Isolering og dyrkning af hippocampus neuroner fra Prænatal Mus

1. Set-up før høst

1. For at generere prænatal hvalpe til neuron høst, planlægge parring mellem voksne mus 19 dage før dagen for neuron isolation. (C57BL / 6 mus aldre 2-8 måneder blev brugt i parringer med henblik på at udvikle denne protokol). Vellykket parring kan bekræftes ved påvisning af en vaginal prop i den kvindelige, hjertebanken eller visuel bekræftelse af graviditet.
2. Dagen før neuron isolering:
   1. Til immunofluorescens anvendelser coat dækglas i en 24-brønds plade med et tyndt lag på 3:1 Collagen 1 Rotte Hale: poly-D-lysin-opløsning.
   2. Til celledyrkning anvendelser coat passende størrelse vævsdyrkningsplastic ware med et tyndt lag på 3:1 Collagen 1 Rat Hale. Poly-D-lysin-opløsning
3. Hvile pladerne fundet i en vævskultur hætte under UV-lys natten over.
4. Pladerne skylles med steril Hanks Balance Salt Solution (HBSS) førat anvende. Coatede plader kan fyldes med HBSS og opbevares op til en uge ved 4 ° C i mørke.

2. Tissue Harvest

1. Sterilitet er altid en faktor, når voksende primære cellekulturer og som sådan bør den største udvises forsigtighed for at sikre den mest sterile miljø muligt. Med omhyggelig opmærksomhed steril teknik kan initial dissektion og høst af neuralt væv for denne protokol skal afsluttes udenfor en laminar strømningshætte med minimal risiko for kontaminering. Efter første høst, bør alle efterfølgende trin udføres under maksimalt sterile forhold i en hætte normeret til cellekultur.
2. Afliv en gravid mus på omkring 19 dage efter befrugtning ved halshugning. Anvendelse af anæstesi aflive den gravide kvinde ikke anbefales som anæstesi er kendt for at forårsage hjernecelledød (Stratmann, et al., 2010). Med sterile dissekering saks og pincet, en åbning skaber i midten ventrale side afmus fuldstændigt afsløre kropshulrum. Instrumenter kan steriliseres med alkohol og en åben flamme.
3. Prænatal hvalpe vil blive placeret mod den posteriore af muse kropskavitet og bør være let synlige i livmoderen. Med autoklaveret steril pincet, åbne livmoderen og fjern hvalpe. Halshugge hvalpe med friske steril saks og sted fjernet hovedet på steril gaze under et dissektionsmikroskop. Sterile, autoklaverede instrumenter kan være flammehæmmende renses med alkohol og en åben flamme før og under brug.
4. Brug steril saks eller skalpel, åbne kraniet af hvalp fra nakken til næsen. Denne procedure kan normalt være afsluttet ved at stikke en spids af saksen i rygsøjlen foramen og derefter fortsætter anteriort. Forsigtigt fjerne hele hjernen med en pincet. Sæt hjernen på steril gaze. Anvendelse af en steril skalpel, cerebellum fjerne og incise ned midterlinien af hjernen for at adskille den i to halvdele (figur 1) .
5. Tag fat i en lille del af meninges omkring hippocampus med sterile pincet og trække det forsigtigt væk. Selvom det ikke er strengt nødvendigt at fjerne meninges før isolering af hippocampus, kan tilstedeværelsen af ​​meninges gør dissektion af hippocampus vanskeligere på grund af sejheden af ​​membranen. I begge tilfælde vil hippocampus mere tydeligt synlig efter meninges er blevet fjernet. Hippocampus er en buet struktur, der starter i den distale del af halvkuglens og bøjer ventralt (figur 2). Som det indre, konkave, side (caudale) står over for en hjertekammer, er det allerede gratis. Derfor, for at isolere hippocampus, et behov for at skære langs den konvekse ydre side. Efter dissektion, løftes forsigtigt hvert hippocampi med sterile pincetter, og overførsel til et lille vævskulturskål med opvarmet (37 ° C) HBSS under en cellekultur hætte. Hjernevæv kan kombineres fra flere unger.

