Avaliar as alterações metabólicas hepáticas Durante a colonização progressiva de Germ-free Mouse ¹ H NMR Spectroscopy

1. Colonização do germe-free animais e coleta de amostras

1. Remover livre de germes animais de isoladores e abrigá-los em uma sala de criação em gaiolas convencionais equipados com filtro na frente dos animais convencionais, que servirão como controles (Figura 1).
2. Meia mistura do lixo (3 dias) retirado da gaiola de controle convencional, com a ninhada dos animais germ-free. Mantenha sempre 1 / 3 do lixo sujos convencionais cada vez que é necessário renová-lo, a fim de manter um nível de bactérias (mantê-lo pelo menos por 3 dias).
3. Coletar a urina em um microtubo 1,5 mL manipulando o mouse sobre o tubo e ajudar a micção por massagem suave do intestino. Snap-congelar imediatamente em nitrogênio líquido. Armazenar pelo menos a -40 ° C até a análise de RMN. Um volume mínimo de 20 mL é necessário para a aquisição com uma sonda de RMN de 5 mm, mas é recomendado o uso de 30 mL para melhorar a qualidade do perfil metabólico.
4. Os animais devem be sacrificados sem o uso de qualquer anestésico para evitar ressonâncias de RMN de confusão devido ao metabolismo hepático de compostos anestésico (por exemplo, use deslocamento cervical seguido de confirmação de morte por sangria)

2. Recomendação para coleta de biópsia hepática

1. Não use nenhum produto que contenha álcool para evitar a contaminação. Lavar as ferramentas usando uma solução de água ou soro fisiológico.
2. Não perfurar vesícula biliar. Em caso de vazamento de bile, lave o tecido imediatamente com água ou soro fisiológico.
3. Recolher biópsias hepáticas (cerca de 15-50 mg) do lóbulo esquerdo, como mostrado na Figura 2. Para biópsias reprodutível, recolher de forma consistente no centro do lobo esquerdo evitando as áreas periféricas onde o tecido é mais fina.
4. Snap biópsias congelar em nitrogênio líquido e armazená-los imediatamente a -80 ° C até a análise de RMN.

3. RMN ¹ H aquisição de urina microvolume

. 4 ¹ H RMN HR MAS de tecido de biópsia hepática: a preparação da amostra

1. MAS rotor componentes e ferramentas sãodescrito na Figura 4.
2. Inserir biópsia (cerca de 15-50 mg) em rotor de zircônio (Figura 4) (1) e preencher o resto do volume com pura D ₂ O NMR para bloqueio. Tenha cuidado para não fazer quaisquer bolhas porque isso iria alterar a qualidade dos calços subsequente e qualidade de aquisição de dados.
3. Inserir 50 espaçador Teflon mL (Figura 4) (2) com o parafuso cilíndrico (Figura 4) (5). Desapertar-lo e calibrá-lo usando o medidor de profundidade do lado curto (Figura 4) (8). Nesta etapa, é importante prestar uma atenção específica para a amostra porque parte dela pode vazar pelo buraco espaçador. Se este for o caso, então parte da biópsia é destruído e peso da amostra não é mais confiável. Assim, é necessário começar de novo desde o início da preparação da amostra.
4. Coloque o pino thead (Figura 4) (3) e aperte-o suavemente com a chave de fenda (Figura 4) (6). Secar toda a água residual com um pedaço de tecido.
5. Coloque a tampa (Figura 4) (4) nasuperior do rotor e inseri-lo no embalador rotor (Figura 4) (6). Pressione com firmeza até que a tampa está no lugar. Não deve haver qualquer espaço deixado entre o rotor e sua tampa.
6. Marca a metade da parte inferior do rotor usando uma caneta preta para permitir a detecção óptica taxa de spin.
7. Coloque o rotor dentro do espectrômetro de RMN e começar a girar em 5 kHz. Adquirir ^um espectro de RMN H utilizando seqüência de pulsos CPMG ¹³ de acordo com as orientações do fabricante.
8. Use α ressonância glucose anomérico em 5,22 ppm (doublet) para calibrar espectros de RMN.
9. Para descompactar o rotor, proceder por remover a tampa usando o removedor cap (Figura 4) (9). Desapertar thead pin e remover espaçador de teflon com o parafuso cilíndrico. Lavar bem com água e detergente.

