La evaluación de alteraciones hepáticas metabólicas durante la colonización progresiva de la libre de gérmenes de ratón por ¹ H espectroscopía de RMN

1. La colonización de animales libres de gérmenes y la recogida de muestras

1. Eliminar animales libres de gérmenes de aisladores y de la casa en una sala de cría en jaulas convencionales equipados con filtro delante de los animales convencionales que servirán como controles (Figura 1).
2. Mezclar medio de la camada (3 días) tomado de la caja de control convencional con la materia fecal de los animales libres de gérmenes. Siempre mantenga un tercio de la basura convencional sucia cada vez que hay que renovar con el fin de mantener un nivel de bacterias (mantener al menos durante 3 días).
3. Recoger la orina en un microtubo de 1,5 ml por el manejo del ratón sobre el tubo y ayudar a la micción por un suave masaje en el intestino. Complemento congelar inmediatamente en nitrógeno líquido. Almacene al menos a -40 ° C hasta su análisis de RMN. Un volumen mínimo de 20 l se requiere para la adquisición de 5 mm de la sonda de RMN, pero se recomienda el uso de 30 l para mejorar la calidad de los perfiles metabólicos.
4. Los animales deben be la eutanasia sin el uso de algún tipo de anestesia a fin de evitar resonancias de RMN de confusión debido a un metabolismo hepático de los compuestos anestésicos (por ejemplo, el uso dislocación cervical seguido por la confirmación de la muerte por desangramiento)

2. Recomendación para la recolección de la biopsia hepática

1. No use ningún producto que contenga alcohol para evitar la contaminación. Lave las herramientas con solución de agua o solución salina.
2. No perfore la vesícula biliar. En caso de fuga de bilis, lavar los tejidos inmediatamente con agua o solución salina.
3. Recoger las biopsias de hígado (alrededor de 15-50 mg) en el lóbulo izquierdo, como se muestra en la Figura 2. Para las biopsias reproducible, recoger constantemente en el centro del lóbulo izquierdo evitando las zonas periféricas donde el tejido es más delgada.
4. Ajustar las biopsias de congelación en nitrógeno líquido inmediatamente y almacenarlos a -80 ° C hasta el análisis de RMN.

3. ^{1H NMR} adquisición de orina microvolumen

. 4 ¹ H HR RMN MAS de tejido biopsia del hígado: la preparación de muestras

1. MAS componentes del rotor y las herramientasdescritos en la Figura 4.
2. Inserte una biopsia (alrededor de 15-50 mg) en el rotor de circonio (Figura 4) (1) y llenar el resto del volumen con puro O D ₂ de RMN de bloqueo. Tenga cuidado de no hacer que las burbujas, porque esto altera la calidad de las cuñas posteriores y la calidad de la adquisición de datos.
3. Introduzca 50 L espaciador de teflón (Figura 4) (2) utilizando el tornillo cilíndrico (Figura 4) (5). Desenroscar y calibrar usando el medidor de profundidad en el lado corto (Figura 4 (8)). En este paso, es importante prestar una atención específica a la muestra porque parte de ella puede filtrarse a través del orificio del espaciador. Si este es el caso, entonces parte de la biopsia se destruye y el peso de la muestra ya no es confiable. Lo que es necesario volver a empezar desde el principio la preparación de la muestra.
4. Coloque el pasador THEAD (Figura 4) (3) y el tornillo suavemente con el destornillador (Figura 4 (6)). Secar el agua residual con un pedazo de tejido.
5. Colocar la tapa (figura 4) (4) en elparte superior del rotor y la inserta en el empacador rotor (Figura 4 (6)). Presione firmemente hasta que la tapa está en su lugar. No debe haber ningún espacio entre el rotor y la tapa.
6. Marca la mitad de la parte inferior del rotor con un rotulador negro para permitir la detección óptica de la velocidad de rotación.
7. Coloque el rotor en el interior del espectrómetro de RMN y comenzar a girar a 5 kHz. Adquirir ^un espectro de RMN de H con CPMG secuencia de pulsos ¹³ de acuerdo con las directrices del fabricante.
8. El uso de resonancia α glucosa anomérico a 5,22 ppm (doblete) para calibrar los espectros de RMN.
9. Para descomprimir el rotor, proceder mediante la eliminación de la tapa con el removedor de la tapa (Figura 4 (9)). Desenroscar y quitar elementos thead pin espaciador de teflón con el tornillo cilíndrico. Lavar exhaustivamente con agua y detergente.

