Morpholinos की में Regenerating वयस्क Zebrafish पूंछ फिन में vivo electroporation में

Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin. J. Vis. Exp. (61), e3632, doi:10.3791/3632 (2012).

1. Resuspend morpholino

1. Nuclease मुक्त पानी की 100 μl में fluorescein टैग morpholino के 300 एनएम पतला करने के लिए एक लगभग 3 मिमी समाधान. इस morpholino समाधान एकाधिक तेल सील microcentrifuge के ट्यूब में aliquoted जाता है और कमरे के तापमान पर और प्रकाश से दूर रखे.
2. सटीक morpholino एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए, 0.1 एन एचसीएल की 95 μl में morpholino समाधान के 5 μl (या एक खाली पानी के रूप में) पतला. पानी रिक्त के साथ 265 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर एक आधारभूत सेट और फिर पतला morpholino समाधान के पढ़ने का निर्धारण. अपने निर्धारित निरंतर द्वारा और मन्दन कारक द्वारा morpholino absorbance के गुणा एनजी / μl में एकाग्रता का निर्धारण. morpholino स्थिर के रूप में गणना की है:

   Morpholino निरंतर = morpholino एक्स 1000/molar absorbance के आणविक भार.

   आणविक और morpholino के लिए दाढ़ absorbance के वजन 'पर पाया जा सकता हैOligo गुण "उत्पाद के साथ प्रदान की चादर. Morpholino एकाग्रता, एनजी / μl, आणविक मिमी में एकाग्रता का निर्धारण वजन से morpholino पतला यदि आवश्यक हो, एक काम एकाग्रता के लिए, आम तौर पर 1.2 मिमी में विभाजित करते हैं.

2. फिन विच्छेदन

1. या तो Tricaine या टैंक पानी में 1.0 मिलीग्राम / मिलीलीटर में 2 - phenoxyethanol में वयस्क zebrafish असंवेदनता उत्पन्न करना.
2. एक बाँझ स्केलपेल या उस्तरा पहली lepidotrichial शाखाओं में बंटी बिंदु समीपस्थ ब्लेड का उपयोग पंख काटना. यह एक जानवर पर एक ही स्थान / समीपस्थ बाहर (जैसे सात बोनी पंख करधनी से बाहर क्षेत्रों) में किया जाना चाहिए. महत्वपूर्ण: जानवर के विमान / पूर्वकाल पीछे पूरी तरह से सीधा कटौती करने के लिए सुनिश्चित कर लें. Angled कटौती पृष्ठीय और ventral पंख का आधा की असमान पंख परिणाम में परिणाम देगा.
3. एक टैंक में मछली लौटें. हम आम तौर पर 33 में मछली बनाए रखने डिग्री सेल्सियस उत्थान की दर में वृद्धि करने के लिए. प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है, wपुलिन पंख उत्थान के लिए 0-2 दिनों के बाद विच्छेदन (DPA) के morpholino शुरू करने से पहले शुरू करने के लिए. वैकल्पिक दृष्टिकोण चर्चा में चर्चा कर रहे हैं, नीचे.

