Voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor Stem Cell Cultuur Toepassingen

Opmerkingen vóór het begin van het protocol: Fibrinogeen is een bloed afkomstig eiwit en dus passende veiligheidsnormen opleiding moet vóór verwerking worden. Dit protocol heeft 2 dagen in beslag, zodat de tijd de gewenste stam culturen behoren te zorgen dat ze klaar zijn voor het zaaien. In het berekenen hoeveel fibrinogeen af ​​te wegen, drie 35 mm petri-schalen van tris gebufferde zoutoplossing (TBS, pH 7,4) bevattende 110 tot 130 mg fibrinogeen opgelost in 3 ml TBS voldoende zijn om een ​​24 wells plaat met 400 produceren ul fibrine steigers in elk putje.

1. Eerste dag: Het maken van fibrinogeen oplossingen en 's nachts dialyse

1. Neem gevriesdroogd fibrinogeen uit de koelkast en laat het zitten voor 20 minuten laat het op kamertemperatuur komen.
2. 3 ml Tris gebufferde zoutoplossing (TBS) elk 35 mm petrischaal. Elke plaat van fibrinogeen opbrengst 2-3 ml fibrinogeenoplossing met concentraties 12-20mg / ml en de totale hoeveelheid benodigde fibrinogeen kan worden berekend op basis van deze benaderingen.
3. Weeg ongeveer 100-130 mg fibrinogeen (FG) en strooi er op het oppervlak van de TBS in elk gerecht. Wacht 5 minuten om de fibrinogeen om te beginnen met in oplossing gaan. Bedek petrischaal met deksel.
4. Incubeer Petrischalen bij 37 ° C gedurende 2 uur om het fibrinogeen volledig naar de TBS oplossing.
5. Wet dialyse slang (7000 MW afgesneden) met TBS. Vouw de onderkant van de slang en klem het einde dicht met een dialyse klem.
6. Pipetteer de fibrinogeen-oplossingen van gerechten in de dialyse slang. Vouw bovenkant en klem dicht met een dialyse klem.
7. Plaats dialyse catheter met fibrinogeen oplossing in een 4 liter container van TBS. Mix oplossing met ophef plaat ingesteld op een laag toerental (100 tpm).
8. 'S nachts Dialyze oplossing op roer plaat voor ten minste 12 uur. De TBS oplossing niet behoeft te worden gewijzigd in deze periode.
2. Dag 2: Polymerisatie van fibrine steigers en het zaaien van stamcellen in de steigers

Alle handelingen hiervoor beschreven proces wordt uitgevoerd in een steriele weefselkweek afzuigkap deze steigers wordt geënt met stamcellen culturen.

1. Verwijder de fibrinogeen-oplossing van dialyse slang en plaats in een geschikte grootte conische buis (hetzij 15 ml of 50 ml).
2. Filter fibrinogeenoplossing met 5,0 urn spuitfilter grote onzuiverheden uit de oplossing. Afhankelijk van het volume van de oplossing, kan het gebruik van meerdere filters nodig zijn om de volledige oplossing te verwerken.
3. Steriel filter de fibrinogeenoplossing met een 0,22 pm filter in een 50 ml conische buis. Met een geschikte grootte pipet bepalen de omvang van de gefilterde fibrinogeenoplossing later gebruikt bij het uitvoeren berekeningen. Afhankelijk van het volume van de oplossing, kan het gebruik van meerdere filters nodig zijn om de ent te verwerkenire oplossing.
4. Meet absorptie van het fibrinogeen-oplossing bij 280 nm met de spectrofotometer. Een verdunning van 50 het vaak nodig om een ​​absorptie verkregen onder 1.
5. De concentratie van proteïne in de fibrinogeenoplossing met de volgende formule: [fibrinogeen in mg / ml] = (A ₂₈₀ x Verdunningsfactor) ÷ 1,55 1,55 wanneer de extinctiecoëfficiënt bij A ₂₈₀ menselijk fibrinogeen ^13. Vervolgens berekent de hoeveelheid TBS nodig om de concentratie van de oplossing tot 11,1 mg / ml fibrinogeen op het oorspronkelijke volume te verdunnen. De uiteindelijke concentratie proteïne in de fibrine steigers dan 10 mg / ml na polymerisatie.
6. Zorg voor steriele trombine en calciumchloride oplossingen. Eerste toe 15 pi thrombine-oplossing (concentratie: 40 U / ml - eindconcentratie in scaffold zijn 2 U / ml) opzij van elk putje in de eerste rij van de 24 wells plaat. Vervolgens voeg 15 ul van 50 mM calcium CHLoride oplossing links elk putje. Voeg tenslotte 270 pl van het fibrinogeen-oplossing aan de plaat. Schud plaat van links naar rechts, gevolgd door het schudden van achter naar voor om ervoor te zorgen mengen van oplossingen.
7. Laat de rij met het mengsel gedurende 5 minuten polymeriseren bij kamertemperatuur. De steigers meer ondoorzichtig als ze polymeriseren.
8. Herhaal stap 2.6 en 2.7 tot het gewenste aantal fibrine steigers zijn gepolymeriseerd.
9. Na de laatste vijf minuten incubatie plaats de platen in een 37 ° C incubator voor volledige polymerisatie van steigers.
10. Na de een uur durende incubatie is voltooid, is de volgende stap is het zaad het schavot met embryo lichamen. Een 20 pL pipettemen, selecteert een individuele embryoiden lichaam in het midden van de fibrine scaffold. Neem contact op met microscoop die elk putje een embryoid lichaam bevat.
11. Voeg 5 ul van thrombine-oplossing (concentratie: 40 U / ml) en 5 pi 50 mM calciumchlorideoplossing op elkaar embryoid lichaam gevolgd door 90 ul van fibrinogeen-oplossing in elk putje. De oplossing moeten vormen een luchtbel inkapselen van het embryo organen.
12. Plaat weer 37 ° C incubator gedurende een extra uur bij polymerisatie te waarborgen.
13. Na incubatie, 1 ml van de juiste cel cultuur media terug toe te voegen aan elk putje en laat de plaat in 37 ° C incubator.

