Gelijktijdig opnemen van Calcium Signalen van geïdentificeerde neuronen en eetgedrag van de Drosophila melanogaster

Motojiro Yoshihara

Department of Neurobiology, University of Massachusetts Medical School

1. De bouw van de VLIEGEN

1. Vorm een platform van het deksel van 35 mm Falcon schaal door het smelten van de zijwand en snijwerk dat het een juiste hoek en de dikte (Figuur 1a; figuur 2) te vormen. Boor een gat in het platform om de vlieg kop (figuur 1a, b), zodanig dat de mondstukken vrij worden blootgesteld aan de buitenzijde van de kamer (figuur 1a) accepteren. Snij het einde van een Pipetman tip met de grootte overeenkomt met de vlieg te worden genomen. Lijm de tip om het platform, zoals aangegeven in figuur 1a om de vliegen (figuur 2) te voltooien.

2. Voorbereiden van de Fly voor observatie

1. Verhonger volwassen vlieg gedurende 24 uur bij 25 ° C voorafgaand aan het experiment door het in een flesje met slechts een vochtige tissue indien uithongering noodzakelijk.
2. Verdoof de vlieg door het in een 15 ml plastic buis staande op ijs.
3. Met behulp van een tang, plaatst u een vlieg in de kamer van deVLIEGEN, en duw de vlieg in totdat het niet in staat is om te bewegen. Vervolgens plaatst u een stekker op de vlieg te behouden. (Figuur 1a, b).
4. Sluit de aangrenzende delen van het proximale snuit (snuit) aan de binnenrand van de opening, toepassen een kleine hoeveelheid licht uithardende lijm (Tetric EvoFlow) aan de zijkanten en boven het podium van buitenaf (pijlen in figuur 3). Ook de lijm vanuit de binnenkant van de VLIEGEN de ruimte tussen de rug van de kop en de binnenrand van de opening (figuur 1b). Om het rostrum tot aan vrij bewegen, moet erop worden gelet dat de lijm te voorkomen dat het aanraken van het podium met behulp van een wimper (of iets vergelijkbaars) om de lijm te verspreiden. Tot slot, genezen de lijm met de zwakste verlichting van blauw licht voldoende is voor de genezing om te voorkomen dat schade aan de vlieg tegen overmatige hitte. Haal de stekker.
5. Een thread op het podium gedeeltelijk heeft opgeheven (pijl in figuur 3) in het bezit kunnen worden gebruikt om de vlieg te stabiliseren 's hoofd door het vermijden van bump van de faryngeale deel aan SOG en het ventrale deel van de SOG bloot te leggen, in het bijzonder voor de beeldvorming presynaptische terminals van Gr5a neuronen ^8, die worden gedekt door een deel van de keelholte als de proboscis volledig is ingetrokken.
6. Vul het oppervlak van het platform met suikervrije zoutoplossing bevattende (in mM) NaCl, 140, KCl, 2, _MgCl2, 4,5, _CaCl2 1,5 en HEPES-NaOH, 5 met een pH van 7,1 ^10. Deze sucrose-vrije zoutoplossing heeft dezelfde tonus met die van veelgebruikte suikerhoudende Salines, zoals HL3.1 ^11.
7. Open het hoofd capsule met een wolfraam mes en een tang met geslepen tips, zoals een schaar, dat is een op maat gemaakt apparaat en oorspronkelijk ontworpen door Dr Kageyuki Yamaoka, Japan, om de cuticula en de luchtpijp clip om de SOG (figuur 4) bloot te leggen. De ventrale van de kop cuticula werd doorgesneden ventrale mogelijk dat de dorsale zijde snede niet zo kritisch. Maak eerst een incisie door deachterste rand van het gebruik van een wolfraam mes. Daarna dwars door de zijkant en de voorste randen met behulp van de geslepen tang. De cut cuticula stuk moet worden opgeheven met de tang en verwijderd. Antennes en antennaal zenuwen moeten worden gesneden door de geslepen tang.
8. Om bewegingsartefacten voorkomen tijdens opnames, moet de hersenen worden gestabiliseerd door de verwijdering van bepaalde delen van de vlucht. Ten eerste, selectief verwijderen van luchtzakjes tussen de SOG en de cuticula. Snij de slokdarm op het einde naar de keelholte en aan het einde gaat de SOG de verbinding tussen de keelholte en de hersenen verwijderd. Dan trek Muscle 16 ^12, en ten slotte, los een luchtpijp het aansluiten van de hersenen en de cuticula.
9. Wij hebben onze VLIEGEN ingesteld op het podium van een Olympus BX51WI microscoop aangesloten op een draaiende schijf confocale microscoop systeem (Improvision in PerkinElmer) (figuur 5). Een onderdompeling in water lens, bijvoorbeeld 40X/0.8 NA, werd ondergedompeld in het bad (Figuur 6

