rpm).
4. Fjern forsiktig væskefraksjon (under olje-og adipose lag) og filtrere sekvensielt gjennom et 100-mikrometer og 70-mikrometer nylon mesh filter. Sentrifuger filtratet ved 500 gr i 10 min ved romtemperatur, aspirer det supernatant og vaske pellet to ganger med 25 ml HBSS.
5. Resuspender cellen pellet i 50 ml vekst medium (MesenPRO RS Basal Medium) supplert med MesenPRO RS Vekst Supplement, antibiotika-antimykotiske (100 U / ml av penicillin G, 100 mikrogram / ml streptomycin sulfat, og 0,25 mikrogram / ml amfotericin B) , og 2 mm L-glutamin og pipette celler i 2 T75 kolber (25 ml / kolbe).
6. Kultur i ASC i en 5% CO ₂ fuktet inkubator ved 37 ° C (Passage 2-4 ASC er brukt i alle eksperimenter).

2. Forberede Chitosan Mikrokuler (CSM)

Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.

1. CSM er utarbeidet av en vann-i-olje emulgering prosessen sammen med en ionisk coacervation teknikk ved hjelp av vår forrige protokoll ^6. Emulsify en vandig løsning av kitosan (6 ml 3% w / v kitosan i 0,5 M eddiksyre) i en 100 mL en oljefasen blanding bestående av soyaolje, n-oktanol (1:2 v / v) og 5% sorbitan-mono-oleate (span 80) emulgator, bruke overhead (1700 rpm) og magnetiske røring (1000 rpm) samtidig, i motsatte retninger. Denne doble metoden for å blande sikrer at miceller dannet tidlig på før tverrbindinger forekommer kan forbli i løsning og ikke bosette til bunnen. Videre den magnetiske oppsikt baren hjelpemidler i de-aggregere kitosan under miceller formasjon og rigidization.
2. Blandingen er kontinuerlig røres i ca 1 time til en stabil vann-i-olje emulsjon oppnås. Ionisk crosslinking innledes med tillegg av 1,5 ml med 1% w / v kaliumhydroksid i n-oktanol hvert 15 min for 4 t (24 ml totalt).
3. Etter gjennomføringen av crosslinking reaksjonen, sakte dekanter oljefasen av blandingen inneholder CSM og umiddelbart legge kulene til 100 ml aceton. Vask kulene med aceton inntil oljefasen er helt fjernet.
4. Tørk de gjenopprettede kuler i et vakuum eksikkator og analyze uten videre behandling. Den gjennomsnittlige CSM partikkelstørrelse, areal per milligram, og enheten kubiske volumet ble fastsatt ved hjelp partikkelstørrelse analysator.
5. For etterfølgende forsøk, vaske CSM tre ganger med sterilt vann for å fjerne rester av salter og sterilisere med absolutt alkohol.

3. Bestemme antall Free aminogrupper i CSM

Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.

1. Bestem antall gratis aminogrupper stede i CSM etter ionisk crosslinking ved hjelp av trinitro benzenesulfonic (TNBS) syre analysen av Bubins og Ofner ^7. Inkuber 5 mg mikrosfærer med 1 mL 0,5% TNBS løsning i en 50 ml glassrør for 4 timer ved 40 ° C og hydrolyserer med tillegg av 3 mL 6N HCl ved 60 º C for 2t.
2. Kjøl prøvene til romtemperatur, og trekke ut de frie TNBS ved å tilsette 5 ml avionisert vann og 10 ml av ethyleter.
3. Varm en 5 ml delmengde av den vandige fasen til 40 ° C i vannbad i 15 min å fordampe eventuelle gjenværende eter, avkjøles til romtemperatur, og fortynn med 15 ml vann.
4. Mål absorbansen ved 345 nm med et spektrofotometer ved hjelp TNBS løsning uten kitosan som blank og kitosan brukes til CSM forberedelse for å fastslå det totale antallet aminogrupper. Anslå antall gratis aminogrupper av CSM forhold til kitosan.

4. Laster ASC i CSM

Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.

