Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

1. Set-up antes da colheita

1. Para gerar filhotes de pré-natal para a colheita neurônio, agendar cruzamento entre camundongos adultos de 19 dias antes do dia de isolamento do neurônio. (C57BL / 6 idades de 2-8 meses, foram usados ​​em acasalamentos para efeitos de desenvolver este protocolo). Acasalamento bem sucedida pode ser confirmado por detecção de um rolhão vaginal na confirmação palpitação, fêmea ou visual da gravidez.
2. O dia antes do isolamento do neurônio:
   1. Para aplicações de imunofluorescência, lamelas de vidro em revestimento de uma placa de 24 cavidades com uma camada leve de 03:01 Collagen 1, cauda de rato: poli-D-Lisina solução.
   2. Para aplicações de cultura de células, o revestimento de tamanho apropriado do tecido utensílios de plástico de cultura com uma camada leve de 3:1 Collagen 1, cauda de rato: poli-D-Lisina solução.
3. Descanse as placas descobertos em uma capa de cultura de tecidos sob a luz UV durante a noite.
4. Lavar as placas com Hank estéril de Solução Salina Equilíbrio (HBSS) antesde usar. Placas revestidas podem ser preenchidos com HBSS e armazenado até uma semana a 4 ° C no escuro.

2. Colheita de Tecidos

1. A esterilidade é sempre um fator quando crescer culturas celulares primárias e, como tal, o maior cuidado deve ser exercido para garantir o ambiente mais estéril possível. Com muita atenção à técnica estéril, dissecção inicial e colheita de tecido neural para este protocolo pode ser concluído fora de uma câmara de fluxo laminar com um risco mínimo de contaminação. Após a colheita inicial, todas as etapas subsequentes devem ser realizados sob condições estéreis máximos dentro de uma capa classificado para cultura de células.
2. Euthanize um rato grávida de aproximadamente 19 dias pós-fertilização por decapitação. A utilização de anestesia a eutanásia a fêmea grávida não é recomendada como anestesia é conhecido por causar a morte das células do cérebro (Stratmann, et al., 2010). Usando estéreis tesoura de dissecção e pinças, criar uma abertura no lado ventral domouse para revelar completamente cavidade do corpo. Os instrumentos podem ser esterilizados com álcool e uma chama aberta.
3. Filhotes de pré-natal será localizado para a parte posterior da cavidade do rato corpo e devem ser facilmente visíveis no útero. Com uma pinça estéril, autoclavada, abra o útero e remover filhotes. Decapitar filhotes com novas tesouras estéreis e cabeça no lugar removido gaze estéril sob um microscópio de dissecação. Estéreis, instrumentos autoclavados pode ser chama limpa utilizando álcool e uma chama aberta antes e durante a utilização.
4. Com uma tesoura estéreis ou crânio, bisturi aberto de filhote de trás do pescoço até o nariz. Este procedimento pode normalmente ser completado com a inserção uma ponta da tesoura dentro do forame vertebral e, em seguida, proceder anteriormente. Retire cuidadosamente o cérebro inteiro com uma pinça. Coloque o cérebro em gaze estéril. Usando um bisturi estéril, remover o cerebelo e incisão para baixo da linha média do cérebro para separá-lo em dois hemisférios (Figura 1) .
5. Segure uma pequena seção de meninges em torno do hipocampo com pinças esterilizadas e puxe-o suavemente para longe. Embora não seja estritamente necessário para remover as meninges antes de isolar o hipocampo, a presença das meninges pode fazer a dissecção do hipocampo mais difícil devido à dureza da membrana. Em ambos os casos, o hipocampo será mais claramente visível após as meninges foram removidos. O hipocampo é uma estrutura curva que se inicia na parte distal do hemisfério e se dobra ventralmente (Figura 2). Como o interior, lado, côncava (caudal) está enfrentando um ventrículo, já é livre. Portanto, para isolar o hipocampo, uma precisa para cortar ao longo do lado exterior convexa. Após a dissecção, levantar delicadamente cada hipocampos com uma pinça estéreis e de transferência em um pequeno prato de cultura de tecido com aquecidos (37 ° C) HBSS sob uma capa de cultura de células. O tecido do cérebro podem ser combinados a partir de filhotes de múltiplas.