3. Morpholino इंजेक्शन

1. morpholino इंजेक्शन लगाने से पहले दिन, एक इंजेक्शन प्लेट (चित्रा 2). बाहर अच्छी तरह से है, जो microinjection प्रक्रिया के लिए मछली स्थिर करने में मदद करता है की एक अंत में एक पायदान में कटौती करने के लिए सुनिश्चित करें.
2. 2 DPA में, इंजेक्शन सूक्ष्म उपकरण और morpholino समाधान तैयार.
3. उचित एकाग्रता (1.2 मिमी के साथ शुरू करने की सिफारिश) और एक 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह fluorescein टैग morpholino 5 मिनट के लिए, पतला.
4. एक सुई डांड़ी का उपयोग सूक्ष्म इंजेक्शन के लिए कांच सुई खींचो.
5. Morpholino साथ सुई लोड (ध्यान दें: क्या आप वापस भरण या सामने लोड अपनी सुई निर्धारित करेंगे कि क्या आप सुई पहले लोड करने के लिए, या टिप पहले कटौती पर निर्भर करता है).
6. सुई में बंद टिप कटौतीपता कोण.
7. आपके इंजेक्शन सूक्ष्म प्रणाली के निर्देशों का पालन करने के लिए लगभग 5 morpholino प्रति इंजेक्शन nl बुलबुला इंजेक्षन. Morpholino की बड़ी मात्रा में ऊतकों को बाधित कर सकता है.
8. मछली और इंजेक्शन थाली पर जगह असंवेदनता उत्पन्न करना. सभी अतिरिक्त तरल और उपयुक्त स्थान पर सुई पूरबी, सिर्फ बोनी रे (चित्रा 3) के लिए बाहर निकालें. एक खुर्दबीन microinjection तंत्र के morpholino इंजेक्शन (विशिष्ट अभिकर्मकों की तालिका देखें) के लिए उपयुक्त का प्रयोग, पीछे पूर्वकाल से पंख में morpholino इंजेक्षन, के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया. पीछे से पूर्वकाल के लिए इंजेक्शन इंजेक्शन के दौरान रोल के लिए पंख ऊतक का कारण बनता है और बहुत मुश्किल है.
9. सुई धीरे पुनर्योजी ऊतक, सिर्फ प्रत्येक बोनी रे के लिए बाहर (चित्रा 3 में "1" के रूप में चिह्नित) में डालें और धक्का distally तक भ्रूण की गिलाफ में स्थित (चित्रा 3 में चिह्नित "2"). एन के माध्यम से सुई धक्का नहीं सावधान रहोटायर पंख. जब सुई सही ढंग से स्थानीय है, morpholino इंजेक्षन (यानी एक बार क्लिक करें). 1.2 मिमी, fluorescein टैग morpholino समाधान के पीले, हरे, सामान्य प्रकाश स्थितियों में भी प्रकट होता है. प्रत्येक इंजेक्शन के साथ, morpholino समाधान की एक पीला "कश" visualized किया जा सकता है, जो मदद करता है भ्रूण की गिलाफ इंजेक्शन स्थानीयकरण. Morpholino समाधान के लगभग 75 nl (10-15 क्लिकें) बोनी रे प्रति अंतःक्षिप्त किया जाना चाहिए. ~ रोकें 1 क्लिक के बीच सेकंड. हम केवल पृष्ठीय पक्ष सुई, है electroporation - केवल नियंत्रण के रूप में उदर का उपयोग. वैकल्पिक रूप से, एक फिन के उदर आधे पर नियंत्रण morpholino का उपयोग कर इस पूरे प्रक्रिया को दोहरा सकता है.

4. Morpholino की electroporation

1. Morpholino के इंजेक्शन के तुरंत बाद, इंजेक्शन - सूक्ष्म उपकरण से इंजेक्शन की थाली हटा. इंजेक्शन थाली संज्ञाहरण समाधान के साथ अच्छी तरह से जब तक मछली जलमग्न है भरें. electroporation पानी की लाइन के अंतर्गत किया जाता है.
<एक 3 मिमी व्यास प्लैटिनम थाली चिमटी से नोचना इलेक्ट्रोड (CUY चिमटी 650 - पी 3, प्रोटेक अंतर्राष्ट्रीय) ली के पंख लगभग एक आधा करने के लिए दालों localizes है. पंख ऊतक इलेक्ट्रोड को छू नहीं सावधान रहो. सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड पंख ऊतक को न छूने वाले, इसकी पृष्ठीय पक्ष पर मछली बारी बारी से और electroporation के लिए midline नीचे सीधे देखो.
2. Electroporate दोनों पृष्ठीय और ventral पंख के पक्ष एक CUY21 स्क्वायर वेव Electroporator (Protech इंटरनेशनल इंक,) का उपयोग कर (एक गैर विशिष्ट electroporation प्रभाव को नियंत्रित करने के लिए). प्रत्येक electroporation का गठन हो सकता है कि किसी भी बुलबुले को हटाने के बाद एक नम KimWipe के साथ इलेक्ट्रोड साफ कर लें. यदि वे नहीं हटा रहे हैं एक मिनी प्रभारी बनाता है, जो इलेक्ट्रोड की ओर के ऊतकों को आकर्षित करेगा. electroporation मापदंडों लगातार दस 50 मिसे दालों में दालों के बीच एक 1 सेकंड ठहराव के साथ 15 वी पर सेट किया जाना चाहिए.
3. एक गिलास स्लाइड या पेट्री डिश और जल्दी पंख छवि पर मछली रखें, n करने के लिए सुनिश्चित करने केपृष्ठीय / ventral अभिविन्यास OTE. यह छवि निम्नलिखित दिन पर regrowth के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. टैंक मछली लौटें.

