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Atamian, H. S., Roberts, P. A., Kaloshian, I. High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.. J. Vis. Exp. (61), e3629, doi:10.3791/3629 (2012).
के लिए बर्तन, assays संयंत्र धूप मिश्रण के रूप में एक कार्बनिक युक्त मिट्टी में एक ही बर्तन में टमाटर के बीज. 22-28 में एक ग्रीनहाउस में बनाए रखने के डिग्री सेल्सियस अंकुरण के बाद, एक बार एक सप्ताह की खाद डालना चमत्कार Gro के साथ.
अंकुरण के बाद लगभग दो सप्ताह, दो चरण सच पत्ती पर, अलग - अलग बर्तन (10 सेमी व्यास और 17 सेमी गहरे) बाँझ रेतीले मिट्टी युक्त रेत 90% और 10% कार्बनिक मिश्रण के साथ भर में seedlings के प्रत्यारोपण. धीमी गति से जारी उर्वरक Osmocote और 22-28 ° सी में एक ग्रीनहाउस में दो सप्ताह के लिए बनाए रखने के लिए जोड़ें. चमत्कार Gro के साथ सप्ताह में एक बार पौधों की खाद डालना जारी रखें.
स्क्रीन के लिए उच्च throughput, रेतीली मिट्टी में ट्रे में सीधे संयंत्र के बीज अंकुरण जब तक प्लास्टिक की चादर के साथ ट्रे कवर करने के लिए और के रूप में ऊपर बनाए रखने के. अंकुरण के बाद, जोड़ने इस धीमी रिलीज उर्वरक Osmocote के और चमत्कार Gro के साथ सप्ताह में एक बार खाद डालना.
2. अंकुर पाउच में लोबिया विकास
एसeeds या तो एक पेट्री डिश में अंकुरित कर रहे हैं, Kimwipe कागज के कई परतों के साथ लाइन, और पाउच के लिए अकेले का तबादला या थैली के कागज नाली में सीधे रखा और अंकुरित.
एक प्लास्टिक फांसी फ़ाइल, फ़ोल्डर प्रति फ़ोल्डर दो पाउच रखें, और एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में एक रैक में फ़ोल्डर्स की व्यवस्था. 25-28 के तापमान डिग्री सेल्सियस और 16 घंटे प्रकाश / 8 घंटे अंधेरे चक्र में बनाए रखा एक नियंत्रित वातावरण कक्ष में रैक जगह है. रैक एक ग्रीनहाउस में भी बनाए रखा जा सकता है, लेकिन एक पन्नी या कठोर कागज संयंत्र उपजी के दोनों पक्षों पर रैक पर रखा कवर की आवश्यकता होती है, कवक संक्रमण के लिए क्षमता को कम.
पानी रिवर्स असमस पानी के साथ प्रति दिन एक या दो बार पाउच. बोने के बाद 10 से 14 दिनों के बारे में, जब तृतीयक जड़ सुझावों के साथ एक पर्याप्त जड़ प्रणाली विकसित की है (चित्रा 1), seedlings के टीखाकरण के लिए तैयार हैं.
3. निमेटोड अंडे का निष्कर्षण
ई के निकालनासंक्रमित जड़ों से GGS हसी और बार्कर (1973) द्वारा विकसित प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है.
तीन से चार दिन पहले निमेटोड टीका, संक्रमित टमाटर जड़ों से निकालने रूट गाँठ निमेटोड अंडे के. अंडा निकासी शुरू करने से पहले, कार्य क्षेत्र में अच्छी तरह से गर्म पानी के साथ संक्रमण से बचने के धोने. इसके अलावा गर्म पानी में धो एक ब्लेंडर, दो बाल्टी, एक तार जाल समर्थन, रबर लकड़ी का हथौड़ा, 425 की तीन sieves, 90 और 25 माइक्रोन एपर्चर, एक स्नातक सिलेंडर और कैंची.