5. Resultados representante

La actividad microbiana del intestino pueden ser monitoreados utilizando un perfil metabólico urinario. Un gran número de microorganismos urinariosco-metabolitos identificados por ^RMN-1H han sido descritos en la literatura ^7,14-17. Estos co-metabolitos microbianos son particularmente útiles para vigilar el proceso de colonización, ya que proporcionan una manera rápida y no invasiva para estimar que el ecosistema de reciente creación es estable. Figura 5A ilustra claramente la aparición de microbios intestinales co-metabolitos sobre el proceso de colonización. Esta cifra muestra un perfil metabólico urinario obtenerse por el procedimiento descrito en el paso 2 para un animal colonizó 20 días usando el procedimiento descrito en el Paso 1. Este animal no excretar sulfato indoxyl y cantidades muy pequeñas de phenylacetylglycine (PAG) y p-cresol sulfato en el estado libre de gérmenes (día 0-azul). Como la colonización avanza, estos tres marcadores del metabolismo de proteínas por la flora intestinal aumentan considerablemente para llegar a un equilibrio en el día 20 (rojo). Esto es particularmente fácil de controlar para un grupo de animales, como se ilustra en la Figura 5B con el PAGresonancia. Este diagrama se obtiene integrando el área bajo la resonancia con fondo gris en la Figura 5 (δ 7.40-7.43), que corresponde a una resonancia específica (triplete) de PAG de un grupo de 7 animales.

¹ H de alta resolución angular Magic Spinning (MAS HR) espectroscopía de RMN es una técnica no destructiva que permite la adquisición rápida y reproducible de los perfiles metabólicos de cualquier tipo de biopsia ^18. En este protocolo, se utilizó esta técnica de gran alcance para obtener un perfil metabólico hepático de los ratones antes de 2 (azul) y después (rojo) la colonización (Figura 6). Esta figura ilustra bien la información que se puede derivar de un MAS RMN basados ​​en el perfil metabólico. Numerosos aminoácidos, así como los metabolitos derivados del metabolismo energético, como la glucosa, glucógeno, lactato, triglicéridos, (D)-3-hidroxibutirato y nicotinurate puede ser visualizada. Estos perfiles contienen información relevante para el estrés oxidativo (es decir, un ascórbicocid, el glutatión), el metabolismo de nucleótidos (es decir, inosina, uridina) y el metabolismo de metilamina (es decir, la colina, trimetilamina N-óxido). En este ejemplo, es muy claro que la libre de gérmenes del ratón muestra casi ningún glucógeno y cantidades muy bajas de glucosa y triglicéridos, se publicó anteriormente ^7.

Figura 1. Descripción general del protocolo de la colonización. Animales libres de gérmenes y convencionales están alojados en jaulas equipadas con filtros de lado a lado y sus camadas se intercambian para permitir la colonización progresiva de la flora intestinal convencional (1). La actividad microbiana del intestino se controla mediante ^un perfil de RMN basado metabólico (2-3). El metabolismo hepático es evaluado por ¹ H RMN MAS de recursos humanos basada en el perfil metabólico (4-5).

Figura 2. Ratón vivor anatomía. El hígado se muestra como la parte plana del órgano frente a la mesa. Para las biopsias reproducible, se recomienda recoger muestras siempre desde el centro del lóbulo izquierdo según lo indicado por el rectángulo de trazos.

Figura 3 1,7 mm kit RMN capilar para trabajar con microvolúmenes clave:.. 1: 2,5 mm microtubo RMN, 2: 1,7 mm tubo de RMN capilar, 3: adaptador capilar, 4: Extracción de la varilla.

. MAS Figura 4 rotor equipos clave: 1.: Rotor MAS, 2: 50 l espaciador de teflón, 3: Thead pines, 4: gorra, 5: tornillos cilíndricos, 6: destornillador, 7: rotor envasador, 8: medidor de profundidad.

Figura 5. Evolución de los perfiles metabólico urinario durante colonization.

1. Zoom en la región aromática del espectro de entre 6.8 a 7.8 ppm, donde co-metabolitos microbianos pueden ser visualizados. ¹ H RMN se deriva de una sola persona en el día 0 (azul), 4 (verde), 15 (naranja) y 20 (rojo) post-colonización. La zona gris corresponde a la zona que se ha integrado para hacer el diagrama de la B. Principales: 1-MeHistamine: 1-metilhistamina; indoxil-S: El sulfato de indoxyl;:; Su p-cresol-S Histidina: sulfato de p-cresol, PAG : Phenylacetylglycine.
2. Concentración de PAG promedio durante la colonización (n = 7). La t de Student se utilizó la prueba para comparar la diferencia en la concentración de PAG en diferentes puntos de tiempo: a: p <comparación con el día 0 0,05; b: p <0,01 en comparación con los 10 días.

Figura 6. Típicos 600 MHz ¹ H HR espectros de RMN MAS de las biopsias hepáticas derivadas de libres de gérmenes (azul) y ex-libre de gérmenes (red) los ratones. Protones en negrita son los responsables de la resonancia de triglicéridos clave:. 3-HB: 3-hidroxibutirato, GSH: glutatión reducido, TG: triglicéridos, OTMA: trimetilamina-N-óxido.