1. Stabilisere 5 mg sterilisert CSM fra § 2.5 i sterile HBSS natten og legge til en 8-mikrometer porestørrelse membran kultur plate innsatsen (24-brønns plate).
2. Etter CSM har avgjort på membranen, nøye Aspirer HBSS og legge 300 mL av vekst medium til innsiden av innsatsen og 700 mL av vekstmedier til the utenfor innsatsen.
3. Resuspender ASC på riktig konsentrasjon (1 x ^{4-4 oktober} x 10 ⁴⁾ i 200 mL av vekstmedium og frø over CSM inne i kulturen plate innsatsen. Den endelige volum medium innenfor kulturen innsatsen, etter seeding, er 500 mL.
4. Inkuber ASC seeded på CSM for 24 timer i en 5% CO ₂ fuktet inkubator ved 37 ° C.

5. Bestemme Andel ASC Loading og celleviabilitet i CSM

Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.

1. Etter inkubasjon samle ASC-lastet CSM i et sterilt 1,5 ml mikrosentrifuge rør uten å forstyrre de cellene som har migrert inn innsatsen membranen.
2. Fjern rester medium og tilsett 250 mL av frisk vekst medium til røret.
3. Til hver tube legge 25 mL MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide]løsning (5 mg / ml) og inkuberes i 4 t i en 5% CO ₂ fuktet inkubator ved 37 ° C.
4. Etter inkubasjon fjerne medium, legge 250 mL av dimethyl sulfoxide, og vortex blandingen for 2-5 min til solubilize den formazanforbindelse komplekset.
5. Sentrifuger CSM på 2700 x g for 5 min, og bestemme supernatanten absorbansen målt ved 570 nm med 630 nm som referanse.
6. Bestem celle nummer knyttet til CSM forhold til absorbans verdi hentet fra kjente antall levedyktige ASC.

6. Karakterisere ASC-CSM-Embedded Collagen Gel

Merk: Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur hvis ikke annet er angitt.

1. Mix ASC-loaded CSM (5 mg inneholder ≈ 2 x 10 ⁴ celler) med type 1 kollagen (7,5 mg / ml) hentet fra rotte hale sene ifølge metoden for Bornstein ⁸ og fibrillate etter justering av pH til 6,8 med 2 N NaOH. Legg til fibrillated kollagen-ASC-CSM blandingen til en 12-brønns plate og Inkuber i 30 min ved i en 5% CO ₂ fuktet inkubator ved 37 ° C.
2. Etter fullført flimmer, Inkuber kollagen-ASC-CSM gels for inntil 14 dager i en 5% CO ₂ fuktet inkubator ved 37 ° C.
3. Release og migrasjon av celler fra CSM inn i gelen ble observert ved hjelp av standard mikroskopi teknikker.

7. Representative Resultater

I denne studien har vi utviklet en in vitro strategi for å levere stamceller fra kitosan mikrosfærer (CSM) i en kollagen gel stillas. Porøs CSM av uniform størrelse (175-225 mikrometer i diameter) og sammensetning ble utarbeidet og brukt som celle bærere (figur 2). Ved ruger ASC med CSM, cellene festet i en konsentrasjon på 2 x 10 ⁴ cells/5mg av CSM. Cellene var i stand til å spre over mikrosfære, mens forlenge filopodiainn i porøse sprekker i mikrosfære (figur 3). Når celle-lastede CSM ble blandet med kollagen gel, cellene umiddelbart begynte å migrere inn i gels (figur 4).

Tabell 1. Biologiske fordeler for bruk av kitosan og kollagen i en stamcelle levering system.

Figur 1. Skjematisk viser den overordnede strategien for den doble bruken av ASC-CSM lastet kollagen stillaser. Figurene 2, 3 og 4 er kommentert i skjematisk å bistå med tolkning av bildene.

Figur 2. Skjematisk fremstilling som viser prosessen med seeding stamceller på kitosan mikrosfærer. Den procESS innebærer co-dyrkning ASC med CSM i en 8 - mikrometer porestørrelse membran kultur plate innsatsen. Etter 24 timer, er det mikrosfærer fjernet fra innsatsen og er klar for innebygging i et biomateriale matrise.