5. विश्लेषण

1. यदि लक्षित प्रोटीन है कि अभिव्यक्ति में नीचे गिरा दिया गया था उचित पंख उत्थान के लिए आवश्यक है, फिन के पृष्ठीय और ventral halves के बीच एक नाटकीय अंतर स्पष्ट होना चाहिए एक दिन बाद electroporation (चित्रा 5 ब).
2. 3 DPA में, प्रत्येक मछली के पंख की एक और तस्वीर ले और इसी 2 DPA छवि (चित्रा 5 ब) के साथ इस छवि को मैच. पंख pigmentation के पैटर्न में पशुओं के बीच प्राकृतिक विभिन्नता आप सही व्यक्ति मछली की पहचान करने की अनुमति देगा.
3. एनआईएच छवि का प्रयोग, दोनों पृष्ठीय और ventral आधा (चित्रा 5 ब) 2 DPA और 3 DPA क्षेत्रों का पता लगाने.
4. पृष्ठीय बनाम ventral निम्न सूत्र का उपयोग% क्षेत्र निर्धारित: _(2dpa पृष्ठीय पृष्ठीय _{3dpa है)} / (ventral _3dpa Ventral) _2dpa एक्स =% क्षेत्र 100

6. प्रतिनिधि परिणाम

1. हम 3 DPA, या 24 HPE (घंटे के बाद electroporation) में हमेशा पंख परिणाम के लिए परख. इस समय, morpholino fluorescein टैग पृष्ठीय पंख के आधे (पूरक चित्रा 1 और चित्रा 6A) में मौजूद होना चाहिए. यह सामान्य है कुछ विच्छेदन के स्तर के नीचे अनुगामी.
2. इंजेक्शन और नियंत्रण morpholinos (चित्रा 6B) के साथ electroporated पंख में पृष्ठीय और ventral पक्षों के बीच कोई अंतर नहीं होना चाहिए.
3. यदि प्रयोगात्मक morpholino पंख परिणाम के लिए आवश्यक प्रोटीन लक्ष्य, पृष्ठीय और ventral पक्षों के बीच एक नाटकीय अंतर (6C चित्रा) मनाया जाना चाहिए.
4. यदि इलेक्ट्रोड electroporation के दौरान पंख छुआ, ऊतक (लगभग उपस्थिति में जला) भूरे रंग और परिगलित दिखाई देगा.

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चित्रा 1 विभिन्न घटनाओं है कि पंख उत्थान के दौरान होने के योजनाबद्ध. प्रत्येक घटना के लिए अंतर्निहित समय के बाद विच्छेदन (hPa) घंटे में दिया जाता है और 33 के एक टैंक के तापमान के अनुरूप डिग्री सेल्सियस

चित्रा 2 ए. योजनाबद्ध का इंजेक्शन प्लेट, जो agarose से बना है और एक अच्छी तरह से छोटे के morpholino की microinjection दौरान मछली पकड़ शामिल हैं.

चित्रा 3 morpholino microinjection योजनाबद्ध. ए प्लेस निशान में मछली के सिर के साथ पकवान में मछली अच्छी तरह से है, जो मछली स्थिर रहने में मदद मिलेगी की कम बढ़ाई. कटौती बी, सुई की व्यवस्था इतनी है कि यह फिन के regenerating ऊतक के करीब है सी..

चित्रा 4 फिन electroporation की योजनाबद्ध. ए microinjection के बाद, संज्ञाहरण के एक पेट्री डिश में मछली जगह और दोनों पृष्ठीय और ventral आधा electroporate बी पंख ऊतकों को छूने नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें. इलेक्ट्रोड ~ ऊतक से 1 मिमी रखा जाना चाहिए.

ए 2 DPA या तो तुरंत पहले या बाद में, morpholino इंजेक्शन और electroporation में एक मछली के पंख की एक तस्वीर ले लो. दोनों पृष्ठीय (हरा) और 3 DPA में एनआईएच छवि, (काली धराशायी लाइनों) बी. का उपयोग फिन के उदर (नीला) आधा पुनर्योजी ऊतक ट्रेस करने के लिए, प्रत्येक पंख की एक और तस्वीर ले और फिर पृष्ठीय और ventral क्षेत्रों का पता लगाने एनआईएच छवि का उपयोग कर regrowth की सी 2 DPA में दोनों पृष्ठीय और ventral अमीर के लिए 3 DPA में कुल regrowth के से पुनर्वृद्धि के क्षेत्र घटाएँ. पृष्ठीय बनाम उदर फिर से वृद्धि का प्रतिशत क्षेत्र सूत्र का उपयोग कर परिकलित किया जा सकता है: _((3dpa डी - डी _{DPA 2)} / वी _(3dpa - _2dpa वि)) 100 एक्स. प्रतिशत = 100 निषेध प्रतिशत क्षेत्र.

