Подготовка 3D фибрина лесов для стволовых Приложения культуре клеток

Примечание Перед началом протокола: фибриноген является производным крови белка и, следовательно, соответствующее обучение технике безопасности должны быть завершены до обращения. Этот протокол требует 2 дней, чтобы завершить так что время желаемой культур стволовых надлежащим образом гарантировать, что они готовы для посева. С точки зрения расчета, сколько фибриногена в отвешивать, три 35 мм чашки Петри трис буферном растворе (TBS, рН 7,4), содержащем 110-130 мг фибриногена растворяют в 3 мл TBS будет достаточно для производства 1 24-луночный планшет, содержащий 400 мкл леса фибрина в каждую лунку.

1. День первый: Создание решений фибриногена и ночь диализа

1. Возьмите лиофилизированный фибриногена из холодильника и оставьте на 20 минут, чтобы позволить ему до комнатной температуры.
2. Добавьте 3 мл Трис-буферного раствора (TBS) каждой 35 мм чашке Петри. Каждая пластина фибриногена дает от 2 до 3 мл фибриногена решение в диапазоне концентрации от 12 до 20мг / мл, а общее количество фибриногена необходимости может быть вычислена на основе этих приближений.
3. Взвесить примерно 100-130 мг фибриногена (Fg) и посыпать на поверхность настоящей TBS в каждом блюде. Подождите 5 минут, фибриноген, чтобы начать переходят в раствор. Обложка Петри с крышкой.
4. Инкубировать чашки Петри при 37 ° С в течение 2 часов, чтобы позволить фибриногена в полной мере войти в решении TBS.
5. Мокрый трубы диализа (7000 МВт отрезана) с TBS. Сложите нижний конец на конец трубы и зажим закрыт с диализом зажимом.
6. Пипетировать фибриногена решения от блюд в диализной трубки. Сложите на верхнем конце и закрыть зажим с зажимом диализа.
7. Трубы Место диализа содержащие фибриноген решение в 4-литровый контейнер TBS. Mix решения с использованием мешалки установлен в низкой скорости (100 оборотов в минуту).
8. Диализировать решение ночь на движение пластины, по крайней мере 12 часов. Решение TBS не должны быть изменены в течение этого периода времени.
2. День 2: полимеризация фибрина леса и посева стволовых клеток в лесах

Все действия, описанные в этом процессе должны быть выполнены в стерильной капот культуры тканей, как эти леса будут засеяны культуры стволовых клеток.

1. Удалить фибриногена решение от трубы диализа и поместить в подходящие по размеру коническую трубку (или 15 мл или 50 мл).
2. Фильтры решение фибриногена с 5,0 мкм шприц фильтр для удаления крупных примесей в растворе. В зависимости от объема раствора, использование нескольких фильтров могут быть необходимы для обработки всего решения.
3. Стерильные фильтры фибриногена решение с 0,22 мкм фильтр в 50 мл коническую трубку. Используя соответствующий размер пипетки, определить объем отфильтрованной фибриногена решение для использования в дальнейшем при выполнении вычислений. В зависимости от объема раствора, использование нескольких фильтров могут быть необходимы для обработки ЛОРГнев решение.
4. Измерьте оптическую плотность фибриногена решение при 280 нм, используя спектрофотометр. Разведения в 50 раз часто бывает необходимо получить поглощение до 1.
5. Рассчитайте концентрацию белка присутствуют в фибриногена решение по следующей формуле: [фибриногена в мг / мл] = ₍₂₈₀ × коэффициент разбавления) ÷ 1,55, где 1,55 коэффициент экстинкции при ₂₈₀ человека фибриногена ^13. Затем подсчитать количество TBS необходимо, чтобы разбавить концентрацию раствора до 11,1 мг / мл фибриногена на основе первоначального объема. Конечная концентрация белка фибрина лесов составляет 10 мг / мл после полимеризации.
6. Получить стерильной тромбина и решения хлорида кальция. Во-первых, добавить 15 мкл раствора тромбина (концентрация: 40 Ед / мл - конечная концентрация в леса будет 2 Ед / мл) на правой стороне каждой скважины в первом ряду 24-луночный планшет. Затем добавить 15 мкл 50 мМ кальция хлoride решение левой стороны каждой скважины. Наконец, добавьте 270 мкл фибриногена решение пластины. Встряхнуть пластины из стороны в сторону, затем качая задом наперед, чтобы обеспечить смешивания растворов.
7. Пусть строка, содержащая смесь полимеризуется в течение 5 минут при комнатной температуре. Леса становятся более непрозрачными, как они полимеризуются.
8. Повторите шаги 2.6 и 2.7, пока необходимое количество леса фибрина были полимеризуется.
9. После того, как последние 5 минут инкубации поместите пластин внутри 37 ° C инкубатор для обеспечения полной полимеризации леса.
10. После одного часа инкубации завершен, следующим шагом будет семя на эшафот с эмбриоидных органов. С помощью 20 мкл pipettemen выберите единоличным эмбриоидных и место в центре фибрина эшафот. Проконсультируйтесь с микроскопом, что каждый хорошо содержит одно тело эмбриоидных.
11. Добавьте 5 мкл раствора тромбина (концентрация: 40 Ед / мл) и 5 ​​мкл 50 мМ хлористого кальцияРешение друг на эмбриоидных тела следуют на 90 мкл фибриногена раствора в каждую лунку. Решение должно сформировать пузырь инкапсуляции эмбриоидных органов.
12. Место пластина еще в 37 ° C инкубатор для дополнительного часа, чтобы обеспечить полимеризации.
13. После инкубации добавляют 1 мл соответствующий носитель культуры клеток в каждую лунку и место пластину назад на 37 ° C инкубатора.