Figur 3. Morfologisk karakterisering av CSM-lastet med ASC. Panel A viser en lys micrograph av ASC-lastet CSM, mens panel B viser det samme synsfeltet overlagret med et bilde fremstilt ved confocal fluorescens mikroskopi. ASC ble forhåndslastet med calcein AM (grønn). Panel C skildrer et bilde av en SEM bilde av en ubelastet mikrosfære, mens panel D viser celler lastet inn på mikrosfære (stjerne). Den TEM bilde i panelet E viser et tverrsnitt av en ubelastet mikrosfære. Et mangfold av porer og sprekker er lokalisert over hele mikrosfære. Panel F viser en cross-seksjonert mikrosfære med celler (piler) festet og utvide filopodia inn i CRElaster. Original forstørrelser: A & B = 70x, C = 500x, D = 2000 x; E & F = 2500 x.

Figur 4. Migrasjon av ASC fra CSM inn i tredimensjonale kollagen stillaset. Paneler A og B skildrer CSM med celler migrere bort fra mikrosfære og inn i kollagen matrise på dag 3 (A, piler). Panel B viser en lignende kultur etter 12 dager. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) bilder er avbildet i C, D og E. asterisker i C og D viser en mikrosfære som har vært cross-seksjonert med celler migrere bort fra mikrosfære (piler). Høyere forstørrelse av panel D er avbildet i panelet E, og viser celle filopodia festet til kollagen fibriller (innfelt). Opprinnelig forstørrelse: A & B = 100x; C & D = 6000 x; E = 20000 x, innfelt = 150000 x.

Figur 5.Skjematisk skildrer de enorme bruk av CSM i regenerativ medisin og levering av legemidler.

Et stort hinder i stamcelle-basert terapi er å utvikle effektive metoder for levering av celler til de angitte områder for reparasjon. På grunn av pasient til pasient variasjon, den vevstype, skade størrelse og dybde, må metodikken for å levere stamceller avgjøres fra sak til sak. Selv innebygging stamceller innenfor en matrise og levere dem til sårstedet synes å være en neste logiske tilnærming for tissue engineering, noen tekniske hindringer gjenstår. Dette inkluderer muligheten for innebygde cellene å feste til matrise og gi en biokompatibelt rundt der cellene kan feste, spre og gjenopprette en passende mikromiljøet før anoikis ^9-10. Denne prosessen krever cellene til upregulate sin matrise remodeling maskiner, en prosess som kan ta dager å gjennomføre før de ønskede celleprosesser for spredning, migrasjon og differensiering av stamceller. For å omgå disse problemene, h viave utviklet en metode for å Forhåndslast stamceller inn på kitosan mikrosfærer før å bygge dem inn i en passende matrise til reparasjon av skadet vev. Ved å bruke vår unike ionisk tverrbindinger metoder for å forberede mikrosfærer, er protokollen kunne tilberede> 90% av mikrosfærer å være innenfor 175-225 mikrometer i diameter, og dermed generere en utmerket mikro-sized transportør for celler. Enda viktigere, etter tverrbindinger, den mikrosfærer forbli positivt ladet, noe som er svært bidrar til celle vedlegg. Disse mikrosfære egenskapene tillate stamceller til å feste raskt på CSM. Når festet, disse stamcelle ladd mikrosfærer er stabile og i stand til å oppnå romlige ordninger innenfor stillas, som for eksempel kollagen hydrogeler, for å etterligne den skadde vevet. I sum gir dette protokollen en ny metode for å laste ASC på CSM og illustrerer at cellene på mikrosfærer kan migrere og bevare sin egen stamcelleforskningen fenotype. Den porøse CSM beskrevet gir enutmerket mikromiljøet for ASC vedlegget og likevel tillate cellene til å migrere inn i omkringliggende matrise.

