Preparación de fibrina Andamios 3D para Aplicaciones madre para cultivo celular

Notas antes de iniciar el protocolo: El fibrinógeno es una proteína de la sangre y la formación derivada de seguridad tanto, conviene que debe ser completado antes de su uso. Este protocolo requiere de 2 días para completar lo que el tiempo de las culturas madre deseadas apropiada para asegurarse de que están listos para la siembra. En términos de cálculo de la cantidad de fibrinógeno para pesar, tres 35 mm placas de Petri de solución salina tamponada con Tris (TBS, pH 7,4) que contenía 110-130 mg de fibrinógeno disuelto en 3 ml de TBS será suficiente para producir una placa de 24 pocillos que contenía 400 andamios l de fibrina en cada pocillo.

1. Día Uno: Hacer las soluciones de fibrinógeno y de diálisis durante la noche

1. Tome fibrinógeno liofilizado de la nevera y dejar que repose durante 20 minutos para permitir que llegue a temperatura ambiente.
2. Añadir 3 ml de solución salina tamponada con Tris (TBS) a cada 35 mm de placa de Petri. Cada placa de los rendimientos de fibrinógeno 2 a 3 ml de solución de fibrinógeno que van en la concentración de 12 a 20mg / ml y la cantidad total de fibrinógeno es necesario se puede calcular sobre la base de estas aproximaciones.
3. Pesar aproximadamente 100-130 mg de fibrinógeno (Fg) y rociar sobre la superficie de la presente TBS en cada plato. Espere 5 minutos para que el fibrinógeno para empezar a ir a la solución. Cubrir el plato de Petri con tapa.
4. Incubar las placas Petri a 37 ° C durante 2 horas para permitir que el fibrinógeno a ir completamente en la solución de TBS.
5. Tubos de diálisis Wet (7000 MW de corte) con TBS. Doble el extremo inferior del extremo del tubo y la pinza se cerró con una pinza de diálisis.
6. Pipetear las soluciones de fibrinógeno de los platos en tubos de diálisis. Dobla el extremo superior y la abrazadera de cierre con una pinza de diálisis.
7. Colocar tubo de diálisis que contiene solución de fibrinógeno en un recipiente 4 litros de TBS. Mezcle la solución con placa de agitación ajustado a baja velocidad (100 rpm).
8. Dializar solución durante la noche en agitar la placa por lo menos 12 horas. La solución de TBS no necesita ser cambiado durante este período de tiempo.
2. Día 2: La polimerización de los andamios de fibrina y la siembra de células madre en los andamios

Todos los pasos descritos para este proceso debe llevarse a cabo en una campana de cultivo de tejidos estéril como estos andamios se sembraron con cultivos de células madre.

1. Retire la solución de fibrinógeno en tubos de diálisis y el lugar en un tubo de tamaño apropiado cónica (o bien 15 mL o 50 mL).
2. Solución de fibrinógeno de filtro con un filtro de 5,0 micras jeringa para eliminar las impurezas grandes en la solución. Dependiendo del volumen de la solución, el uso de múltiples filtros pueden ser necesarias para procesar toda la solución.
3. Filtro estéril del fibrinógeno con solución de 0,22 micras de filtro en un tubo de 50 ml cónico. Utilizando una pipeta tamaño apropiado, determinar el volumen de la solución de fibrinógeno se filtró para utilizar más adelante al hacer cálculos. Dependiendo del volumen de la solución, el uso de múltiples filtros puede ser necesario para procesar la ENTla ira de solución.
4. Medir la absorbancia de la solución de fibrinógeno a 280 nm utilizando un espectrofotómetro. Un factor de dilución de 50 veces es necesario obtener una absorbancia bajo 1.
5. Calcular la concentración de proteína presente en la solución de fibrinógeno utilizando la siguiente ecuación: [fibrinógeno en mg / ml] = (A x ₂₈₀ factor de dilución) ÷ 1,55 donde 1,55 es el coeficiente de extinción a un ₂₈₀ por fibrinógeno humano ^13. A continuación calcular la cantidad de TBS necesaria para diluir la concentración de la solución a 11,1 mg / ml de fibrinógeno en base al volumen inicial. La concentración final de proteína en la fibrina andamios será de 10 mg / ml después de la polimerización.
6. Obtener trombina estéril y soluciones de cloruro de calcio. En primer lugar, añadir 15 l solución de trombina (concentración: 40 U / ml - concentración final en andamio será de 2 U / ml) al lado derecho de cada pocillo en la primera fila de la placa de 24 pocillos. A continuación, añadir 15 l de 50 mM de calcio chloride solución al lado izquierdo de cada pocillo. Finalmente, añadir 270 l de la solución de fibrinógeno a la placa. Agitar la placa de lado a lado seguido por agitación de atrás hacia delante para asegurar el mezclado de las soluciones.
7. Que la fila que contiene las mezclas polimerizar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Los armazones se hacen más opaca a medida que se polimerizan.
8. Repetir los pasos 2.6 y 2.7 hasta que el número deseado de andamios fibrina han sido polimerizado.
9. Después de la incubación último minuto 5, colocar las placas dentro de una incubadora a 37 ° C para permitir la polimerización completa de andamios.
10. Después de la incubación de una hora es completa, el siguiente paso es la semilla del andamio con cuerpos embrioides. El uso de un 20 pipettemen l, seleccionar un organismo de embrioide individuo y su lugar en el centro del andamio de fibrina. Comprobar con el microscopio que cada pozo tiene un cuerpo embrioide sola.
11. Añadir 5 l de solución de trombina (concentración: 40 U / ml) y 5 l de cloruro de calcio 50 mMsolución en la parte superior de cada cuerpo embrioide seguido por 90 l de solución de fibrinógeno a cada pocillo. La solución debe formar una burbuja encapsular los cuerpos embrionarios.
12. Colocar la placa posterior en incubadora a 37 ° C durante una hora adicional para asegurar la polimerización.
13. Después de la incubación, se añade 1 ml de los medios de cultivo celulares apropiadas a cada pocillo de placa y el lugar de nuevo en 37 ° C incubadora.

