Preparazione del 3D fibrina ponteggi per le applicazioni delle cellule staminali Cultura

Note prima di iniziare il protocollo: Il fibrinogeno è una proteina del sangue derivato e formazione sulla sicurezza quindi opportuno deve essere completata prima manipolazione. Questo protocollo richiede 2 giorni per completare così il tempo delle culture staminali desiderati in modo appropriato per assicurare che siano pronti per la semina. In termini di calcolare la quantità di fibrinogeno da pesare, tre piastre da 35 mm di Petri di soluzione salina tamponata Tris (TBS, pH 7,4) contenente 110-130 mg di fibrinogeno sciolto in 3 ml di TBS sarà sufficiente a produrre 1 24 pozzetti contenente 400 ponteggi fibrina pl in ogni pozzetto.

1. Day One: Making soluzioni di fibrinogeno e la dialisi per tutta la notte

1. Prendere fibrinogeno liofilizzato fuori dal frigorifero e lasciare riposare per 20 minuti per permettere di venire a temperatura ambiente.
2. Aggiungere 3 mL di soluzione salina tamponata Tris (TBS) a ciascuna capsula di Petri 35 millimetri. Ciascuna piastra di rendimenti fibrinogeno 2 a 3 ml di soluzione di fibrinogeno che vanno in concentrazione 12-20mg / ml e la quantità totale di fibrinogeno necessario può essere calcolato sulla base di queste approssimazioni.
3. Pesare circa 100-130 mg di fibrinogeno (Fg) e cospargere sulla superficie del presente TBS in ogni piatto. Attendere 5 minuti per il fibrinogeno per iniziare ad andare in soluzione. Coprire con coperchio capsula di Petri.
4. Incubare le piastre di Petri a 37 ° C per 2 ore per permettere il fibrinogeno di andare completamente nella soluzione TBS.
5. Dialisi tubo Wet (7000 MW tagliata) con TBS. Fold estremità inferiore della fine tubo e pinza chiusa con una fascetta dialisi.
6. Pipettare le soluzioni di fibrinogeno, dai piatti in tubi di dialisi. Ripiegare estremità superiore e bloccare chiuso con una fascetta dialisi.
7. Luogo dialisi tubo contenente la soluzione di fibrinogeno in un contenitore 4 di litro di TBS. Mix soluzione con piastra di agitazione impostato a bassa velocità (100 rpm).
8. Dializzare soluzione di pernottamento a mescolare piastra per almeno 12 ore. La soluzione TBS non deve essere cambiata in questo periodo di tempo.
2. Giorno 2: Polimerizzazione di ponteggi di fibrina e la semina di cellule staminali in ponteggi

Tutte le fasi descritte per tale processo deve essere eseguito in una cappa sterile coltura tissutale come questi scaffold saranno seminate con colture di cellule staminali.

1. Rimuovere la soluzione di fibrinogeno dal tubo di dialisi e posto in un apposito tubo dimensionato conica (o 15 ml o 50 mL).
2. Fibrinogeno soluzione filtro con un filtro a siringa da 5,0 um per rimuovere le impurità grandi nella soluzione. A seconda del volume della soluzione, l'utilizzo di più filtri può essere necessario elaborare l'intera soluzione.
3. Filtro sterile con la soluzione di fibrinogeno da 0,22 micron filtro in un tubo conico 50mL. Usando una pipetta di dimensioni adeguate, determinare il volume della soluzione filtrata fibrinogeno da utilizzare in seguito quando fare calcoli. A seconda del volume della soluzione, l'utilizzo di più filtri può essere necessario elaborare il entire soluzione.
4. Misurare assorbanza della soluzione di fibrinogeno a 280 nm usando uno spettrofotometro. Un fattore di diluizione 50 è spesso necessario per ottenere una assorbanza sotto 1.
5. Calcolare la concentrazione di proteine ​​presenti nella soluzione fibrinogeno utilizzando la seguente equazione: [Fibrinogeno in mg / ml] = (A ₂₈₀ × diluizione Factor) 1,55 ÷ 1,55 dove è il coefficiente di estinzione a ₂₈₀ A per il fibrinogeno umano ^13. Avanti calcolare la quantità di TBS necessaria per diluire la concentrazione della soluzione di 11,1 mg / ml di fibrinogeno in base al volume iniziale. La concentrazione finale di proteine ​​nella ponteggi fibrina sarà di 10 mg / ml dopo la polimerizzazione.
6. Ottenere trombina sterile e soluzioni di cloruro di calcio. In primo luogo, aggiungere 15 ul di soluzione di trombina (concentrazione: 40 U / mL - concentrazione finale in scaffold sarà di 2 U / mL) a destra di ciascun pozzetto nella prima riga della piastra a 24 pozzetti. Successivamente, aggiungere 15 microlitri di 50 CHL calcio mMoride soluzione al lato sinistro di ciascun pozzetto. Infine, aggiungere 270 microlitri della soluzione di fibrinogeno alla piastra. Agitare piastra da lato a lato, poi scuotere posteriore a quella anteriore per garantire la miscelazione delle soluzioni.
7. Sia la riga contenente la miscela polimerizzare per 5 minuti a temperatura ambiente. Le impalcature diventano più opachi come polimerizzare.
8. Ripetere le fasi 2.6 e 2.7 fino al numero desiderato di ponteggi fibrina sono stati polimerizzati.
9. Dopo l'ultimo 5 minuti di incubazione, porre le piastre all'interno di un incubatore a 37 ° C per consentire la completa polimerizzazione ponteggi.
10. Dopo l'incubazione uno ora è completa, il passo successivo è alle sementi al patibolo con corpi embrionali. Utilizzando un pipettemen 20 microlitri, selezionare un corpo individuale embrioide e posto al centro del patibolo fibrina. Verificare con il microscopio che ogni pozzetto contiene un unico corpo embrioide.
11. Aggiungere 5 pl di soluzione di trombina (concentrazione: 40 U / mL) e 5 microlitri di 50 mM cloruro di calciosoluzione su ciascun corpo embrioide seguito da 90 microlitri di soluzione di fibrinogeno ad ogni pozzetto. La soluzione deve formare una bolla che incapsula i corpi embrionali.
12. Luogo piastra posteriore in incubatore a 37 ° C per un'ora supplementare per garantire la polimerizzazione.
13. Dopo l'incubazione, aggiungere 1 mL dei mezzi appropriati di colture cellulari per ogni piatto ben luogo e indietro nel 37 ° C incubatore.

