Belirlenen Nöronlar ve Beslenme Davranışı Kalsiyum sinyaller aynı anda kayıt Drosophila melanogaster

Motojiro Yoshihara

Department of Neurobiology, University of Massachusetts Medical School

1. Sinekler oluşturma

1. Yanak eritilmesi ve uygun bir açı ve kalınlık (; Şekil 2, Şekil 1a) oluşturacak şekilde bu oyarak 35 mm Falcon kabının kapağını bir platform şekillendirmeye. Ağız serbestçe odası (Şekil 1a) ve dışında maruz kaldığı bu tür sinek başı (Şekil 1a, b) kabul etmek platformda bir delik delin. Sinek dikkat edilmesi eşleşen boyutu ile, bir Pipetman ucu sonu kesin. Platforma tutkal ucu sinekler (Şekil 2) tamamlamak için Şekil 1a'da gösterilen.

2. Gözlem için Fly hazırlanması

1. 25 24 saat için yetişkin bir sinek açlıktan ° C açlık gerekirse, sadece ıslak bir kağıt havlu ile bir şişe yerleştirerek deney öncesinde.
2. Buz üzerinde ayakta duran bir 15ml plastik tüp yerleştirerek sinek uyutmak.
3. Forseps kullanarak odasının içine bir sinek eklemekSinekler ve hareket edemiyor kadar hafifçe sinek itin. Sonra, sinek korumak için bir fiş takın. (Şekil 1a, b).
4. Deliğinin iç kenarı ile proksimal hortum (rostrum) çevreleyen parça mühürlemek; taraftan ışık sertleşen yapıştırıcı (Tetric EvoFlow), az miktarda uygulanır ve ikinci rostrum yukarıda dışındaki (Şekil 3 'de oklar). Sineklerin içten kafasının dorsal parçası ve deliğinin iç kenarı (Şekil 1b) arasındaki boşluğa tutkal de geçerlidir. Kürsüden serbestçe hareket etmesine izin vermek için, bakım tutkal yaymak için bir kirpik (veya benzer bir şey) kullanarak kürsüde dokunmadan herhangi bir tutkal önlemek için alınmalıdır. Son olarak, aşırı sıcaklardan sinek zarar vermemek için tedavi için yeterli mavi ışık zayıf aydınlatma ile tutkal tedavi. Fişi çıkarın.
5. Kürsüden kısmen (Şekil 3 ok) kaldırdı tutmak için bir konu sinek stabilize etmek için istihdam edilebilir 'SOG için faringeal bölümünün yumru kaçınarak ve özellikle burnumun tamamen geri çekilir farenks parçası ile kaplıdır Gr5a nöronların ^8, görüntüleme presinaptik terminaller için, SOG ventral kısmı açığa tarafından kafası.
6. ; KCl, 2; _MgCl2, 4.5; _CaCl2, 1.5; ve HEPES-NaOH, 5 7,1 ¹⁰ arasında bir pH değerine sahip NaCl, 140: bir şeker içermeyen tuzlu su ihtiva eden (mm) ile platform yüzeyi doldurun. Bu sakaroz içermeyen tuzlu sık kullanılan olanlar sukroz içeren bu HL3.1 ¹¹ olarak Salines benzer toniklik vardır.
7. Ismarlama bir cihaz ve ilk SOG (Şekil 4) ortaya çıkarmak için manikür ve trakea klibi Dr Kageyuki Yamaoka, Japonya tarafından tasarlanmış makas gibi keskin uçlu bir tungsten bıçak ve forseps kullanarak baş kapsülü açın. Dorsal kenar kesim gibi kritik değildi oysa kafa kütikül ventral kenarı mümkün olduğunca ventral olarak kesildi. Birincisi, üzerinden bir kesi yapmakarka kenarı bir tungsten bıçak kullanarak. Sonra, tarafı boyunca kesilmiş ve keskin forseps kullanılarak, ön kenar. Cut manikür parçası forseps ile kaldırdı ve çıkarılmalıdır. Anten ve antennal sinirler bilenmiş forseps tarafından kesilmelidir.
8. Kayıt sırasında hareket eşya önlemek amacıyla, beyin sineği bazı kısımlarının çıkarılması ile stabilize edilmesi gerekir. İlk olarak, seçici SOG ve tırnak arasında hava çuval kaldırın. Farenks doğru sonunda ve farenks ve beyin arasındaki bağlantıyı kaldırmak için SOG girecek sonunda yemek borusu kesin. Sonra Muscle 16 ¹² çekin ve son olarak beyin ve kütikül bağlayan herhangi bir trakea ayırın.
9. Biz bir iplik diski konfokal mikroskop sistemi (Perkin Elmer içinde Improvision) (Şekil 5) bağlı bir Olympus BX51WI mikroskop sahnede bizim Sinekler ayarlayın. Bir suya daldırma objektif, örneğin 40X/0.8 NA, banyo (Şekil 6 batırılır edildi

