Évaluer les changements métaboliques hépatiques pendant la colonisation progressive des axéniques de souris par ¹ H NMR Spectroscopy

1. La colonisation du germe sans animaux et la collecte de l'échantillon

1. Retirer les animaux sans germes d'isolateurs et de les héberger dans une salle de l'élevage dans des cages conventionnelles équipés d'un filtre à l'avant des animaux conventionnels qui servent de témoins (figure 1).
2. Mélanger la moitié de la litière (3 jours) prises de la cage de commande classique avec la litière des animaux sans germes. Toujours garder un tiers de la litière sale conventionnels chaque fois qu'il est nécessaire de le renouveler afin de maintenir un niveau de bactéries (il conserve pendant au moins 3 jours).
3. Recueillir l'urine dans un microtube de 1,5 ml par une manipulation de la souris sur le tube et aider à la miction par masser doucement l'intestin. Snap-geler immédiatement dans l'azote liquide. Stockez au moins à -40 ° C jusqu'à l'analyse par RMN. Un volume minimum de 20 uL est nécessaire pour l'acquisition d'une sonde RMN de 5 mm, mais il est recommandé d'utiliser 30 uL d'améliorer la qualité de profilage métabolique.
4. Les animaux doivent be euthanasié sans l'utilisation d'anesthésiques afin d'éviter les résonances RMN confusion due à un métabolisme hépatique de composés anesthésiques (par exemple, utiliser dislocation cervicale suivie d'une confirmation de la mort par exsanguination)

2. Recommandation pour la collecte de la biopsie du foie

1. Ne pas utiliser tout produit contenant de l'alcool pour éviter toute contamination. Laver les outils utilisant la solution d'eau ou une solution saline.
2. Ne pas percer la vésicule biliaire. En cas de fuite biliaire, laver immédiatement avec de l'eau des tissus ou de solution saline.
3. Recueillir des biopsies du foie (environ 15-50 mg) dans le lobe gauche, comme illustré dans la figure 2. Pour les biopsies reproductibles, de collecter de manière cohérente dans le centre du lobe gauche en évitant les zones périphériques où le tissu est plus mince.
4. Aligner les biopsies geler dans l'azote liquide immédiatement et les stocker à -80 ° C jusqu'à l'analyse par RMN.

3. ^RMN 1H acquisition de l'urine microvolume

. 4 ¹ H RMN HR MAS de tissu biopsie du foie: la préparation des échantillons

1. MAS composants du rotor et les outils sontdécrit dans la figure 4.
2. Insérer une biopsie (environ 15-50 mg) dans le rotor de zirconium (figure 4) (1) et remplissez le reste du volume avec pure O ₂ D pour la RMN serrure. Attention à ne pas faire remonter les bulles car cela altérer la qualité du calage ultérieur et la qualité de l'acquisition de données.
3. Insérer entretoise 50 uL Téflon (figure 4 (2)) en utilisant les vis cylindrique (figure 4 (5)). Dévissez et c'est calibrer en utilisant la jauge de profondeur sur le côté court (figure 4 (8)). À cette étape, il est important de prêter une attention particulière à l'échantillon, car une partie de cela peut fuir à travers le trou d'espacement. Si cela est le cas, alors une partie de la biopsie est détruit et le poids de l'échantillon n'est plus fiable. Il est donc nécessaire de recommencer depuis le début de la préparation de l'échantillon.
4. Placez la broche thead (figure 4 (3)) et vissez doucement avec le tournevis (figure 4 (6)). Sécher l'eau résiduelle avec un morceau de tissu.
5. Placez le couvercle (Figure 4 (4)) à lasupérieur du rotor et l'insérer dans l'emballeur du rotor (figure 4 (6)). Appuyez fermement jusqu'à ce que le bouchon est en place. Il ne doit pas être tout espace laissé entre le rotor et son capuchon.
6. Mark moitié de la partie inférieure du rotor en utilisant un marqueur noir pour permettre la détection optique de vitesse de rotation.
7. Placer le rotor à l'intérieur du spectromètre RMN et commencer à tourner à 5 kHz. Acquérir ^spectre RMN 1H utilisant CPMG séquence d'impulsions ^13, conformément aux directives du fabricant.
8. Utilisez la résonance α glucose anomérique à 5,22 ppm (doublet) pour calibrer les spectres RMN.
9. Pour déballer le rotor, procéder en enlevant le bouchon en utilisant le déménageur bouchon (figure 4 (9)). Dévissez et retirez thead broches téflon entretoise en utilisant la vis cylindrique. Laver abondamment à l'eau et de détergent.