425, 90 और 25 माइक्रोन एपर्चर: निम्नलिखित क्रम में ऊपर से नीचे तक sieves हो चुकी है. अंडे तल पर 25 माइक्रोन चलनी पर एकत्र किया जाएगा. एक तार एक सिंक में समर्थित जाल पर sieves रखो. तार की जाली के तहत एक बाल्टी रख रन के माध्यम से समाधान इकट्ठा.
कट संक्रमित संयंत्र () की सबसे ऊपर है, inoculum के स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया और त्यागने. ध्यान से बर्तन से संयंत्र को हटा दें. एक प्लास्टिक की पानी की बाल्टी में सूई से जड़ों को धो लें. चलाने के के तहत आगे जड़ों कुल्लाNing के पानी जब तक मिट्टी के कणों को दूर जड़ों से धोया जाता है.
कट छोटे टुकड़ों में कैंची के साथ जड़ें. मुख्य जड़ के निपटान के.
एक ढक्कन के साथ एक बड़े प्लास्टिक जार में एक संयंत्र से जड़ें काट डाल, बस पर्याप्त रूप से 10% ब्लीच समाधान जोड़ने के लिए जड़ों को कवर करने के लिए और ढक्कन बंद करें.
2 मिनट के लिए जड़ों से युक्त जार हिला.
जार खोलने और शीर्ष चलनी पर जड़ों और एक एक misting नोक के लिए संलग्न नली से धो डालना. अच्छी तरह से धो जब तक सभी ब्लीच गंध चला गया है. एक लकड़ी का हथौड़ा का उपयोग sieves के पक्ष चलनी pores के clogging है से बचने के नल.
शीर्ष चलनी निकालें और दूसरे चलनी पर मलबे कुल्ला.
दूसरी चलनी निकालें और ठीक मलबा है, जो पिछले चलनी से अंडे, इकट्ठा. एक पानी की बोतल से एक सौम्य धारा के साथ, चलनी के एक तरफ करने के लिए मलबे चाल. मलबे और पानी की न्यूनतम राशि के साथ एक साफ बीकर में अंडे ले लीजिए.
चलनी एक बार पानी में एकत्र25 माइक्रोन बच गए सकता है कि किसी भी अंडे एकत्र चलनी के माध्यम से बाल्टी. पानी के साथ अच्छी तरह कुल्ला और एक ही बीकर में इकट्ठा.
शीर्ष चलनी से संयंत्र मलबे त्यागें और अच्छी तरह से दबाव पानी के साथ सभी तीन sieves धो लो. को छूने के रूप में यह ध्यान में लीन होना आकार विकृत हो सकता है sieves के जाल हिस्सा नहीं है.
4. अंडे सेने निमेटोड अंडे
लाइन Kimwipe कागज के कुछ परतों के साथ एक स्वच्छ धातु टोकरी और एक गिलास पेट्री डिश पर फिट है. टोकरी और पकवान के नीचे के बीच एक 1 सेमी की दूरी की अनुमति दें.
तार टोकरी में कागज पर निकाले निमेटोड अंडे डालो. पर्याप्त तरल जोड़ें ताकि तार टोकरी के नीचे पानी की सतह को छू लेती है लेकिन पानी में डूब जाता है नहीं है. कवर एक प्लास्टिक के ढक्कन के साथ शीर्ष.
पानी के वाष्पीकरण के लिए हर दिन की जाँच करें और पेट्री डिश में कुछ पानी है ताकि टोकरी के नीचे पानी छू जोड़ें. यह बाहर सुखाने से अंडे को रोकने जाएगा.
हर दूसरे दिन, वा जमाआतंकवाद है कि एक बीकर में पेट्री डिश से J2s हैं. अगर तुरंत इस्तेमाल नहीं है, कमरे के तापमान पर एकत्र inoculum वायुमिश्रण प्रयोगशाला हवा की आपूर्ति या हवा का एक मछलीघर पंप द्वारा उत्पन्न का उपयोग कर. 2 दिनों के भीतर वातित inoculum का उपयोग करें. J2s 6-8 दिनों की अवधि में अंडे सेने से एकत्र किया जा सकता है.