3. Ca ^{2 +} beeldvorming van de hersenen

1. Ca ^{2 +} beeldvorming met GCaMP3.0 ^{1, 9} werd uitgevoerd door de werkwijze die door Marella et al.. ⁸ (fig. 6). Met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop (Improvision), neem een ​​enkele optische sectie op 4Hz met een belichtingstijd van 122ms gebruik van 491nm laser excitatie, met de nadruk op de regio van belang (een cel lichaam van een motor neuron, of een interneuron, of presynaptische terminals van smaak sensorische neuronen) met Velocity software, Ver. 4.3 (Improvision).

4. Het stimuleren van de Proboscis

1. Zuig 100 mM waterige oplossing sucrose in een hypodermische naald met kleine kous (gemaakt van Japanse Washi papier zie tabel specifieke reagentia) uitsteekt vanaf het uiteinde (Figuur 7).
2. Kwijting een kleine daling van sucrose oplossing op de pit, dan zuig het, onmiddellijk before de toepassing van de geweekte Washi papier lont aan het uiteinde van de slurf. De Washi papier lont mag alleen worden toegepast voor een moment om verzadiging (figuur 8) te voorkomen. Controleer de Proboscis Extension Response (PER) gedrag met behulp van een CCD-camera bevestigd aan een dissectie microscoop (figuur 5) gelijktijdig met Ca ^{2 +} beeldvorming. De gegevens moeten worden genomen binnen een uur na aanvang van de dissectie, omdat de PER reactie niet gehandhaafd blijft meer dan een uur onder deze omstandigheden.

5. Representatieve resultaten

Motor neuronen van het rostrum gradenboog, een paar belangrijke spieren die verantwoordelijk zijn voor het opheffen van het podium voor de proboscis uitbreiding, is gemeld dat deze robuuste reacties op zoete prikkels ¹³ tonen. Figuur 9 toont Ca ^{2 +-signalen} via GCaMP3.0 ^{1, 9} uitgedrukt in een Gal 4-stuurprogramma, E49 ^13, uit een cellichaam van het motorneuron. Zoals getoond in de video een Robust PER waargenomen synchroon met een toename van Ca ^{2 +} signaal.

Figuur 1. Schematische voorstelling van de Fly hersenen Live-Imaging and Elektrofysiologie Stage (vliegen). A wordt de VLIEGEN vervaardigd dat de hoek van de muur kan het vlieg hoofd rechte komen. Drie segmenten van de vlieg proboscis zijn kleurcode, het podium is magenta. De vlieg wordt in de kamer met een pincet, en een stuk gesneden uit het einde van een Pipetman tip is aangesloten op de achterkant van de kamer naar de vlieg te blokkeren ontsnappen. B, is het gat geboord om te voldoen aan het hoofd van de vlieg. De overige gaten zijn afgedicht met licht-uithardende lijm, zoals aangegeven ervoor te zorgen dat er geen lekken zijn. Nadat de lijm is uitgehard, wordt de Pipetman tip als een plug verwijderd. Saline wordt gegoten in de VLIEGEN zodanig dat het oppervlak van de hersenen geheel bedekt. Er moet worden gegarandeerd dat er geen zout lekIng uit op het voorste einde van de vlieg hoofd. Het gearceerde gebied omgeven door de stippellijn in paneel b toont het deel ontleed uit.