चित्रा 6 उम्मीद का उदाहरणपरिणामों ए प्रतिदीप्त छवि फिन के धर्तलीय छमाही में एक fluorescein टैग नियंत्रण morpholino दिखा, 24 घंटे एक पंख है कि इंजेक्शन और पृष्ठीय छमाही में एक नियंत्रण morpholino साथ electroporated (HPE) के बाद electroporation. बी Brightfield छवि . छवि एक पंख, 24 HPE के दोनों पृष्ठीय और ventral halves के बराबर regrowth के सी. Brightfield एक पंख है कि इंजेक्शन और पृष्ठीय छमाही में एक प्रयोगात्मक morpholino साथ electroporated की छवि से पता चलता है. छवि regrowth की ओर / पृष्ठीय इंजेक्शन पर निषेध से पता चलता है. लाइन 2 DPA, तुरंत morpholino इंजेक्शन और electroporation से पहले regrowth की राशि से पता चलता है.

7 चित्रा एक वैकल्पिक इंजेक्शन और electroporation प्रक्रिया के लक्ष्य प्रोटीन के लिए घाव भरने और कोशिकागुच्छ गठन में शामिल योजनाबद्ध ए. Morpholino इंजेक्षनफिन के धर्तलीय आधे पर प्रत्येक बोनी पंख रे के बीच बी सामान्य प्रति के रूप में morpholino Electroporate. सी. तुरंत इंजेक्शन साइट के लिए समीपस्थ (~ 1 बोनी खंड) पंख काटना डी. fluorescein टैग morpholino मनाया जा सकता है. घाव और 24 HPE पर उपकला ब्लास्टेमा में.

फिन के 24 इंच पर एक पंख है कि इंजेक्शन किया गया था और एक नियंत्रण morpholino साथ electroporated तुरंत विच्छेदन के लिए पहले के 8 चित्रा घाव उपकला और कोशिकागुच्छ के गठन को लक्षित करने के लिए तकनीक का प्रयोग. ए Brightfield छवि. बी प्रतिदीप्त छवि पैनल ए नोट में दिखाया कि फिन के इंजेक्शन पृष्ठीय आधा पुनर्योजी ऊतक में morpholino अच्छा तेज से पता चलता है. सी - पैनल में दिखाया फिन के पृष्ठीय छमाही के सी "उच्च बढ़ाई ए और बी के इंजेक्शन साइटों अक्सर अभी भी दिखाई (तीर), लेकिन कई लक्षित कोशिकाओं घाव उपकला और ब्लास्टेमा गठन (तीर) में भाग लेने चले गए.

9 चित्रा तकनीक का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं है कि फार्म के लिए विस्थापित ब्लास्टेमा ए. प्रतिदीप्त और brightfield इनसेट एक इंजेक्शन और दोनों पृष्ठीय और ventral आधा पर morpholino साथ electroporated पंख छवियाँ दिखा लक्ष्य. पंख तो दो विमानों को काट गया था. पृष्ठीय 1/2 तुरंत इंजेक्शन साइटों के लिए बाहर कट गया था, जहां के रूप में उदर आधे 9-10 बोनी इंजेक्शन साइटों के लिए बाहर का क्षेत्रों से कट गया था 24 इंच से कम बी, फ्लोरोसेंट और brightfield इनसेट छवियों चलता है कि morpholino पृष्ठीय चले गए है (1) का संकेत है, लेकिन है कि केवल तुरंत कटौती साइट के लिए समीपस्थ सेल ब्लास्टेमा गठन में भाग लेने नहीं उदर (2) पुनर्जन्म, पुनर्जन्म. सफेद तीर के दो सेट प्रत्येक विच्छेदन के स्तर दिखाविमान. पैनलों छवि के दूर सही पर 1 और 2 के रूप में चिह्नित एक उच्च पृष्ठीय और ventral पंख के हिस्सों में बढ़ाई दृश्य दिखाने के लिए, क्रमशः.

पूरक चित्रा 1 ब्लास्टेमा का एक पंख इंजेक्शन और एक नियंत्रण morpholino साथ electroporated में स्थान के लिए इसी क्षेत्र की एक confocal z-ढेर का एक वीडियो. छवि 24 HPE में लिया गया था. के बाद से एक एक fluorescein अणु के कल्पना नहीं हो सकता है, नहीं morpholino की सभी कल्पना या मात्रा हो सकता है. हालांकि, इन छवियों तेज की डिग्री बदलती है कि व्यक्ति कबरा डॉट्स से कोशिकाओं को पूरे फ्लोरोसेंट morpholino भरा कोशिकाओं, में visualized किया जा सकता है के कुछ विचार दे. अभी भी छवि पर अभिविन्यास दिखाया गया है. स्केल पट्टी: 25 microns.