5. टमाटर बर्तन या ट्रे और संक्रमण के मूल्यांकन में रूट संक्रमण
एकत्र नेमाटोड के तीन aliquots का प्रयोग करने के लिए एक गिनती स्लाइड या पकवान में J2s की संख्या गिनती, औसत की गणना और टीका के लिए वांछित मात्रा का निर्धारण. आमतौर पर 3000 J2s संयंत्र के प्रति बर्तन और अंकुर ट्रे में बड़े पौधों के लिए 500 J2s में उपयोग किया जाता है.
कम गति पर एक चुंबकीय सरगर्मी प्लेट पर inoculum हलचल.
इससे पहले कि आप पौधों टीका लगाना, यह सुनिश्चित करें कि मिट्टी नम लेकिन गीला भी नहीं है. पॉट टीका के लिए, प्रत्येक टमाटर जड़ एक पेंसिल का उपयोग कर प्रणाली के आसपास रेत में आधा पॉट के बारे में गहराई के तीन छेद (चित्रा 2
ट्रे में उच्च throughput स्क्रीन के लिए, 5-मिलीलीटर एक pipetter साथ विंदुक टिप (चित्रा 3) मिट्टी में J2s देने के लिए सरेस से जोड़ा हुआ पक्षों पर छेद के साथ एक संशोधित सील टिप सुई का उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, नेमाटोड 5.3 चरण में के रूप में दिया जा सकता है.
24-27 में एक ग्रीनहाउस में पौधों का रखरखाव ° सी छह से आठ सप्ताह के लिए. चमत्कार Gro के साथ दो बार एक महीने की खाद डालना जारी रखें.
संक्रमण के मूल्यांकन के लिए, ध्यान से बर्तन से पौधों को हटाने और जड़ों (के रूप में 3.3 चरण में वर्णित) धोना.
अंडा 1 मिलीग्राम / एल erioglaucine है के में जड़ों को 15 मिनट के लिए, submerging द्वारा नीले जनता दाग.
कुल्ला पानी में जड़ों और व्यक्ति जड़ प्रणाली पर दाग अंडा जनता गिनती द्वारा मूल्यांकन. एक प्रबुद्ध डेस्क ताल अंडा जनता कल्पना में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
यदि जांच पौधों आगे जी के लिए आवश्यक हैंenetic अध्ययन, सबसे ऊपर है और मूल्यांकन के लिए जड़ों को धोने से पहले काट नहीं है. धुंधला हो जाना और अंडे जनता की गणना के बाद, कार्बनिक मिट्टी में seedlings के प्रत्यारोपण, सबसे ऊपर भारी छँटाई करने के लिए स्वेद को कम, और एक ग्रीन हाउस में बनाए रखने के.
6. लोबिया के पाउच और संक्रमण का मूल्यांकन में रूट संक्रमण
निमेटोड inoculum गिनती और एक चुंबकीय सरगर्मी प्लेट पर हलचल जैसा कि पहले बताया.
फ़ोल्डर्स और एक समतल सतह पर जगह फांसी से पाउच निकालें. 5 मिलीलीटर में 1500 J2s के के साथ प्रत्येक थैली टीका लगाना. थैली की प्लास्टिक कवर लिफ्ट और नेमाटोड जड़ों की सतह पर समान रूप से वितरित.
एक क्षैतिज स्थिति में टीका, काले कागज के साथ कवर करने के लिए प्रकाश बाहर के बाद 24 घंटे के लिए पाउच रखें, तो विकास कक्ष में फांसी फ़ोल्डर्स के लिए लौटने.
पानी के पौधों के रूप में की जरूरत है, आधे ताकत Hoagland समाधान (Hoagland और अर्नोन, 1950 के साथ एक या दो बार दैनिक,, 1 टेबल
लगभग 30 श्रेणी (28-35 दिन) दिन के बाद टीका, 75 erioglaucine मिलीग्राम / एल के बारे में 10-20 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक थैली दिखे. रंग के साथ एक क्षैतिज स्थिति में रात भर पानी भर गया पाउच रखें.