3. Ca ^{2 +} Beyin Görüntüleme

1. ^{Ca2 +} görüntüleme GCaMP3.0 kullanılarak ^{1, 9} Marella ark tarafından belirlenen yöntemi vasıtasıyla yapıldı. ⁸ (Şekil 6). Bir iplik Disk konfokal mikroskop (Improvision) kullanarak, ilgi bölgedeki (motor nöron bir hücre gövdesi, ya da bir internöron veya presinaptik terminallerinde odaklanarak, 491nm uyarılma lazer kullanarak 122ms bir pozlama süresi ile 4Hz tek bir optik bölümü almak tat duyu nöronlarının) Hız yazılım, sürüm ile. 4,3 (Improvision).

4. Probosis Uyarıcı

1. Ucu (Şekil 7) dışarı çıkan küçük bir fitil (Japon washi kağıttan yapılmış, özel reaktiflerin bkz. Tablo) hipodermik bir iğne içine 100mM sulu sakaroz çözeltisini aspire.
2. Fitil üzerine sukroz çözeltisi, küçük bir damla deşarj, daha sonra, hemen befor, bu aspireburnumun ucu ıslanmış washi kağıt fitil uygulayarak e. Washi kağıt fitil sadece doyma (Şekil 8) önlemek için bir an için uygulanmalıdır. Probosis Uzatma Tepki (PER) Ca ^{2 +} görüntüleme ile eşzamanlı olarak (Şekil 5) bir diseksiyon mikroskobu bağlı bir CCD kamera kullanarak davranışlarını izlemek. Veri BAŞINA yanıtı bu koşullar altında bir saatten fazla devam etmez çünkü diseksiyonu başladıktan sonra bir saat içinde alınmalıdır.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Kürsüden iletki, burnumun uzantısı için kürsüden kaldırma sorumlu tutulan başlıca kasları bir çift, Motor nöronların tatlı uyaranlara ¹³ sağlam yanıtları göstermek için bildirilmiştir. Şekil 9'da, Ca ^{2 +} sinyalleri GCaMP3.0 ^{1, 9} yoluyla ifade motor nöron bir hücre gövdesinden Gal 4 sürücüsü, E49 ^13,. Video, bir robu 'de gösterildiği gibist BAŞINA ^{Ca2 +} sinyali bir artış ile eşzamanlı olarak gözlenmiştir.

Şekil 1.. Fly beyin Canlı Görüntüleme ve Elektrofizyoloji Sahne (uçar) şematik. Bir, sinekler sinek kafası düz bir şekilde gelmesi için duvar açısı sağlayan bu tür inşa edilmiştir. Sinek burnumun üç segmente renk kodlu vardır; kürsüsüne eflatun olduğunu. Sinek forseps odasına yerleştirilen ve bir Pipetman ucunun sonunda kesilen bir parça kaçan sineği engellemek için odanın arka takılı edilir. B, delik sinek kafasına uyacak şekilde sıkılır. Sızıntı olmadığından emin olmak için belirtilen kalan eksiklikleri ışıkla sertleşen yapıştırıcı ile kapatılır. Tutkal tamamen donduktan sonra bir tıkaç görevi Pipetman ucu kaldırılır. Salin beynin yüzey tamamen kapalı olduğu gibi sinekler içine dökülür. Hiçbir tuzlu su sızıntısı olduğunu sağlanmalısinek başın ön ucuna dışarı ing. Panel b kesikli çizgi ile çevrelenmiş gölgeli alan çıkarılmış üzere bir kısmını göstermektedir.