5. Les résultats représentatifs

L'activité microbienne intestinale peut être contrôlée en utilisant le profilage métabolique urinaire. Un grand nombre de microbes urinairesco-métabolites identifiables ^par RMN 1H ont été décrits dans la littérature ^7,14-17. Ces microbes de co-métabolites sont particulièrement utiles pour surveiller le processus de colonisation car ils fournissent un moyen rapide et non invasive pour estimer quand l'écosystème nouvellement établie est stable. La figure 5A illustre clairement l'apparition d'microbienne intestinale co-métabolites sur le processus de colonisation. Cette figure montre un profil métabolique urinaire obtenu en suivant la procédure décrite à l'étape 2 pour un animal colonisé 20 jours en utilisant la procédure décrite à l'étape 1. Cet animal n'a pas excréter le sulfate de toute indoxyle et les montants très peu de phenylacetylglycine (PAG) et p-crésol sulfate à l'état de germe de frais (jour 0-bleu). Comme la colonisation progresse, ces trois marqueurs du métabolisme des protéines par le microbiote intestinal augmente considérablement pour atteindre un équilibre à jour 20 (rouge). Ceci est particulièrement facile à suivre pour un groupe d'animaux, comme illustré sur la figure 5B en utilisant le PAGrésonance. Ce diagramme a été obtenue en intégrant la surface sous les résonances surlignées en gris sur la figure 5A (δ 7,40 à 7,43), ce qui correspond à une résonance particulière (triplet) de GCP pour un groupe de 7 animaux.

¹ H à haute résolution Magic Angle Spinning (MAS RH) La spectroscopie RMN est une technique non destructive qui permet des acquisitions rapides et reproductibles de profils métaboliques de tout type de biopsie de ^{18 ans.} Dans ce protocole, nous avons utilisé cette technique puissante pour obtenir un profil métabolique hépatique de deux souris avant (bleu) et après (rouge) colonisation (figure 6). Ce chiffre illustre bien l'information qui peut être dérivé d'un profil métabolique RMN MAS-fondée. De nombreux acides aminés ainsi que des métabolites issus de métabolisme énergétique comme le glucose, le glycogène, le lactate, les triglycérides, (D)-3-hydroxybutyrate et nicotinurate peuvent être visualisées. Ces profils contiennent également des informations pertinentes au stress oxydatif (c'est à dire un ascorbiquecid, le glutathion), métabolisme des nucléotides (c'est à dire l'inosine, uridine) et le métabolisme de la méthylamine (c.-choline, la triméthylamine-N-oxyde). Dans cet exemple, il est très clair que le germe sans souris affiche presque pas de glycogène et de très faibles quantités de glucose et de triglycérides comme cela a été précédemment publiées ^7.

Figure 1. Présentation du protocole colonisation. Animaux axéniques et conventionnelles sont logés dans des cages équipées de filtres côté à côte et leurs portées sont échangées afin de permettre la colonisation progressive du microbiote intestinal conventionnel (1). L'activité microbienne intestinale est surveillé en utilisant ¹ H RMN profilage métabolique basé (2-3). Le métabolisme hépatique est évalué par ^une MAS RH H profilage métabolique par RMN basé (4-5).

Figure 2. Souris vivanteAnatomie r. Le foie est affiché comme du côté plat de l'orgue fait face à la table. Pour les biopsies reproductibles, il est conseillé de toujours prélever des échantillons à partir du centre du lobe gauche, comme indiqué par le rectangle en pointillés.

Figure 3 1,7 mm RMN kit capillaire pour travailler avec microvolumes clés:.. 1: 2,5 microtube RMN mm, 2: 1,7 mm RMN tube capillaire, 3: adaptateur capillaire, 4: tige d'extraction.

Équipements MAS Figure 4 rotors principaux:.. 1: rotor MAS, 2: 50 uL entretoise en téflon, 3: thead broches, 4: CAP, 5: Vis cylindrique, 6: tournevis, 7: rotor conditionneur, 8: jauge de profondeur.

Figure 5. Évolution des profils métaboliques urinaires durant colonization.

1. Zoom sur la région aromatique des spectres entre 6.8 à 7.8 ppm, où la co-métabolites microbiens peuvent être visualisées. Spectres RMN ¹ H ont été obtenues à partir d'un seul individu au jour 0 (bleu), 4 (vert), 15 (orange) et 20 (rouge) l'après-colonisation. La zone grise correspond à la zone qui a été intégrée pour rendre le schéma B. clés: 1-MeHistamine: 1-méthylhistamine; indoxyl-S: le sulfate de Indoxyl;:; Son p-crésol-S Histidine: le sulfate de p-crésol; PAG : Phenylacetylglycine.
2. La concentration moyenne durant la colonisation PAG (n = 7). T de Student-test a été utilisé pour comparer la différence de concentration en PAG à divers points de temps: a: p <0,05 par rapport au jour 0, b: p <0,01 par rapport à 10 jours.

Figure 6. Typique de 600 MHz ¹ H HR spectres RMN MAS de biopsies du foie provenant germ-free (en bleu) et ex-germ-free (red) les souris. Protons en gras sont responsables de la résonance de triglycérides clés:. 3-HB: 3-hydroxybutyrate, le GSH: glutathion réduit, TG: triglycérides, OTMA: triméthylamine-N-oxyde.