नाली के पाउच और एक प्रबुद्ध डेस्क ताल के तहत अंडा जनता की गिनती की जड़ प्रणाली का मूल्यांकन.
यदि जांच पौधों आगे आनुवंशिक अध्ययन या प्रजनन कार्य के लिए की जरूरत है, सावधानी से बर्तन में कार्बनिक मिट्टी में कागज प्रत्यारोपण से जड़ें खींच और एक ग्रीनहाउस में बनाए रखना.
7. प्रतिनिधि परिणाम
निमेटोड inoculations के लिए दो प्रणालियों के लिए वर्णित टमाटर और लोबिया पौधों की उचित चरणों के आंकड़े में दिखाया जाता है1 और 2. इसके अलावा, टमाटर और लोबिया की अच्छी तरह से संक्रमित जड़ों का उदाहरण 4 और 5 के आंकड़े में दिखाया जाता है. अधिकांश रोग प्रतिरोध स्क्रीन के रूप में, यह सलाह दी जाती है निमेटोड टीका के लिए कम से कम 6-10 जीनोटाइप प्रति पौधों का उपयोग करने के लिए संक्रमण की दर के औसत की गणना. पौधों के बीच नेमाटोड संक्रमण में रूपांतर, एक ही जीनोटाइप के, वर्दी संयंत्र के आकार और सही राशि और inoculum का वितरण का उपयोग करके कम किया जा सकता है.
ट्रे और विकास के पाउच के उपयोग के एक छोटे से वृद्धि अंतरिक्ष में पौधों के हजारों की सैकड़ों की स्क्रीनिंग के लिए सक्षम बनाता है. विकास के पाउच भी धोने जड़ों (चित्रा 4) के लिए कोई ज़रूरत नहीं के साथ तेज और कुशल रूट गाँठ नेमाटोड संक्रमण की गैर विनाशकारी मूल्यांकन की अनुमति देते हैं.
चित्रा 1. दो हफ्ते पुरानी लोबिया संयंत्र एक थैली में हो और Nema जड़ - गांठ के लिए तैयारटीका tode.
चित्रा 2. तीन टमाटर के पौधे सप्ताह पुरानी रूट गाँठ निमेटोड टीका के लिए तैयार.
चित्रा 3. एक संशोधित सुई और विंदुक टिप नेमाटोड का टीका उच्च throughput के लिए इस्तेमाल किया. एक सुई के नीचे सील किया गया था और छेद के तीन सेट, एक लेज़र बीम का उपयोग कर सुई में drilled किया गया. फिर, संशोधित सुई 5 मिलीलीटर विंदुक टिप करने के लिए सरेस से जोड़ा हुआ था.
एक अत्यधिक संक्रामक inoculum और समुचित विकास के चरण में पौधों का उपयोग कर की तैयारी: एक सफल निमेटोड स्क्रीन के लिए दो महत्वपूर्ण कदम हैं. रूट गाँठ निमेटोड अंडे का अंडे सेने की दर अत्यधिक चर और 5 के बीच पर्वतमाला है - 50%. इसलिए पक्षियों के बच्चे और अत्यधिक संक्रामक J2s के इष्टतम स्तर को प्राप्त करने के लिए करीब ध्यान अंडा निष्कर्षण और अंडे सेने की प्रक्रिया के लिए भुगतान किया जाना चाहिए. अंडे ब्लीच करने के लिए एक न्यूनतम समय अवधि के लिए उजागर किया जाना चाहिए और ब्लीच बाहर rinsed होना चाहिए जड़ मिश्रण अच्छी तरह से. जब अंडे सेने, अंडे युक्त घोल पानी में नहीं जलमग्न चाहिए. इसके अलावा, जहां रची किशोरों एकत्र कर रहे हैं अंतर्निहित पेट्री डिश में अंडे spilling के बचने के लिए. अंडे सेने की प्रक्रिया के दौरान अंडे spilling के से बचने के लिए एक तरह पानी सीधे Kimwipe के रूप में कागज टूट सकता है जोड़ नहीं है. इसके बजाय पानी सीधे जोड़ने पेट्री डिश.