1. Usando um bisturi estéril, o tecido cerebral suavemente mince em 3 ml de HBSS estéril num prato de cultura 100 milímetros de Tecido.
2. Transferir o tecido picadas e HBSS para um tubo de 15 ml. Adicionar 1,5 ml de HBSS e 0,5 ml de solução de tripsina a 0,25% para um volume total de 5 ml.
3. Cap e inverter suavemente o tubo 4-5 vezes para misturar. Tentar evitar a produção de bolhas como ADN libertado a partir do tecido digerido irá aderir às bolhas e fazer com que o tecido picada para flutuar em vez de assentar no fundo do tubo (Figura 3).
4. Incubar tecido do hipocampo a 37 ° C durante 15 minutos, invertendo o tubo como acima cada 5 minutos.
5. Permitir que o tecido a assentar no fundo do tubo.
6. Cuidadosamente remover o excesso de solução utilizando uma pipeta estéril, deixando o tecido não perturbada no fundo do tubo.
7. Lavar tecido pelete com 5 ml de HBSS a 37 ° C durante 5 minutos. Repita um total de 3 vezes. Permita que o tecido completamente resolverpara a parte inferior do tubo de cada vez, antes de prosseguir para o passo de lavagem seguinte.
8. Remover a lavagem final a partir do tecido pelete e substituir com 2 ml de HBSS frescos.

4. Neuron trituração

1. Antes de iniciar os passos trituração, você vai precisar para preparar fogo pipetas Pasteur polidas. Usando um queimador Bunson, mantenha uma estéril 9 polegadas pipeta de Pasteur ponta (Figura 4a) na chama até diâmetro da abertura da pipeta é de aproximadamente 0,5 mm de tamanho e arestas da abertura pipeta foram arredondados ligeiramente (Figura 4b). Permitir pipeta para esfriar completamente antes de iniciar o processo de trituração.
2. Usando um normal estéril 9 polegadas pipeta de Pasteur, suavemente triturar o tecido um total de 7 vezes. Pedaços maiores de tecido são normais neste ponto e deve ser deixada em repouso para o fundo do tubo antes de se mudar para o passo seguinte.
3. Transferir o sobrenadante para um novo tubo estéril 50 ml.
4. Permitir que todos os restantes pedaços maiores de tecido para assentar no fundo do tubo e combinar o sobrenadante com o sobrenadante anterior para um total de 4 ml dissociadas de células neuronais.

5. Plating célula

1. Contar as células dissociadas utilizando um hemocitómetro.
2. Como regra geral, uma vez que os números de células foram determinados, subtrair 20% a partir de número final em conta qualquer morte celular que pode ocorrer após o plaqueamento.
3. As células podem ser revestida usando as recomendações abaixo:
   Para lamelas em uma placa de 24 poços - 6 x 10 ⁴ células / poço em 0,5 ml
   Para 60 mm placas de cultura de tecidos - 4 x 10 ⁵ células / placa em 3 ml
   Para 100 mm placas de cultura de tecidos - 6 x 10 células / placa ^{de 6} em 6 ml
4. Misture o número de células apropriadas com o volume indicado de meios seletivos Neurobasal (NeurobasalMeios contendo B27 suplemento [1 ml / 50 ml], solução 0,5 mM de glutamina, 25 mM de glutamato (Mr 147,13 g / mol), penicilina (10.000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 ug / ml) [uL 250/50 ml] , 1 mM de HEPES (Mr 238,3 g / mol), 10% de calor cavalo inactivado Dador de soro) e adicionar as células a placas. Placas redemoinho suavemente para distribuir uniformemente as células. HI-Dador de soro de cavalo é adicionada aos meios sólidos para enriquecer as células durante as primeiras 24 horas de crescimento. As células são subsequentemente desmamados a partir do soro e devolvido a um ambiente isento de soro por redução de série do soro em cada substituição meios de comunicação. Deve também ser notado que, enquanto o glutamato em concentrações mais elevadas é tóxico para as culturas de células neuronais, nas concentrações mais baixas adicionado aqui, ela vai inibir a ligação de células não-neuronais ^11. No entanto, só devem ser adicionados aos meios de comunicação de revestimento para as primeiras 24 horas de cultura e subsequentemente deixada de fora de quaisquer meios de alimentação para prevenir a neurotoxicidade das células.
5. Place neurónios a 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora durante a noite.
6. Remover metade do volume dos meios de comunicação a partir das células e substituir com o mesmo volume de meios de alimentação Neurobasal (Media Neurobasal contendo B27 suplemento [1 ml / 50 ml], solução 0,5 mM de glutamina, penicilina (10.000 unidades / ml) / estreptomicina (10.000 ug / ml) [250 ul / 50 ml], 1 mM de HEPES (Mr 238,3 g / mol).
7. Neurónios devem ser alimentados a cada 4 dias através da remoção da metade dos meios de idade e substituindo-o com o mesmo volume de frescas meios de alimentação Neurobasal. Processos neuronais deve começar a ser visível no dia 1 (Figura 5a) e tornar-se prevalente por dia 10 (Figura 5b).