5. Resultados representante

Atividade microbiana do intestino pode ser monitorado usando perfil metabólico urinário. Um grande número de micróbios urináriaco-metabólitos identificáveis ​​por ¹ H RMN têm sido descritos na literatura ^7,14-17. Estes microbiana co-metabólitos são particularmente úteis para monitorar o processo de colonização como eles fornecem uma maneira rápida e não-invasivo para estimar quando o ecossistema recém-criada é estável. Figura 5A ilustra claramente o aparecimento de micróbios do intestino co-metabólitos sobre o processo de colonização. Esta figura mostra um perfil metabólico urinário obtidas mediante o procedimento descrito no Passo 2 para um animal colonizadas 20 dias usando o procedimento descrito no Passo 1. Este animal não excretar qualquer sulfato de indoxil e quantidades muito pequenas de phenylacetylglycine (PAG) e sulfato de p-cresol no estado livre de germes (dia 0-azul). Como a colonização avança, estes três marcadores do metabolismo de proteínas pela microbiota intestinal aumentam consideravelmente para chegar a um equilíbrio no dia 20 (vermelho). Isto é particularmente fácil de monitorar, por um grupo de animais, como ilustrado na Figura 5B usando o PAGressonância. Este diagrama foi obtido pela integração da área sob a ressonâncias destaque em cinza na Figura 5A (δ 7,40-7,43), correspondendo a uma ressonância específica (trio) de PAG para um grupo de sete animais.

¹ H Alta Resolução Angle Spinning Magia (MAS HR) espectroscopia de RMN é uma técnica não destrutiva que permite aquisições rápida e reprodutível de perfis metabólicos de qualquer tipo de biópsia ^18. Neste protocolo, utilizamos esta técnica poderosa para obter um perfil metabólico hepática de 2 ratos antes (azul) e após (vermelho) colonização (Figura 6). Esta figura ilustra bem a informação que pode ser derivado de uma MAS RMN baseado em perfil metabólico. Numerosos aminoácidos, assim como metabólitos derivados do metabolismo energético, como a glicose, glicogênio, lactato, triglicérides, (D)-3-hidroxibutirato e nicotinurate pode ser visualizado. Estes perfis também contêm informações relevantes ao estresse oxidativo (ascórbico ou seja, umcid, glutationa), o metabolismo de nucleotídeos (ou seja, inosina, uridina) e metabolismo metilamina (ie colina, Trimetilamina-N-óxido). Neste exemplo, é muito claro que o livre de germes do mouse exibe quase nenhum glicogênio e quantidades muito baixas de glicose e triglicérides como foi publicado anteriormente ^7.

Figura 1. Visão geral do protocolo de colonização. Animais livres de germes e convencionais são alojados em gaiolas equipadas com filtros de lado a lado e suas ninhadas são trocadas para permitir a colonização progressiva da microbiota intestinal convencional (1). Atividade microbiana do intestino é monitorado usando ^um perfil metabólico H NMR-based (2-3). Metabolismo hepático é avaliado por ^um MAS RMN HR H-base de perfis metabólicos (4-5).

Figura 2. Rato vivoanatomia r. O fígado é apresentado como o lado plano do órgão enfrenta a mesa. Para biópsias reprodutível, é aconselhável sempre coletar amostras do centro do lobo esquerdo como indicado pelo retângulo tracejado.

Figura 3 1,7 milímetros kit NMR capilar para trabalhar com microvolumes-chave:.. 1: 2,5 microtubo NMR mm, 2: 1,7 mm tubo de RMN capilar, 3: adaptador capilar, 4: Extração rod.

. MAS Figura 4 equipamentos rotor-chave:. 1: rotor MAS, 2: 50 espaçador Teflon mL, 3: thead pinos, 4: cap, 5: parafuso cilíndrico, 6: chave de fenda, 7: rotor embalador, 8: medidor de profundidade.

Figura 5. Evolução dos perfis metabólicos urinários durante colonization.

1. Zoom na região aromática do espectro entre 6,8-7,8 ppm, onde co-metabólitos microbianos podem ser visualizados. Espectros de RMN ¹ H foram obtidos a partir de um único indivíduo no dia 0 (azul), 4 (verde), 15 (laranja) e 20 (vermelho) pós-colonização. A zona cinzenta corresponde à área que foi integrado para fazer o diagrama em B. chave: 1-MeHistamine: 1-methylhistamine; indoxil-S: sulfato de indoxil;:; Seus p-Cresol-S Histidina: sulfato de p-Cresol; PAG : Phenylacetylglycine.
2. Concentração PAG média durante a colonização (n = 7). Teste t de Student foi utilizado para comparar a diferença na concentração de PAG em vários pontos temporais: a: p <0,05 em relação ao dia 0; b: p <0,01 em relação ao dia 10.

Figura 6. Típicos 600 MHz ¹ H HR espectros de RMN MAS de biópsias hepáticas derivadas de livre de germes (azul) e ex-germ-free (red) camundongos. Prótons em negrito são responsáveis ​​pela ressonância triglicérides-chave:. 3-HB: 3-hidroxibutirato, GSH: glutationa reduzida, TGs: Triglicerídeos, TMAO: Trimetilamina-N-óxido.