3. Представитель Результаты

На рисунке 1 показана схема вид сбоку отдельных скважин содержащих 3D фибрина леса системе культуры посеяны с эмбриоидных тела. Рисунок 2А показывает, представитель изображений мыши индуцированных плюрипотентных стволовых клеток время культивировали на мышиных эмбриональных фибробластов слоев подачи. Эти клетки затем вынужден сформировать эмбриоидных органов, агрегатов клеток, содержащих нейронных предшественников, используя 8-й день ретиноевой кислоты протоколом лечения (рис. 2В), а previouslу описанных ^14, а 3 показаны внешний вид IPS-, полученных эмбриоидных тела после 3 дней культуры в 3D-фибрин леса. Аналогичные результаты были получены ранее с помощью мыши эмбриональные стволовые клетки ^7. Кроме того, этот метод был использован для IPS-культуры, полученные эмбриоидные тела, полученные с использованием различных протоколов с участием ретиноевой кислоты и purmorphamine ¹⁵ внутри 3D леса фибрина, демонстрируя универсальность этой системе культуры.


Рисунок 1. Схематическое изображение сбоку отдельных скважин содержащих 3D фибрина лесов семенами с эмбриоидных тела.


Рисунок 2. Мышь индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPS), культура и дифференцировки клеток. Для дифференциации этих клеток в neurдр. фенотипов, ИПС клетки культивировали в суспензии для производства агрегатов клеток, называемых эмбриоидные тела (ЭТ). Эти ЭТ затем обрабатывают с ретиноевой кислотой, чтобы вызвать нервный дифференциации и этот протокол был ранее использован, чтобы вызвать нервный дифференциации эмбриональных стволовых клеток. А) Недифференцированная мыши иПК клетки колонии культивировали на мышиных эмбриональных фибробластов слой подачи. B) эмбриоидных органов, полученных от мышиных клеток иПК в суспензионной культуре принято на 8-й день после лечения с ретиноевой кислотой, чтобы вызвать нервный дифференциации. Шкала бар составляет 100 мкм.


Рисунок 3. Пример результатов мыши иПК эмбриоидных тела после 3 дней культуры в 3D-фибрин эшафот. Клетки начали мигрировать и дифференцироваться внутри фибрина эшафот. Масштаб панели составляет 500 мкм.

Этот протокол обеспечивает описанные выше метод для создания 3D леса фибрин для плюрипотентных стволовых клеток культуры, в частности, для мышиных эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Эта 3D биоматериала на основе системы культуры более точно имитирует ниша стволовых клеток содержится в естественных условиях и, как следствие, оно может быть использовано для отбора биологических сигналов, чтобы определить их влияние на дифференциацию стволовых клеток ^6. Наши наблюдения показали, что эти леса, когда засевали с стволовых клеток, полученных эмбриоидные тела остается в течение 2 недель в пробирке, прежде чем стать полностью деградировали. Чтобы повысить устойчивость этих лесов, апротинин (ингибиторов протеазы) может быть использован для замедления деградации через дополнение к средствам массовой информации культуре клеток. ^7,16 Эти леса также успешно используется для нервной ткани инженерных приложений, в частности, генерацию тканей аналогичные тем, которые имеются в центральной нервной системе ^17. В то время как другие грНУ-НС объединились иПК клеток с фибринового клея для лечения ишемического инсульта ^18, эта работа представляет собой первый известный отчет объединения иПК клеток леса фибрин для нейронных применения тканевой инженерии. Эта работа также служит отправной точкой для объединения различных типах стволовых клеток с лесов фибрин для других приложений тканевой инженерии.