6. Os resultados representativos

A capacidade de crescer e cultura células primárias neuronais tornou-se uma parte indispensável da neurociência. As culturas primárias permitem ao pesquisador analisar específicos celulares, modificação química e tratamento, alvo loclização e padrões de crescimento em um ambiente controlado. Muitos destes procedimentos utilizar metodologia sofisticada para visualizar mudanças específicas na respostas de células. Neste caso, neurónios do hipocampo são usados ​​para estudar específicas vias neuronais que seria difícil, se não impossível para analisar no cérebro intacto. Preparação de perto de populações homogéneas de neurónios de áreas específicas do cérebro é crítica para estudar a função cerebral. Efeitos moleculares nos neurônios individuais podem ser um instrumento para delinear as vias de ordem superior, como a memória ou aprendizagem. Como este protocolo produz culturas relativamente puras de neurónios do hipocampo, sem a necessidade de uma camada alimentadora de células gliais, estes neurónios são facilmente utilizadas para estudos de imunofluorescência. No entanto, como com toda a cultura primária de órgãos contendo vários tipos de células, alguma contaminação por células menos desejados podem ocorrer. No isolamento de células neuronais, a contaminação por células gliais pode ser um problema comum. As células da glia cum ser facilmente detectadas após visualização microscópica da cultura como sua morfologia difere significativamente dos neurónios alvo (Figura 6). O impacto da contaminação de células gliais dependerá da utilização prevista das culturas. Se as células estão sendo usados ​​de imuno-fluorescência exame, a contaminação glial pode ser nada mais do que uma inconveniência ao tentar fotografar os neurônios individuais. No entanto, se as culturas neuronais são para ser utilizadas para a análise bioquímica, qualquer contaminação significativa por células gliais poderia causar grandes alterações nos resultados. Formas de lidar com a contaminação das células da glia são descritos mais detalhadamente na discussão.

Uma vez que os neurónios foram isolados com sucesso e crescidas em cultura, uma aplicação típica é examinar processos celulares imuno-fluorescência técnicas. Como ilustrado na Figura 7, organelos, tais como as mitocôndrias, podem ser coradas utilizando corantes vitais adicionados aos meios de cultura antes de fixaration. Endógenos proteínas celulares pode ser visualizada a partir de células fixas, utilizando imuno-fluorescência padrão técnicas (Figura 8). Uma vez que as células neuronais são fixos, anticorpos específicos para proteínas de interesse pode ser introduzida para a célula e estas proteínas podem ser visualizada utilizando um microscópio de fluorescência. Neurônios cultivados também fornecer o pesquisador com os meios para examinar os efeitos individuais de proteínas sobre as funções neuronais. Utilizando uma variedade de técnicas, incluindo transfecções de DNA, electroporação ou transdução virai, as proteínas podem ser superexpresso em células neuronais (Figura 9). Como neural células respondem aos efeitos do excesso de proteínas expressas podem ter consequências diretas sobre como o cérebro pode responder e oferece a possibilidade de identificar alvos celulares para os tratamentos com medicamentos. Os detalhes destes tipos de experiências de ir para além do âmbito do presente documento, mas eles não ilustram que as culturas preparados por esta técnica são adequados para uma grande variedade de baixo-saplicações TREAM. No entanto, a simplicidade global deste protocolo, bem como, o período de tempo curto necessário para preparar estas culturas neuronais tornar este um método ideal para utilização em hoje neurociência laboratório.