Figuur 2. Foto van de vliegen. De halvemaanvormige wand van lijm (van een lijmpistool) wordt de stroom van zoutoplossing bij perfusie te controleren en de hoeveelheid zoutoplossing gebruikt verminderen.

Figuur 3. Vooraanzicht van een vlieg gemonteerd in de vliegen. Dit plaatje laat zien hoe een vlieg is ingesteld in de vliegen, en hoe de licht-uithardende lijm wordt aangebracht rond het hoofd van de vlieg (pijlen) om een zout-proof afdichting te creëren. Als een zoutoplossing lekken tot en met de slurf van de vlieg, dan is het experiment mislukken. De draad (pijlen) bevestigd aan de fase is de snuit in positie, zodat het niet volledig uittrekken Ted. Anders zou het belemmeren van de meer ventrale deel van de SOG en veroorzaken bewegingsartefacten.

Figuur 4. Top-view of the Flies met een ontleed vlieg. Dit beeld toont de blootgestelde SOG van een vlieg volgende nagelriemen te verwijderen. De slokdarm, luchtpijp spier 16 en verbonden met de hersenen, en geselecteerde lucht zakken ook zijn verwijderd te verstoort de hersenen, wat kan leiden tot artefacten in de calcium signalen.

Figuur 5. De bewakingsinrichting. Deze inrichting is opgebouwd uit een Olympus microscoop BX51WI aan een draaiende schijf confocale microscoop systeem (Improvision) en een zijkant gemonteerde Nikon SMZ800 microscoop. Deze opzet maakt het mogelijk om live-beeldvorming van de hersenactiviteit tijdens PER gedrag.

6 "src =" / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg "/>
Figuur 6. Foto de zijaanzicht van de vliegen vertonen. De dunne laag zoutoplossing wordt ingeklemd tussen de 40X water ondergedompeld lens en de vlieg.

Figuur 7. Schema voor het maken van de Washi papier lont. Gampi-Washi papier is een traditioneel Japans perkament, dat is extreem dun en glad (Haibara, Japan). Het is ook zeer sterk en kan steeds een grote hoeveelheid vloeistof. De Washi papier moet worden gesneden een trapezium met zeer bepaalde afmetingen, 0,3 mm en 0,7 mm breedte en 4-5 mm (a). Deze trapeziumvormige wordt ingebracht vanaf de 0,7 mm kant in het uiteinde van een 23 G injectienaald en kunnen ook gestabiliseerd door toevoeging van een insect pen, die gebogen is een V-vorm (b). C de Washi papier wordt transparant na blootstellingtot een vloeistof, waardoor het ideaal is voor dit experiment.

Figuur 8. Stimulatie van de proboscis op de vliegen met de Washi-lont. De Washi papier lont aan het uiteinde van een injectienaald wordt toegepast voor een moment met behulp van een joystick manipulator met een hand. De naald is via een slang naar een injector gemanipuleerd met de andere kant, voor opzuigen en afvoeren sucrose-oplossing.

Figuur 9. Representatieve resultaten. a, PER gedrag opgenomen via de CCD-camera geïnstalleerd op de stereomicroscoop. Vooraanzichten van een uitgehongerde vlieg met een uitgebreide slurf (pijlen) voor de stimulatie van de stimulatie en na stimulatie met een koord 100 mM sucrose waterige oplossing (pijlpunt). De verlichting wordt bereikt door een 491 nm laser gebruiktvoor GCaMP fluorescentie. b, sucrose-geïnduceerde GCaMP 3,0 respons in de motor neuron voor de gradenboog van het rostrum spier in het uitgehongerde toestand. Het bovenste paneel voor het stimuleren; het bodempaneel, onmiddellijk na de stimulatie. Schaal bar, 10 pm. C, Kwantificering van de sucrose-geïnduceerde GCaMP 3,0 reactie. De motor neuron reageert op een sucrose stimulans door een sterke toename van de fluorescentie, gevolgd door een herstel fase van enkele seconden aan de basislijn.