En este protocolo, que describe un procedimiento de colonización progresiva en un entorno abierto para seguir investigando el impacto de la microbiota intestinal en el metabolismo hepático evaluado por ¹ H RMN de perfiles de recursos humanos del MAS intacta biopsia. Varios métodos de colonización han sido descritos en la literatura. Los métodos más comunes para colonizar los animales con una microbiota definida son una sonda nasogástrica o beber agua contaminada ^19,20. Inoculación fecal también puede ser utilizado como se describe anteriormente ^21. El método de la colonización que aquí se presenta se deriva de una "normalización" método de los animales libres de gérmenes descritos por Koopman JP et al. en 1986 ^22. En esta publicación, los autores colocan un animal convencional que viven en el aislador entre los animales libres de gérmenes. Sin embargo, no siempre es posible mantener a los animales en los aisladores, especialmente si tienen que ser manipuladas durante el proceso de colonización (esto es especialmente difícil si la muestra collección es necesario). Una alternativa es, pues, a la casa de ex-animales libres de gérmenes en un ambiente de abierta convencional en presencia de la basura contaminada con animales convencionales que se utilizaron como controles. De esta manera, la manipulación de los animales con el fin de la colonización es mínima y esto se traduce en un menor estrés en comparación con una sonda nasogástrica. Este método también permite una progresiva colonización de los intestinos que se acerca más a un proceso de colonización natural y ofrece una colonización homogénea de animales que comparten la misma jaula, como lo demuestra DGGE (electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante) la evaluación de los perfiles de ADN microbiano (disponible como material complementario en Claus et al. ^7).

Seguimiento del proceso de colonización por un perfil metabólico urinario es un procedimiento no invasivo, fácil, rápido y eficaz para detectar cuando la actividad microbiana se estabiliza. Ya que no es necesario manipular los animales todos los días para tal fin, como se muestra en la Figura 5B, el nivel de estrés se mantiene asu mínimo. Vale la pena mencionar que aunque la colonización se inicia por una camada contaminada con animales de control convencional, es necesario mantener un número igual de los animales de control que le permiten a uno estimar los efectos de mezcla de estrés y el envejecimiento sobre el metabolismo hepático. Otras técnicas basadas en espectrometría de masas (MS), tales como la CG-MS (cromatografía de gases) o LC-MS (cromatografía líquida) también se puede utilizar para determinar microbiana urinaria co-metabolitos, así como para obtener un perfil metabólico de las muestras de líquido (es decir, orina, plasma, extractos de tejidos), pero no se puede aplicar en el tejido intacto biopsia. GC-MS se ha aplicado con éxito en el análisis objetivo de estabilidad de ácidos grasos volátiles ^23. Esta técnica requiere una etapa de derivatización que introduce sesgos que tienen que ser cuidadosamente considerados durante el análisis de datos ^24. LC-MS puede ser especialmente útil para mejorar la detección de contaminación microbiana, co-metabolitos en perfiles específicos ^25. Aunqueno directo LC-MS perfil metabólico que mejora sustancialmente la sensibilidad de la detección de metabolitos de baja concentración, la identificación puede ser difícil y un gran número de metabolitos detectados pueden permanecer sin asignar ^26. Por lo tanto, la mayoría de los estudios focalizados metabonomic se han realizado con una dimensión ¹ H RMN plataformas basadas en. Una interesante discusión sobre los diversos métodos de análisis disponibles para propósitos de perfil metabólico ha sido recientemente publicado por Ryan et al. ^27.

El metabolismo hepático se evaluó por no destructivos ¹ H HR MAS espectroscopía de RMN. Se eligió este método porque no requiere una etapa de extracción, que destruye el tejido y los resultados de la oxidación de compuestos altamente reactivos como el glutatión. ^{1H NMR} basada en perfiles metabólicos también presenta la ventaja de ofrecer un perfil metabólico no directo de la biopsia. Por lo tanto, permite la observación de una amplia gamade los metabolitos del ácido que cubren energía, aminoácidos, nucleótidos vías de tensión, metilamina y oxidativo relacionados. La única restricción es el límite de detección, que varía en función de la estructura molecular de un compuesto. De hecho, el límite de detección se determina por la química (es decir, metabolito) concentración, así como el número de protones dando el pico de resonancia y su entorno químico. Identificación de resonancias metabolito también puede ser difícil sobre la base de ^un H HR MAS espectros de RMN solo y es lo que aconseja llevar a cabo algunos experimentos adicionales 2D RMN para confirmar las asignaciones (es decir, J-resuelto, COSY, TOCSY, HSQC, HMBC experimentos ^{28-30) 31,32.} Este ¹ H HR técnica de RMN MAS se utiliza comúnmente para los estudios de metabonomic, en cuyo caso el uso de la estadística multivariante (también llamados métodos de reconocimiento de patrones) es necesario ^33. El ¹ H RMN métodos basados ​​en los perfiles metabólicos descritos en este protocolo han sido ampliamente aplicado a diversas biocondiciones lógicas y no se limitan al análisis de orina y muestras de hígado de ^34-36. General, los protocolos de preparación de muestras para RMN basados ​​en metabonómica han sido revisados ​​por Beckonert et al. ^18,37.