Figura 1. Dissecção do cérebro do rato pré-natal. A primeira incisão é baixo da linha média do cérebro separando-o em dois hemisférios.

Figura 2. Localização do hipocampo do cérebro do rato pré-natal. O corpo estriado é movido para o lado para visualizar o hipocampo e é conhecido pelo "feijão" curva estrutura do tipo na região distal de cada hemisfério.

Figura 3. Dissociação de tecido do hipocampo em solução de tripsina.

Culturas de hipocampo têm sido utilizados em biologia molecular para mais de 20 anos. Embora, em princípio, culturas neuronais pode ser feito de qualquer parte do cérebro, as culturas de hipocampo provaram ser os mais populares devido à arquitectura relativamente simples da população de células nervosas no hipocampo ^7. Culturas do hipocampo são normalmente feitas de fase final de tecido embrionário. Este tecido é mais fácil para dissociar e contém menos células gliais do que o faz o tecido cerebral madura ^1. Isolamento de neurónios do hipocampo de tecido embrionário também diminui o dano de cisalhamento para axónios e dendritos devido a menos contactos de adesão ^3. Enquanto as culturas de hipocampo são mais frequentemente gerada a partir de ratos, devido ao isolamento relativamente mais fácil do hipocampo, os ratinhos também pode ser usado com os mesmos protocolos se o cuidado apropriada é feita durante o isolamento do tecido. Uma vez que os neurônios são cultivados, a capacidade de utilizar avançadas técnicas moleculares para analisar l subcelularocalization e tráfico podem ser empregadas. Isto pode ser especialmente vantajosa quando se analisam embrionárias letais ratinhos transgénicos uma vez que fornece a capacidade para estudar as interacções de proteínas que possam resultar na morte do embrião.

O hipocampo tem sido implicado em ambos aprendizagem espacial e contextual ⁵ e ⁶ de memória. Crescimento de culturas primárias do hipocampo pode permitir uma correlação entre subcelulares eventos biológicos e seus efeitos sobre a capacidade do cérebro de aprender e lembrar.

Tal como com todas as células neurais, neurónios cultivados a partir de culturas de hipocampo requerem factores de crescimento, hormonas críticos e aminoácidos. No cérebro, estes factores são fornecidos por células gliais. Esta relação simbiótica pode também ser realizada em um ambiente de cultura pelo crescimento de um "alimentador" camada de células da glia, juntamente com os neurónios em cultura. No entanto, as células gliais também produzem fatores citotóxicos durante sua vida útil ¹¹ which podem ser tóxicos para os neurônios em cultura. Para evitar isto, os neurónios foram cultivados em meios isentos de soro, tais como meio Neurobasal suplementado com B27. O suplemento B27 é otimizado para a sobrevivência de neurônios do hipocampo, mas vai apoiar o crescimento de outras culturas neuronais, bem ^4. L-glutamina é um aminoácido essencial para produção de energia e síntese de proteínas em cultura de células. No entanto, a glutamina pode ser lábil ao longo do tempo, degradar em amoníaco e derivados de ácidos carboxílicos, uma vez adicionado ao meio de cultura. Glutamax, um suplemento de cultura de células a partir de Invitrogen, pode ser utilizado como um substituto directo para L-glutamina, se desejado. Glutamax é mais estável em meios mas ligeiramente mais caro. Crescimento de neurónios em meios isentos de soro permite o estudo dos efeitos de factores de crescimento e hormonas sobre o crescimento e diferenciação neuronal.