Oppsummering:

Kritiske trinn

• Bruk uniformt sized mikrosfærer siden variasjon i diameter direkte påvirker areal tilgjengelig for celle vedlegg per milligram av mikrosfærer.
• Utarbeide en enhetlig seng av mikrosfærer i kulturen innsatsen til optimal uniform feste celler til CSM.
• Sørg for at volumet av media lagt til ytre godt av cellekultur innsatsen er høyere enn menisken av den indre brønnen. Vanligvis en indre: er ytre volum ratio på 1:2 er aktuelt, da dette letter celler feste til mikrosfærer.
• Fordel cellen lastet mikrosfærer jevnt i stillaset. Dersom fordelingen av ASC-CSM er for tett, vil cellene ikke migrere fra deres mikrosfærer.
• Ønsket mengde CSM og distribusjonbusjon tetthet er avhengig av søknad og skadde vevet området.

Begrensninger

• Denne metoden er begrenset til det totale arealet tilgjengelig på mikrosfærer. Hvis en høyere celle nummer er ønskelig, er mer mikrosfærer nødvendig for å øke arealet.
• Prosessen tillater celler å bli seedet på den prefabrikkert mikrosfærer og er ikke ment for celle innkapsling formål.
• Den kitosan mikrosfærer utviklet i denne prosessen kan støtte ankerplass-avhengige celler, men ikke andre celler typer.
• Siden kitosan mikrosfærer er utviklet ved hjelp en 0.5M eddiksyreløsning, emulgert i en olje blanding (soyaolje: n-oktanol) og utvinnes ved hjelp av organiske løsemidler den ikke tillater aktive terapeutiske moieties sårbare for ovennevnte tilstand.
• CSM er hovedsakelig ment å levere celler / medikamenter i kortere varighet (5-10 dager) på grunn av sin raskere nedbrytningrate, i motsetning til de beregnet for lang varighet tilgjengelighet.

Mulige Modifikasjoner og allsidighet (figur 5)

• Mikrosfære størrelse kan endres for å endre det totale areal. For eksempel kan mikrosfære størrelse reduseres for å øke arealet / mg CSM, som igjen vil øke det totale arealet og antall celler som kan festes til mikrosfærer, noe som resulterer i en økt celle belastning per mikrosfære.
• Chitosan mikrosfærer kan brukes som en transportør for å laste andre celletyper (endotelceller, pericytes, fibroblast osv.).
• Cell-lastet kuler (enten enkel-eller flere celletyper) kan bygges innenfor bestemte steder i stillasene. Denne strategien vil bidra i byggingen av flercellede vev-konstruerte stillaser for vev gjenfødelse.
• I tillegg til celle levering, kan mikrosfærer også brukes til å levere terapeutiske legemidler (dvs. vekstfaktorer, derivasjon indusere og / eller antibiotika). Disse narkotika-loaded mikrosfærer kan også brukes i kombinasjon med celle-lastet mikrosfærer innenfor et stillas for å forbedre healing og fornyelsesprosesser.

Feilsøking

• Ved utarbeidelsen av CSM, hvis en stor variasjon i størrelse inntreffer, da en rekke elementer som kan justeres for å gi ønsket CSM størrelse ^11.
  • Viskositet av kitosan løsning. Nylaget lager er å foretrekke å holde løsningen under konstant viskositet fra batch-til-batch forberedelse
  • Juster volum av surfaktant (span 80) brukes til å forberede emulsjon.
  • Sørg for hastigheten på overhead røreverket holder seg konstant gjennom hele prosessen (hastigheten kan variere med elektriske spenningsvariasjoner
  • Under omrøring formidling atmosfærisk luft kan føre til turbulens og størrelse variasjon (dette kan unngås ved å keep væsken rippel, som danner under omrøring, litt over bladene på overhead vispen.
• For å sikre optimal celle lasting av mikrosfærer, kan en kalorimetriske MTT analysen skal utføres. Dette vil gi en estimert antall levedyktige celler lastet per milligram av mikrosfærer.
• Forhindre klumper av celle-lastet mikrosfærer ved å henge dem i et lite volum av cellekultur media før blande dem i et stillas som en kollagen hydrogel.