3. Risultati rappresentativi

Figura 1 mostra una schematica vista laterale di un singolo pozzetto contenente il 3D fibrina sistema cultura scaffold seminati con un corpo embrioide. Figura 2A mostra immagini rappresentative di cellule staminali pluripotenti indotte topo in coltura su strati di fibroblasti embrionali di topo feeder. Queste cellule vengono quindi indotte a formare corpi embrionali, aggregati di cellule contenenti progenitori neurali, utilizzando uno 8 giorni retinoico protocollo di trattamento (Figura 2B) come previously descritto ¹⁴ mentre la Figura 3 mostra l'aspetto di un IPS-derivato corpo embrioide dopo 3 giorni di coltura all'interno di 3D ponteggi fibrina. Risultati simili sono stati ottenuti in precedenza con cellule staminali embrionali di topo ^7. Inoltre, questo metodo è stato utilizzato per la cultura IPS-derivati ​​corpi embrionali prodotte utilizzando un protocollo diverso, con l'acido retinoico e purmorphamine ¹⁵ all'interno del 3D ponteggi fibrina, a dimostrazione della versatilità di questo sistema di coltura.


Figura 1. Schematico che mostra la vista laterale di un singolo pozzetto contenente un 3D fibrina scaffold seminato con un corpo embrioide.


Figura 2. Mouse staminali pluripotenti indotte (iPS), coltura cellulare e la differenziazione. Per differenziare queste cellule in neurfenotipi al, le cellule iPS sono coltivate in sospensione per la produzione di aggregati di cellule chiamate corpi embrionali (EBS). Questi EBs vengono poi trattate con acido retinoico di indurre il differenziamento neurale e questo protocollo è stato precedentemente usato per indurre il differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali. A) indifferenziato topo cellule iPS colonia coltivati ​​su una embrionale strato di fibroblasti topo alimentatore. B) corpi embrionali derivate da cellule iPS topo in coltura in sospensione adottata il giorno 8 dopo trattamento con acido retinoico di indurre il differenziamento neurale. Barra della scala è di 100 micron.


Risultati dell'esempio Figura 3. Di un IPS topo embryoid corpo dopo 3 giorni di coltura all'interno di uno scaffold 3D fibrina. Le cellule hanno cominciato a migrare e differenziarsi all'interno del patibolo fibrina. Barra della scala è di 500 micron.

Questo protocollo dettagliato sopra fornisce un metodo per generare 3D ponteggi di fibrina per la coltura di cellule staminali pluripotenti, in particolare per embrionali di topo e cellule staminali pluripotenti indotte. Questo sistema biomateriale cultura 3D basato più accuratamente imita la nicchia delle cellule staminali trovato in vivo e, di conseguenza, può essere usata per selezionare segnali biologici per determinare i loro effetti sulla differenziazione delle cellule staminali ^6. Le nostre osservazioni hanno mostrato che quando questi scaffold seminati con cellule staminali derivate corpi embrionali rimangono per 2 settimane in vitro prima di diventare completamente degradata. Per aumentare ulteriormente la stabilità di questi scaffold, aprotinina (un inibitore della proteasi) può essere usato per rallentare la degradazione mediante aggiunta ai mezzi di coltura cellulare. ^7,16 Tali ponteggi sono stati utilizzati con successo per applicazioni di ingegneria tissutale neurali, in particolare la generazione di tessuti simile a quella presente nel sistema nervoso centrale ^17. Mentre altri groups hanno combinato le cellule iPS con colla di fibrina per il trattamento di ictus ischemico ^18, questo lavoro rappresenta il primo rapporto nota di combinare cellule iPS, con impalcature di fibrina per applicazioni di ingegneria dei tessuti neurali. Questo lavoro è stato anche un punto di partenza per combinare una serie di tipi di cellule staminali con impalcature di fibrina per altre applicazioni di ingegneria tissutale.