1. Anvendelse af en steril skalpel, forsigtigt hakket hjernevæv i 3 ml sterile HBSS i en 100 mm vævskulturskål.
2. Overfør det hakkede væv og HBSS til en 15 ml konisk rør. Tilsættes 1,5 ml HBSS og 0,5 ml 0,25% trypsin-opløsning til et totalvolumen på 5 ml.
3. Cap og vend forsigtigt røret 4-5 gange for at blande. Prøve at undgå at frembringe bobler med DNA frigivet fra fordøjede væv vil klæbe til boblerne og forårsage det hakkede væv til at flyde i stedet for bundfældning til bunden af røret (figur 3).
4. Inkuber hippocampalt væv ved 37 ° C i 15 minutter, inverterende rør som beskrevet ovenfor hvert 5. minut.
5. Tillade vævet at sedimentere til bunden af ​​røret.
6. Forsigtigt fjerne overskydende opløsning ved anvendelse af en steril pipette, hvorved vævet uforstyrret i bunden af ​​røret.
7. Vask vævspellet med 5 ml HBSS ved 37 ° C i 5 minutter. Gentage alt 3 gange. Tillade væv fuldstændigt afvikletil bunden af ​​røret, hver gang før der fortsættes til det næste vasketrin.
8. Fjerne den sidste vask af vævet pellet og erstatte med 2 ml frisk HBSS.

4. Neuron Findeling

1. Inden du begynder triturering trin, vil du nødt til at forberede flammepoleret Pasteur pipetter. Ved hjælp af en Bunson brænder, en steril 9 tommer pasteurpipette spids (fig. 4a) i flammen holdes nede, indtil diameteren af pipetten åbning er tilnærmelsesvis 0,5 mm i størrelse og kanterne af pipetten åbningen er afrundet lidt (figur 4b). Lad pipette til helt cool, før du begynder trituration processen.
2. Anvendelse af en normal steril 9 tommer Pasteur-pipette, tritureres forsigtigt vævet i alt 7 gange. Større vævsstykker er normalt på dette tidspunkt, og bør have lov til at sedimentere til bunden af ​​røret før flytning til det næste trin.
3. Supernatanten overføres til et frisk sterilt 50 ml konisk rør.
4. Tillade alle resterende større vævsstykker til sedimentere til bunden af ​​røret og kombinere supernatanten med den foregående supernatanten til et totalt 4 ml dissocierede neuronale celler.

5. Celleudpladning

1. Tæl dissocierede celler under anvendelse af et hæmocytometer.
2. Som en generel regel, celletal engang har været fastlagt, trække 20% fra det endelige antal der tages højde for celledød, der kan opstå efter galvanisering.
3. Celler kan udplades med anbefalingerne nedenfor:
   For dækglas i en 24 brønds plade - 6 x 10 ⁴ celler / brønd i 0,5 ml
   For 60 mm vævskultur-plader - 4 x 10 ⁵ celler / plade i 3 ml
   Til 100 mm Vævskulturplader - 6 x 10 ⁶ celler / plade i 6 ml
4. Blande passende celleantal med angivne rumfang Neurobasal udpladningsmedier (NeurobasalMedier indeholdende B27 Supplement [1 ml / 50 ml], 0,5 mM glutamin opløsning, 25 uM Glutamat (Mr 147,13 g / mol), penicillin (10.000 enheder / ml) / streptomycin (10.000 ug / ml) [250 ul / 50 ml] , 1 mM HEPES (Mr 238,3 g / mol), 10% varmeinaktiveret Donor hesteserum), og der tilsættes celler i plader. Swirl plader forsigtigt for at fordele celler jævnt. HI-Donor Horse Serum føjes til klædningen Media til at berige de celler i løbet af de første 24 timer af vækst. Cellerne er derefter vænnet fra serum og returneres til et serumfrit miljø ved seriel reduktion af serum ved hver udskiftning af medier. Det bør også bemærkes, at medens glutamat ved højere koncentrationer er toksisk for neuronale cellekulturer ved de lavere koncentrationer tilsatte her, vil det inhibere binding af ikke-neuronale celler ^11. Imidlertid bør det kun tilsættes til udpladningsmedier for de første 24 timer i kultur og efterfølgende udeladt enhver fødning medie for at forhindre neurotoksicitet af cellerne.
5. Place neuroner i et 37 ° C, 5% _{CO2-inkubator} natten over.
6. Fjerne halvdelen af ​​volumenet af mediet fra cellerne og erstattes med samme volumen af ​​Neurobasal Fodring Media (Neurobasal medium indeholdende B27 Supplement [1 ml / 50 ml], 0,5 mM glutamin opløsning, penicillin (10.000 enheder / ml) / streptomycin (10.000 ug / ml) [250 ul / 50 ml], 1 mM HEPES (Mr 238,3 g / mol).
7. Neuroner bør fodres hver 4 dage ved at fjerne halvdelen af ​​de gamle medier og erstatte det med det samme volumen af ​​friske Neurobasal Fodring medier. Neuronale processer bør begynde at være synlig på dag 1 (fig. 5a) og bliver fremherskende ved dag 10 (fig. 5b).