यहाँ, हम वयस्क zebrafish में पंख उत्थान के दौरान एक शक्तिशाली नुकसान के समारोह सशर्त पछाड़ना प्रोटीन के हित के लिए दृष्टिकोण का वर्णन. इस तकनीक के अंतराल जंक्शन जीनों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, पुनर्योजी पंख ^{16 परिणाम, 20-22 के} दौरान रिसेप्टर्स, प्रतिलेखन कारक, और microRNAs संकेत.

हम आशा करते है कि इस तकनीक को भी तकनीक आदत डाल द्वारा घाव चिकित्सा और कोशिकागुच्छ गठन के लिए आवश्यक जीन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हम इंजेक्शन और पंख की पृष्ठीय आधे पर बोनी पंख किरणों के बीच अंतरिक्ष में एक नियंत्रण morpholino विच्छेदन के लिए पूर्व electroporated (चित्रा 7). हम तो तुरंत इंजेक्शन विमान के लिए बाहर का पंख काट. 24 इंच, हम ने कहा कि morpholino लक्षित कोशिकाओं distally दोनों घाव उपकला और कोशिकागुच्छ के (चित्रा 8) के रूप में चले गए थे, यह दर्शाता है कि उत्थान के इन प्रारंभिक दौर के दौरान कोशिकाओं को भी Targ किया जा सकता हैeted.

तकनीक कुछ उल्लेखनीय सीमाओं है. उदाहरण के लिए, fluorescein टैग से प्रतिदीप्ति immunohistochemistry, जो बनाता है यह किसी कक्ष में वर्तमान morpholino की राशि के साथ असंभव एक विशेष सेलुलर फेनोटाइप (यानी सेल प्रसार) सहसंबंधी के लिए निम्नलिखित निर्धारण और प्रसंस्करण नहीं जारी रहती करता है. इसके अलावा, हम लगातार उत्थान पूंछ पंख में plasmids के electroporation को प्राप्त करने में असमर्थ किया गया है, हालांकि पिछले एक समूह पंख ²³ ऊतकों में डीएनए के सफल electroporation रिपोर्ट किया था. अंत में, हम उल्लेख किया है कि morpholino ~ 48 के बाद ²¹ electroporation, जो नए सेल प्रकार के भेदभाव में शामिल जीन के परीक्षण के लिए अपने वर्तमान रूप में इस तकनीक का उपयोग करते हुए प्रतिबन्धित घंटे के लिए ही प्रभावी है. अतिरिक्त परीक्षण और प्रक्रिया के संशोधन इन वर्तमान सीमाओं को पार कर सकते हैं.

इसके अलावा, यह संभव है कि इस तकनीक का इस्तेमाल किया जा सकता हैसेल अंतर्निहित ऊतक से भ्रूण की गिलाफ प्रवास में शामिल प्रोटीन का परीक्षण करने के लिए. उदाहरण के लिए, हम इंजेक्शन और पंख के दोनों पक्षों (7 चित्रा में वर्णित) विच्छेदन के लिए पूर्व में एक नियंत्रण morpholino electroporated. हम तो तुरंत इंजेक्शन विमान से बाहर पंख के पृष्ठीय आधा काट और हम उदर पंख और अधिक distally से काट. 24 इंच पर पृष्ठीय पक्ष पर morpholino पॉजिटिव कोशिकाओं overlying घाव उपकला और कोशिकागुच्छ के इंजेक्शन स्थल से चले गए थे. हालांकि, कि उदर पक्ष (9 चित्रा) पर मामला नहीं था. यह विचार है कि केवल कोशिकाओं कि विच्छेदन विमान आबाद पुनर्योजी प्रतिक्रिया में भाग लेने का समर्थन करता है. ये आंकड़े यह भी बताते हैं कि इस तकनीक का उपयोग करने के लिए सेल प्रवास के लिए आवश्यक हो धारणा प्रोटीन परीक्षण किया जा सकता है.

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

लेखकों Zebrafish अनुसंधान कर्मचारियों के लिए उनके और zebrafish की देखभाल और रखरखाव के लिए Freimann जीवन विज्ञान केंद्र और केंद्र का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं.

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