Nós submetemos um protocolo para o isolamento rápido de neurônios do hipocampo de embriões de camundongos pré-natal, usando a mídia Neurobasal eo supplem B27ent para o crescimento de neurónios em um ambiente livre de soro, sem a utilização de células de alimentação. Como com todas as culturas de protocolos de células primárias, é vantajoso minimizar o crescimento de tipos não-desejado de células (ie células gliais). Isto é mais facilmente conseguida por dissecação cuidadosa do hipocampo de circundante regiões do cérebro. Células pré-natal também conter um número relativamente pequeno de células gliais ajudando neste objetivo. No entanto, a contaminação de células gliais ainda podem ocorrer. É possível para reduzir a contaminação de células gliais, por tratamento com citosina arabinósido (AraC) em pontos de tempo iniciais na cultura ^8,9. AraC pode ser usado como um agente anti-mitótico para reduzir a população de células não-neuronais capazes de síntese de DNA. No entanto, para evitar possíveis efeitos tóxicos do tratamento sobre os neurónios, ele deve ser usado no seu mais baixo faz eficaz (5 uM) e não adicionado após 3-4 dias de cultura ^11. Outra opção seria a utilização de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR) tratamento de dezembrorease a proporção de células fibroblásticas-reactivas células microgliais ^10.

Uma vez colhido, o tecido do hipocampo pode ser tratada com uma solução de tripsina para dissociar diluído / desagregar as células aderentes. No entanto, a exposição prolongada a concentrações mais elevadas de tripsina pode ser prejudicial para a subcultura de células assim que o tempo em solução de tripsina é mais frequentemente limitada entre 3-5 minutos. A concentração diluída de tripsina utilizada neste protocolo não permite maior tempo de incubação da enzima para aumentar a dissociação celular individual, mas deve ser tomado cuidado de respeitar estritamente os pontos de tempo previstos. A papaína pode ser usado como uma enzima alternativa e tem sido demonstrado ser mais eficaz e menos destrutiva com determinados tecidos, tais como neurónios retinais ^10.

Dissociação celular é seguido por trituração do tecido. Isto tem provado ser o passo mais importante na cultura neuronal consistente e é destaque por dois poin importantets. Em primeiro lugar, duas pipetas de Pasteur estéreis são utilizados durante este processo. A primeira é usada para interromper grosseiramente tecido / associação celular. O tamanho de abertura deste pipeta primeiro deve estar entre 1,0-1,5 mm. A seleção cuidadosa de pipetas diretamente do pacote fornecedor geralmente pode resultar em pipetas apropriadas para trituração esta em primeiro lugar. A pipeta de Pasteur segundo usado é "-fogo polido" ao longo de um bico de Bunsen para reduzir o tamanho da abertura de aproximadamente 0,5 mm de diâmetro. Isto também resulta em "polir" o anel de vidro da abertura de uma superfície mais lisa reduzindo danos mecânicos às células à medida que passam. Em segundo lugar, a velocidade / força de trituração através da pipeta é de grande importância. Como as células dissociar a partir do tecido todo, são obviamente mais frágil. Assim, o tratamento "áspero", como neste momento seria prejudicial para a sobrevivência das células neuronais. Tecido tripsinizadas deve ser passadas através da pipeta a uma taxa de fluxo consistente, mas firme. Um erro comum por diapesquisador e é a idéia de ter que dissociar completamente o tecido até que não haja uma estrutura perceptível restante. Na maioria dos casos, isso irá resultar na morte neuronal maciça como as células serão muito danificado pela manipulação repetida mecânica. O número de vezes indicado para passar o tecido através da pipeta irá resultar em números suficientes de neurónios sem resultar em danos bruto para a população.

Uma vez que as células foram dissociadas e reunidas, uma mancha azul de tripano de uma alíquota de células vai fornecer uma proporção de vivo para células mortas. Tipicamente, 75-80% das células devem sobreviver ao processo de colheita e pode ser usado para revestimento. A coloração com azul de tripano também pode ser usado para obter uma contagem de células exacta quando feito em um hemocitómetro. Na prática, uma vez uma contagem total de células é conseguida, adicionar 20% ao total e usar esse número de células para efeitos de revestimento para explicar a quantidade aproximada de morte celular. Números fornecidos no protocolo acima são um bom starting ponto para alcançar bons densidades de neurônios. Se a densidade neurónio é demasiado baixa, o plaqueamento, o crescimento celular provavelmente não será suficiente, tal como a densidade de revestimento é uma variável importante na propagação da população de células. As células devem ser alimentados a cada quatro dias com a mídia de alimentação B27/Neurobasal. Crescimento neuronal sob estas condições podem ser facilmente realizados para 10-14 dias em cultura e tem sido utilizada para propagar neurónios ² para fora a 30 dias em cultura quando semeadas a 80 células / mm ^2.