6. Repræsentative resultater

Evnen til at vokse og kulturen primære neuronale celler er blevet en uundværlig del af Neuroscience. Primære kulturer tillader forskeren at analysere specifikke cellulære veje, kemisk modifikation og behandling, mål localization og vækstmønstre i et kontrolleret miljø. Mange af disse procedurer anvender sofistikeret metode til at visualisere specifikke ændringer i celle responser. I dette tilfælde er hippocampale neuroner anvendes til undersøgelse af specifikke neuronale pathways, som ville være vanskeligt, om ikke umuligt at analysere den intakte hjerne. Fremstillinq af tæt homogene populationer af neuroner fra specifikke områder af hjernen er kritisk for at studere hjernefunktion. Molekylære effekter i de enkelte neuroner kan være medvirkende til at afgrænse højere ordens veje, såsom hukommelse eller indlæring. Da denne protokol giver relativt rene kulturer af hippocampale neuroner, uden behovet for et fødelag af gliaceller, er disse neuroner let anvendes til immunofluorescens undersøgelser. Men som med al primær kultur fra organer, der indeholder flere celletyper, kan nogle forurening med mindre ønskede celler opstår. I isolering af neuronale celler, kan forurening af gliaceller er et fælles problem. Gliaceller cen let påvises ved mikroskopisk visualisering af kulturen som deres morfologi adskiller sig væsentligt fra mål-neuroner (figur 6). Virkningen af ​​gliacelle forurening vil afhænge af den planlagte anvendelse af kulturer. Hvis celler bliver brugt til immuno-fluorescens undersøgelse, kan glial forurening være noget mere end en ulempe, når de forsøger at fotografere de enkelte neuroner. Imidlertid, hvis de neuronale kulturer anvendes til biokemisk analyse, kan en væsentlig kontamination af gliaceller forårsage større ændringer i resultaterne. Måder at løse gliacelle forurening er skitseret yderligere i diskussionen.

Når neuroner er blevet isoleret og dyrket i kultur, en typisk anvendelse er at undersøge cellulære processer immuno-fluorescens teknikker. Som illustreret i figur 7, kan organeller, såsom mitokondrier, kan farves under anvendelse vitale farvestoffer tilsættes til dyrkningsmediet før fastsætteation. Endogene cellulære proteiner kan visualiseres af fikserede celler under anvendelse af standardprocedurer immuno-fluorescens teknikker (figur 8). Når neuronale celler er fastgjort, kan specifikke antistoffer for proteiner af interesse skal indføres i cellen, og disse proteiner kan visualiseres ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Dyrkede neuroner også give forskeren med midlerne til at undersøge individuelle protein virkninger på neuronal funktioner. Ved anvendelse af en række teknikker, herunder DNA-transfektioner, elektroporation eller viral transduktion, kan proteiner overudtrykkes i neuronale celler (figur 9). Hvordan neurale celler reagere på virkningerne af over-udtrykte proteiner kan have direkte konsekvenser for, hvordan hjernen kan reagere og giver mulighed for at identificere cellulære mål for medicinsk behandling. Detaljerne i disse typer af eksperimenter går ud over rammerne af dette papir men de viser, at kulturer fremstillet ved denne teknik er velegnet til en bred vifte af ned-stream applikationer. Den samlede enkelhed af denne protokol, samt den korte periode der kræves for at forberede disse neuronale kulturer gøre dette til en ideel metode til brug i dagens neurovidenskab laboratorium.