Dans ce protocole, nous avons décrit une procédure de colonisation progressive dans un milieu ouvert aux autres d'étudier l'impact du microbiote intestinal sur le métabolisme hépatique évalué par ¹ H RMN HR MAS profilage des intacte biopsie. Diverses méthodes de la colonisation ont été décrits dans la littérature. Les méthodes les plus communes de coloniser les animaux avec un microbiote sont définis par gavage oral ou de l'eau potable contaminée ^19,20. L'inoculation fécale peut également être utilisé comme décrit précédemment ^21. La méthode de colonisation présenté ici est dérivée d'une "normalisation" méthode des animaux sans germes décrits par Koopman JP et al. en 1986 ^22. Dans cette publication, les auteurs placé un animal vivant classique dans l'isolateur parmi les animaux sans germes. Toutefois, il n'est pas toujours possible de garder les animaux dans des isolateurs, surtout si elles doivent être manipulées pendant le processus de colonisation (ce qui est particulièrement difficile si l'échantillon Collection est nécessaire). Une alternative est donc à la maison de l'ex-germ-free animaux dans un environnement classique ouverte en présence de la litière souillée par des animaux conventionnels qui seront utilisés comme témoins. De cette façon, la manipulation des animaux à des fins de colonisation est minime et que cela entraîne moins de stress par rapport à gavage oral. Cette méthode permet également une colonisation progressive de l'intestin qui est plus proche d'un processus de colonisation naturelle et offre une colonisation homogène des animaux partageant la même cage que démontré par DGGE (électrophorèse sur gel dénaturant Gradient) l'évaluation des profils d'ADN microbiens (disponible en tant que matériel supplémentaire dans les Claus et al. ^7).

Suivi du processus de colonisation par le profilage métabolique urinaire est un non-invasive, facile, rapide et efficace pour détecter lorsque l'activité microbienne devient stable. Comme il n'est pas nécessaire de manipuler les animaux chaque jour à cette fin, comme le montre la figure 5B, le niveau de stress est maintenue àson minimum. Il convient de mentionner que même si la colonisation est initiée par une litière souillée par les animaux de contrôle classique, il est nécessaire de garder un nombre égal de ceux des animaux témoins qui permettent d'estimer les effets mitigés du stress et du vieillissement sur le métabolisme hépatique. D'autres techniques basées sur la spectrométrie de masse (MS), tels que la GC-MS (chromatographie gazeuse) ou LC-MS (chromatographie liquide) peut également être utilisé pour déterminer la co-microbiens urinaires des métabolites ainsi que pour obtenir un profil métabolique des échantillons liquides (ie l'urine, le plasma, les extraits de tissus), mais ils ne peuvent pas être appliqués sur des tissus intacts biopsie. GC-MS a été appliquée avec succès à une analyse ciblée des acides gras volatils stables ^23. Cette technique nécessite une étape de dérivatisation qui introduit des biais qui doivent être soigneusement examinées au cours de l'analyse des données ^24. LC-MS peut être particulièrement utile pour améliorer la détection des microbes de co-métabolites dans le profilage ciblé ^25. Bien queprofilage métabolique non ciblées LC-MS améliore considérablement la sensibilité de détection de métabolites de faible concentration, l'identification peut être difficile et un grand nombre de métabolites détectés peut rester non affecté ^26. Par conséquent, la plupart des études non ciblées métabonomique ont été réalisées avec une dimension ¹ H RMN des plates-formes. Une discussion intéressante sur les différentes méthodes analytiques disponibles à des fins de profilage métabolique a été publié récemment par Ryan et al. ^27.

Le métabolisme hépatique a été évaluée par ^une non destructif MAS RH H spectroscopie RMN. Cette méthode a été choisie car elle ne nécessite pas une étape d'extraction qui détruit les tissus et provoque l'oxydation des composés très réactifs tels que le glutathion. Profilage ¹ H RMN métaboliques basée présente également l'avantage d'offrir un profil non ciblée du métabolisme de la biopsie. Il permet donc l'observation d'une large gammede métabolites couvrant énergique, des acides aminés, les voies de stress nucléotides, la méthylamine et oxydatifs liés. La seule restriction est la limite de détection qui varie selon la structure moléculaire d'un composé. En effet, la limite de détection est déterminée par le produit chimique (c.-métabolite) de concentration ainsi que le nombre de protons donnant le pic de résonance et de leur environnement chimique. Identification des résonances métabolite peut aussi être difficile basé sur ¹ MAS RH spectres RMN H seul et il est donc conseillé d'effectuer quelques expériences supplémentaires RMN 2D pour confirmer les affectations (c. J-résolu, COSY, TOCSY, HSQC, HMBC expériences ^{28-30) 31,32.} Cette ^une technique de RMN H HR MAS est couramment utilisé pour des études métabonomique, auquel cas l'utilisation des statistiques multivariées (aussi appelées méthodes de reconnaissance des formes) est nécessaire ^33. La ^RMN 1H des méthodes basées sur le profilage métabolique décrite dans ce protocole ont été largement appliquées à différentes bioconditions logiques et ne sont pas limitées à l'analyse d'urine et des échantillons de foie ^34-36. Général des protocoles de préparation d'échantillons pour la RMN à base métabonomique ont été examinés par Beckonert et al. ^18,37.