सर्वोत्तम परिणामों के लिए, हौसले से रची J2s का उपयोग करें. यदि hatcघंटे दर कम है और अधिक inoculum की जरूरत है, J2s एक लंबी अवधि के लिए 15 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है. कमरे के तापमान पर संग्रहीत inoculum गर्म टीका से पहले नेमाटोड को पुनर्जीवित करने के लिए. हालांकि, J2s 15 में भी नहीं की दुकान है लंबे समय के लिए डिग्री सेल्सियस के रूप में भूखे J2s कुशलता को संक्रमित नहीं होगा.
युवा seedlings के रूट गाँठ निमेटोड टीका के लिए सबसे अच्छा विकास मंच हैं. हालांकि, यह पर्याप्त रूट प्रविष्टि के लिए J2s के अंक के रूप में जड़ सुझावों के लिए पर्याप्त संख्या में उपलब्ध कराने प्रणाली के गठन के साथ संतुलित होने की जरूरत है. इष्टतम संयंत्र विकास की स्थिति को बनाए रखने में भी स्क्रीन के लिए महत्वपूर्ण है. अधिक पानी संयंत्र विशेष पाउच में बड़े लोगों से बचें. पाउच से अधिक पानी है, के रूप में थैली के तल में पानी खड़ा संकेत, कवक विकास को बढ़ावा देने और जड़ स्वास्थ्य कम कर सकते हैं.
/ नेमाटोड संक्रमण के दोनों assays के आगे मूल्यांकन और अंडे / जड़ प्रणाली और अंडे की संख्या की गणना के साथ ग्राम freश जड़ प्रदर्शन किया जा सकता है. टमाटर assays के लिए, व्यक्तिगत जड़ों तौला और निकाले अंडे के रूप में वर्णित inoculum तैयारी (3 खंड) के लिए कर रहे हैं. जब संयंत्र नमूनों की बड़ी संख्या प्रसंस्करण, व्यक्तिगत जड़ प्रणाली अंडा निकासी के लिए एक ब्लेंडर का उपयोग में macerated किया जा सकता है. अंडे की संख्या कम से कम तीन aliquots में गिना जाना चाहिए और ताजा जड़ प्रणाली के अंडे / ग्राम गणना. थैली assays के लिए, जड़ प्रणाली से कागज डालने खींच लिया है, वजन, और अंडे निकाले.
Kaloshian प्रयोगशाला में अनुसंधान के खाद्य और कृषि के संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय संस्थान (2007-35607-17765) से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित है. रॉबर्ट्स प्रयोगशाला में अनुसंधान संयुक्त राज्य अमेरिका एजेंसी अंतर्राष्ट्रीय विकास के लिए अनुदान (GDG-G-00-02-+०००१२ 00 और EDH-00-07-+००००५ के) और कैलिफोर्निया सूखी बीन सलाहकार बोर्ड द्वारा वित्त पोषित है.
Ehlers, J.D., Matthews, W.C., Hall, A.E., & Roberts, P.A. Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea. Crop Sci.40, 611-618 (2000).
Hoagland, D.R. & Arnon, D.I. The water-culture method for growing plants without soil. Calif. Agric. Exp. Stn. Circ.347, (1950).
Hussey, R.S. & Barker, K.R. A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique. Plant Dis. Rep.57, 1025-1028 (1973).
Martinez de Ilarduya, O., Moore, A.E., & Kaloshian, I. The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid. Plant J.27, 417-425 (2001).
Matkin, O.A. & Chandler, P.A. The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants. Baker, K.F., ed., Calif. Agric. Exp. Stn.Manual 23, 68-85 (1957).
Omwega, C.O. & Roberts, P.A. Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature. Theor. Appl. Genet.83, 720-726 (1992).
Omwega, C.O., Thomason, I.J., & Roberts, P.A. A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita. Plant Dis.72, 970-972 (1988).
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ReplyPosted by: Edgar S.July 26, 2012, 10:30 AM