3. Representatieve resultaten

Figuur 1 toont een schema van het zijaanzicht van een individu en met 3D fibrine scaffold teeltsysteem geënt met embryoid lichaam. Figuur 2A toont representatief beelden van muizen geïnduceerd pluripotente cellen worden gekweekt op muizen embryonale fibroblast feeder lagen. Deze cellen worden daarna geïnduceerd om embryoiden organen aggregaten van cellen die neurale voorlopercellen met een 8 dagen retinoïnezuur behandelingsprotocol (Figuur 2B) als previousl vormeny beschreven ¹⁴ terwijl Figuur 3 toont het uiterlijk van een IPS-afgeleid embryoid lichaam na 3 dagen van de cultuur binnenkant van 3D-fibrine steigers. Soortgelijke resultaten zijn eerder verkregen met behulp van muis embryonale stamcellen ^7. Daarnaast is deze methode is gebruikt om de cultuur iPS-afgeleid embryoid lichamen geproduceerd met behulp van een ander protocol met betrekking tot retinoïnezuur en purmorphamine ¹⁵ binnenkant van 3D-fibrine steigers, het aantonen van de veelzijdigheid van deze cultuur-systeem.


Figuur 1. Schematische toont het zijaanzicht van een individu en met 3D fibrine scaffold geplaatste een embryoid lichaam.


Figuur 2. Muis geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) celkweek en differentiatie. Om deze cellen differentiëren tot neural fenotypes, worden de iPS cellen gekweekt in suspensie op aggregaten van de cellen, embryo organen (EBS) te produceren. Deze EBS worden dan behandeld met retinoinezuur aan neurale differentiatie te induceren en dit protocol werd eerder gebruikt om neurale differentiatie van embryonale stamcellen te induceren. A) Ongedifferentieerde muis iPS cel kolonie gekweekt op een muis embryonale fibroblast feeder-laag. B) embryo lichamen afgeleid van de muis iPS cellen in suspensie cultuur die op dag 8 na de behandeling met retinoïnezuur tot neurale differentiatie te induceren. Schaal bar is 100 micrometer.


Figuur 3. Voorbeeld resultaten van een muis iPS embryoiden lichaam na 3 dagen kweken in een 3D fibrine scaffold. Cellen zijn begonnen met het migreren en differentiëren binnenkant van de fibrine schavot. Schaal bar is 500 pm.

Dit protocol hierboven beschreven biedt een methode voor het genereren van 3D-fibrine steigers voor pluripotente stamcellen cultuur, specifiek voor muis embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze 3D biomateriaal gebaseerd teeltsysteem nauwkeuriger bootst de stamcellen nis in vivo en daardoor kan worden gebruikt om biologische signalen screenen om hun effecten op stamceldifferentiatie ⁶ bepalen. Onze observaties hebben aangetoond dat deze steigers toen gezaaid met zijn afgeleid van stamcellen embryo instanties voor 2 weken in vitro blijven voordat hij volledig afgebroken. Om verder te verhogen de stabiliteit van deze steigers, kan aprotinine (een protease-remmer) gebruikt worden om degradatie te vertragen door middel van toevoeging aan de celkweek media. ^7,16 Deze steigers zijn ook met succes gebruikt voor zenuwweefsel technische toepassingen, in het bijzonder de generatie van het weefsel vergelijkbaar met die in het centrale zenuwstelsel ^17. Terwijl andere groepen hebben iPS cellen met fibrine lijm voor de behandeling van ischemische beroerte ¹⁸ gecombineerd, dit werk is de eerste bekende rapport van het combineren van iPS cellen met fibrine steigers voor zenuwweefsel technische toepassingen. Dit werk diende ook als uitgangspunt voor het combineren van een reeks van stamcel typen met fibrine steigers voor andere tissue engineering toepassingen.