Figur 1. Dissektion af prænatal musehjerne. Den første indsnit er nede midterlinien af ​​hjernen skilles i to halvkugler.

Figur 2. Placering af hippocampus i prænatal musehjerne. Striatum bevæges til side for at visualisere hippocampus og bemærkes af de buede "kidney-bønne" type struktur i det distale område af hver hemisfære.

Figur 3. Dissociation af hippocampalt væv i trypsinopløsning.

Hippocampale kulturer er blevet anvendt i molekylærbiologi i mere end 20 år. Mens der i princippet kan neuronale kulturer fremstilles af en del af hjernen, har hippocampale kulturer vist sig at være den mest populære på grund af den relativt enkle opbygning af nerve-cellepopulation i hippocampus ^7. Hippocampus kulturer er typisk fremstillet af senfase fostervæv. Dette væv er lettere at dissociere og indeholder færre gliaceller, end modent hjernevæv ^1. Isolering af hippocampale neuroner fra embryonisk væv falder også forskydning beskadigelse axoner og dendritter grund af færre adhæsion kontakterne ^3. Mens hippocampale kulturer oftest genereres fra rotter på grund af den relativt lette isolering af hippocampus, kan musene ligeledes anvendes med de samme protokoller eventuelt omhu under væv isolation. Når neuroner dyrkes, evnen til at anvende avancerede molekylære teknikker til at analysere subcellulær localization og handel kan anvendes. Dette kan være særligt fordelagtigt, når der analyseres embryoniske letale transgene mus, da det giver mulighed for at undersøge protein-interaktioner, der ville resultere i død af embryoet.

Hippocampus har været impliceret i rumlig og kontekstuel indlæring ⁵ og hukommelse ^6. Vækst af primære kulturer fra hippocampus kan give en sammenhæng mellem subcellulære biologiske begivenheder og deres indvirkning på hjernens evne til at lære og huske.

Som med alle neurale celler, kræver neuroner dyrket fra hippocampale kulturer kritiske vækstfaktorer, hormoner og aminosyrer. I hjernen, er disse faktorer, som glialceller. Dette symbiotiske forhold kan også udføres i et dyrkningsmiljø ved at dyrke en "feeder" lag af gliaceller sammen med de dyrkede neuroner. Imidlertid vil glialceller også frembringe cytotoksiske faktorer under deres levetid ¹¹ wVILKEN kan være toksisk for dyrkede neuroner. At omgå dette er neuroner dyrket i serumfrie medier, såsom Neurobasal medium suppleret med B27. B27 supplement er optimeret til overlevelse af hippocampale neuroner, men vil understøtte væksten af andre neuronale kulturer såvel ^4. L-glutamin er en essentiel aminosyre til energiproduktion og proteinsyntese i cellekultur. Imidlertid kan glutamin være labil over tid, nedbrydende til ammoniak og carboxylsyregrupper biprodukter gang tilsættes til dyrkningsmedier. Glutamax, en cellekultur supplement fra Invitrogen, kan anvendes som en direkte erstatning for L-glutamin, hvis det ønskes. Glutamax er mere stabile i medier, men lidt dyrere. Væksten af ​​neuroner i serumfrie medier tillader undersøgelse af virkningerne af vækstfaktorer og hormoner for neuronal vækst og differentiering.