Şekil 2. Sineklerin Fotoğraf. Tutkal hilal şeklinde bir duvar (bir tutkal tabancası itibaren) perfüzyon sırasında tuzlu su akışını kontrol etmek ve kullanılan tuz miktarını azaltmak için yapılır.

Şekil 3. Bir sinek ön görünümü ışıkla sertleşen yapıştırıcı bir tuzlu su geçirmez conta oluşturmak için sinek (oklar) başının etrafında nasıl uygulanacağını Bu görüntü bir sinek Sineklerin ayarlanır gösterir. Sinekler monte ve. Sineğin probosis kadar herhangi bir tuzlu su sızıntıları, daha sonra deneme başarısız olur. Sahneye tethered iplik (ok başları) tamamen retrac değildir, böylece pozisyonda burnumun tutmak olduğunu ted. Aksi takdirde SOG ile daha ventral kısmı tıkayabilir ve hareket eserler neden olur.

Şekil 4. Bir disseke sinek ile Sineklerin En görünümü. Bu görüntü bir sinek şu kütikül kaldırma maruz SOG gösterir. Yemek borusu, kas 16 ve trakea beyin bağlı olarak seçilen hava-çuval da kalsiyum sinyalleri eşya yol açabilir beyin, rahatsız engellemek için çıkarıldı.

Şekil 5. Izleme cihazı. Bu cihaz bir iplik diski konfokal mikroskop sistemi (Improvision) bağlı bir Olympus BX51WI mikroskop monte edilen ve bir Nikon SMZ800 mikroskop yan monte edilir. Bu kurulum davranış BAŞINA sırasında beyin aktivitesinin canlı görüntüleme sağlar.

6 "src =" / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg "/>
6 Şekil. Sineklerin yan görünümü göstermek için fotoğraf. Tuzlu su ince bir tabaka 40X suya daldırma lens ve sinek arasında sandviç edilir.

Şekil 7. Washi kağıt fitil yapmak için şematik. Gampi-washi kağıt (Haibara, Japonya) son derece ince ve pürüzsüz bir geleneksel Japon parşömen olduğunu. Ayrıca, çok kuvvetli ve sıvı büyük miktarda muhafaza edebilir. Washi kağıt çok özel boyutları olan bir yamuk şeklinde kesilmiş olmalıdır; 0.3 mm ve 0.7 mm genişliği ve uzunluğu 4-5 mm (a). Bu, daha sonra bir yamuk 23 G derialtı iğne ucu içine 0,7 mm taraftan eklenir ve aynı zamanda bir V-şeklinde (b) bükülmüş bir böcek pimi, yerleştirilmesi ile kararlı hale getirilebilir. C, washi kağıt hale şeffaf aşağıdaki maruz kalmabir sıvı için, bu deney için idealdir.

Şekil 8. Washi-fitil ile sinekleri üzerinde burnumun uyarılması. Bir derialtı iğne ucunda washi kağıt fitil tek elle bir Joystick manipülatör kullanılarak bir an için uygulanır. İğne sukroz çözeltisi aspirasyon ve boşaltılması için, diğer taraftan ile manipüle bir enjektör için esnek bir boru ile bağlanır.

Şekil 9. Temsilci sonuçlanır. bir, davranış PER stereomikroskop yüklü CCD kamera aracılığıyla kaydedildi. Stimülasyonu azından uyarılmasıyla önce uzun bir hortum (oklar), ve 100 mM sukroz sulu çözeltisi (arrowhead) ihtiva eden bir fitil A ile uyarıldıktan sonra bir starved sinek frontal görünümler. Aydınlatma kullanılan bir 491 nm lazer sayesinde gerçekleşirGCaMP floresans. b, hasret devlet kürsüden kas iletki için motor nöron içinde GCaMP 3.0 yanıtı Sakkaroz-indüklenen. Uyarılması daha önce üst panel; alt panelini, hemen uyarıldıktan sonra. Ölçek çubuğu, 10 mikron. C, sukroz bağlı GCaMP 3.0 yanıtının belirlenmesi. Motor nöron temel çizgi birkaç saniyelik bir restorasyon aşaması takip floresan keskin bir artış ile sakaroz uyarana yanıt verir.