3. Los resultados representativos

La figura 1 muestra una vista esquemática de la vista lateral de un individuo, así que contiene el sistema de cultivo 3D fibrina andamio sembró con un cuerpo embrioide. Figura 2A muestra imágenes representativas de ratón inducido células madre pluripotentes siendo cultivados en fibroblastos de embriones de ratón capas alimentadoras. Estas células son luego inducidas a formar cuerpos embrionarios, los agregados de células que contienen células progenitoras neurales, utilizando un ácido retinoico 8 días el protocolo de tratamiento (Figura 2B) como previously descrito ¹⁴ mientras que la Figura 3 muestra el aspecto de una iPS derivado cuerpo embrioide después de 3 días de cultivo en el interior de andamios 3D fibrina. Resultados similares se han obtenido anteriormente con células madre embrionarias de ratón ^7. Además, este método ha sido usado para cultivar IPS-derivados cuerpos embrioides producido utilizando un protocolo diferente que implica ácido retinoico y purmorphamine ¹⁵ dentro de andamios 3D fibrina, lo que demuestra la versatilidad de este sistema de cultivo.


Figura 1. Esquemática que muestra la vista lateral de un individuo, así que contiene un andamio 3D fibrina sembrado con un cuerpo embrioide.


Figura 2. Ratón madre pluripotentes inducidas (iPS) de cultivo celular y la diferenciación. Para diferenciar estas células en neurfenotipos al, las células iPS se cultivan en suspensión para producir agregados de células llamadas cuerpos embrioides (EBS). Estos EBs son tratados con ácido retinoico para inducir la diferenciación neuronal y este protocolo se utilizó anteriormente para inducir la diferenciación neural de células madre embrionarias. A) del ratón colonia indiferenciada de células iPS cultivadas en embriones de ratón capa alimentadora de fibroblastos. B) cuerpos embrionarios derivados de las células iPS de ratón en cultivo en suspensión tomada el día 8 después del tratamiento con ácido retinoico para inducir la diferenciación neuronal. Barra de escala es de 100 m.


Los resultados de la Figura 3. Ejemplo de una iPS de ratones embrionarios cuerpo después de 3 días de cultivo en el interior de una estructura 3D de fibrina. Las células han comenzado a migrar y diferenciarse en el interior del andamio de fibrina. Barra de escala es de 500 m.

Este protocolo detallado anteriormente proporciona un método para generar 3D andamios fibrina para el cultivo de células madre pluripotentes, específicamente para embriones de ratón y células madre pluripotentes inducidas. Este sistema 3D biomaterial cultura basada más reproduce con precisión el nicho de células madre encontradas in vivo y, como resultado, se puede utilizar para rastrear las señales biológicas para determinar sus efectos sobre la diferenciación de células madre ^6. Nuestras observaciones han demostrado que cuando estos andamios sembrados con células madre derivadas cuerpos embrioides permanecerá durante 2 semanas in vitro antes de ser degradado completamente. Para aumentar aún más la estabilidad de estos andamios, aprotinina (un inhibidor de la proteasa) se puede utilizar para retardar la degradación mediante la adición a los medios de cultivo celular. ^7,16 Estos andamios se han utilizado también con éxito para aplicaciones de ingeniería de tejidos neuronales, específicamente la generación de tejido similar a la encontrada en el sistema nervioso central ^17. Mientras que otros grOPU se han combinado las células iPS con cola de fibrina para el tratamiento de la isquemia cerebral ^18, este trabajo representa el primer reporte conocido de la combinación de células iPS con andamios de fibrina para aplicaciones de ingeniería de tejidos neuronales. Este trabajo también sirvió como punto de partida para la combinación de una amplia gama de tipos de células madre con andamios de fibrina para otras aplicaciones de ingeniería de tejidos.