Vi indsende en protokol til hurtig isolering af hippocampus neuroner fra mus prænatal embryoner ved hjælp af Neurobasal medier og B27 tillægsent for vækst af neuroner i et serumfrit miljø uden brug af fødeceller. Som med alle dyrkede primære celle protokoller, er det fordelagtigt at minimere væksten af ​​ikke-ønskede celletyper (dvs. glialceller). Dette kan lettest opnås ved omhyggelig dissektion af hippocampus fra omgivende områder af hjernen. Prænatal celler også indeholde et forholdsvis lille antal af gliaceller medvirken i dette mål. Imidlertid kan gliacelle kontaminering forekommer stadig. Det er muligt at reducere gliacelle kontaminering ved behandling med cytosinarabinosid (AraC) på tidlige tidspunkter i kulturen ^8,9. AraC kan anvendes som et anti-mitotisk middel for at reducere populationen af ​​ikke-neuronale celler i stand til DNA-syntese. For at undgå mulige toksiske virkninger af behandling på neuroner, bør det anvendes lavest effektive gør (5 uM) og ikke tilsættes efter 3-4 dages dyrkning ^11. En anden mulighed ville være brugen af ​​5-fluor-2'-deoxyuridin (FUdR) behandling til decemberrease andelen af fibroblastisk-reaktive mikrogliaceller celler ^10.

Når først høstet, kan hippocampalt væv behandles med en fortyndet trypsinopløsning at dissociere / disaggregere adhærente celler. Imidlertid kan længere tids udsættelse for høje koncentrationer af trypsin skade celle subkultur så tid trypsinopløsning oftest begrænset til mellem 3-5 minutter. Den fortyndede koncentration af trypsin anvendes i denne protokol giver mulighed for længere tid af enzym inkubation at fremme individuel cellulære afstandtagen, men man skal passe på nøje at overholde den tid, der point. Papain kan anvendes som en alternativ enzym og har vist sig at være mere effektive og mindre destruktiv med visse væv, såsom retinale neuroner ^10.

Celledissociering er efterfulgt af triturering af vævet. Dette har vist sig at være det vigtigste skridt i overensstemmelse neuronal kultur og fremhæves af to vigtige points. Første to steril Pasteur pipetter anvendes under denne proces. Den første bruges til groft forstyrre væv / cellulær forening. Den åbne Størrelsen af ​​denne første pipette skal være mellem 1,0-1,5 mm. Omhyggelig udvælgelse af pipetter direkte fra sælgeren pakken kan sædvanligvis resultere i passende pipetter til denne første triturering. Den anden Pasteur anvendte pipette "flammepoleret" over en bunsenbrænder at reducere størrelsen af ​​åbningen til ca 0,5 mm i diameter. Dette resulterer også i "polering" glasset ring af åbningen til en glattere overflade reducerer mekanisk skade på celler, når de passerer igennem. Det andet hastighed / kraft triturering gennem pipetten er af væsentlig betydning. Efterhånden som cellerne dissocieres fra hele væv, er de naturligvis mere skrøbelige. Således vil "rå" behandling dette punkt er skadelig for overlevelse af neuronale celler. Trypsineres væv bør passeret gennem pipetten på en konsekvent, men fast flow. En almindelig fejl ved the forsker er tanken om at skulle helt adskille vævet, indtil der er ingen mærkbar struktur tilbage. I de fleste tilfælde vil dette resultere i massive neuronale død som cellerne vil blive for beskadiget af gentagne mekaniske manipulation. Det angivne antal gange at passere vævet gennem pipetten vil resultere i tilstrækkelige antal neuroner uden at resultere i grov beskadigelse af befolkningen.

Når cellerne er blevet adskilt og samlet, en Trypan Blue farvning af en prøve af celler vil tilvejebringe et forhold mellem bor i døde celler. Typisk bør 75-80% af cellerne overlever høsten, og kan anvendes til plettering. Trypan Blue-farvning, kan også anvendes til at opnå en nøjagtig celletal når udført på et hæmocytometer. I praksis en totalcelletælling gang er opnået, tilsættes 20% af de samlede og anvende denne celleantal for udpladning at tage højde for den omtrentlige mængde af celledød. Numre, der udbydes i ovennævnte protokol er en god starting punkt at opnå gode tætheder af neuroner. Hvis neuron densitet er for lav ved udpladning vil cellevækst sandsynligvis ikke være tilstrækkeligt som udpladningsdensitet er en vigtig variabel i opformering af cellepopulationen. Cellerne skal fodres hver fire dage med B27/Neurobasal Feed medier. Neuronal vækst under disse betingelser kan let udføres på 10-14 dage i kultur, og er blevet anvendt til at udbrede neuroner ² til 30 dage i kultur, hvor podet på 80 celler / mm ^2.