Neste protocolo, descrevemos um procedimento colonização progressiva em um ambiente aberto para investigar o impacto da microbiota intestinal no metabolismo hepático avaliado por ¹ H RMN HR MAS perfil da biópsia intacta. Vários métodos de colonização têm sido descritos na literatura. Os métodos mais comuns para colonizar animais com microbiota definida são gavagem oral ou água contaminada ^19,20. Inoculação de fezes também pode ser usado como descrito anteriormente ^21. O método de colonização aqui apresentada é derivada de uma "normalização" método de animais germ-free descrito por Koopman JP et al. em 1986 ^22. Nesta publicação, os autores colocaram um animal vivo convencionais no isolador entre os animais germ-free. No entanto, nem sempre é possível manter os animais em isoladores, especialmente se eles precisam ser manipulados durante o processo de colonização (isto é particularmente difícil se a amostra collection é necessário). Uma alternativa é, portanto, para a casa de ex-germ-free animais em um ambiente convencional aberta na presença de lixo sujos por animais convencionais que serão utilizados como controle. Desta forma, a manipulação de animais, para efeitos de colonização é mínima e isso resulta em menor estresse em comparação com gavagem oral. Este método também permite uma colonização progressiva do intestino que está mais próximo de um processo de colonização natural e oferece uma colonização homogênea de animais compartilhando a mesma gaiola, como demonstrado pela avaliação DGGE (eletroforese em gel com gradiente desnaturante) de perfis de ADN microbiano (disponível como material suplementar em Claus et al. ^7).

Acompanhamento do processo de colonização por perfil metabólico urinário é um método não invasivo, maneira fácil, rápida e eficaz para detectar quando a atividade microbiana torna-se estável. Como não é necessária para manipular os animais todos os dias para esse fim, como mostrado na Figura 5B, o nível de estresse é mantido emseu mínimo. É importante mencionar que mesmo que a colonização é iniciada por uma maca suja por animais controle convencional, é necessário manter um número igual desses animais controle que permitem estimar os efeitos misto de estresse e envelhecimento sobre o metabolismo hepático. Outras técnicas com base em espectrometria de massa (MS), tais como GC-MS (Cromatografia Gasosa) ou LC-MS (Cromatografia Líquida) também pode ser usado para determinar microbiana urinária co-metabólitos, bem como para obter um perfil metabólico de amostras líquidas (ie urina, plasma, extratos de tecidos), mas não pode ser aplicado em tecidos intactos biópsia. GC-MS foi aplicada com sucesso à análise específica de ácidos graxos voláteis estável ^23. Esta técnica requer uma etapa de derivatização que introduz distorções que devem ser cuidadosamente considerados durante a análise de dados ^24. LC-MS pode ser particularmente útil para melhorar a detecção de microrganismos co-metabólitos no perfil alvo ^25. Emborauntargeted perfil metabólico LC-MS melhora substancialmente a sensibilidade de detecção de metabólitos de baixa concentração, a identificação pode ser difícil e um grande número de metabólitos detectados podem permanecer ²⁶ não atribuído. Portanto, a maioria dos estudos untargeted metabonomic foram realizados usando unidimensional ¹ H RMN baseado em plataformas. Uma interessante discussão sobre os vários métodos analíticos disponíveis para fins de perfil metabólico foi publicado recentemente por Ryan et al. ^27.

Metabolismo hepático foi avaliada por não destrutivo ¹ H HR MAS espectroscopia de RMN. Este método foi escolhido porque não necessitam de uma etapa de extração, que destrói o tecido e os resultados na oxidação de compostos altamente reativos, como a glutationa. ¹ H perfil metabólico de RMN baseado também apresenta a vantagem de oferecer um perfil metabólico untargeted da biópsia. Assim, permite a observação de uma grande variedadede metabólitos do ácido cobrindo, energético amino, vias de estresse de nucleotídeos, metilamina e oxidativa relacionados. A única restrição é o limite de detecção que varia de acordo com a estrutura molecular de um composto. Na verdade, o limite de detecção é determinado pela química (isto é, metabólito) concentração, bem como o número de prótons dando o pico de ressonância e seu ambiente químico. Identificação de ressonâncias metabólito também pode ser difícil com base em ¹ HR H espectros de RMN MAS sozinho e, portanto, é aconselhado a realizar alguns experimentos de RMN 2D extras para confirmar atribuições (ou seja, J-resolved, COSY, TOCSY, HSQC, experimentos HMBC ^{28-30) 31,32.} Esta técnica de ¹ H RMN HR MAS é comumente utilizado para estudos metabonomic, caso em que o uso de estatística multivariada (também chamados de métodos de reconhecimento de padrões) é necessária ^33. A ¹ H RMN baseado em métodos metabólicos perfil descrito no presente protocolo têm sido extensivamente aplicado a vários biocondições lógicas e não se limitam à análise de urina e amostras de fígado ^34-36. Protocolos amostra geral de preparação para RMN baseado metabonomics foram revisadas por Beckonert et al. ^18,37.