Valutare alterazioni metaboliche epatiche durante la colonizzazione progressiva di Germe senza mouse da ¹ H spettroscopia NMR

1. Colonizzazione di germi senza animali e la raccolta dei campioni

1. Rimuovere sterile animali da isolatori e la casa in una stanza di allevamento in gabbie tradizionali dotati di filtro davanti alla animali convenzionali, che servirà come controlli (Figura 1).
2. Mescolare mezzo della cucciolata (3 giorni) preso dalla gabbia di controllo convenzionale con la lettiera del germe senza animali. Tenere sempre 1 / 3 della lettiera sporca convenzionale ogni volta che è necessario rinnovarlo al fine di mantenere un livello di batteri (tenerlo almeno per 3 giorni).
3. Raccogliere l'urina in un microtubo 1,5 ml gestendo il mouse sopra il tubo e aiutare minzione da massaggiare delicatamente l'intestino. Snap-congelare immediatamente in azoto liquido. Memorizzare almeno a -40 ° C fino al momento dell'analisi NMR. Un volume minimo di 20 l è necessario per l'acquisizione con una sonda NMR 5 millimetri, ma si consiglia di utilizzare 30 microlitri per migliorare la qualità dei profili metabolici.
4. Gli animali devono be l'eutanasia, senza uso di anestetico per evitare risonanze NMR confusione a causa del metabolismo epatico di composti anestetici (per esempio, utilizzare dislocazione cervicale seguito da conferma della morte per dissanguamento)

2. Raccomandazione per la raccolta della biopsia epatica

1. Non utilizzare alcun prodotto contenente alcol per evitare la contaminazione. Lavare gli attrezzi con acqua o soluzione salina.
2. Non perforare cistifellea. In caso di perdita di bile, lavare tessuto immediatamente con acqua o soluzione salina.
3. Raccogliere biopsie epatiche (circa 15-50 mg) dal lobo sinistro come mostrato nella Figura 2. Per le biopsie riproducibile, raccogliere costantemente al centro del lobo sinistro evitando le zone periferiche dove il tessuto è più sottile.
4. Snap biopsie congelare in azoto liquido immediatamente e conservarli a -80 ° C fino al momento dell'analisi NMR.

3. Acquisizione ¹ H NMR di urina microvolumi

. 4 ¹ H NMR HR MAS di tessuto biopsia epatica: la preparazione del campione

1. MAS di componenti di rotori e gli strumenti sonodescritto nella Figura 4.
2. Inserire biopsia (circa 15-50 mg) in zirconio rotore (Figura 4 (1)) e riempire il resto del volume con puro D ₂ O per NMR di blocco. Fare attenzione a non fare le bolle, perché questo altererebbe la qualità della spessoramento successive e la qualità di acquisizione dei dati.
3. Inserire 50 microlitri distanziatore in teflon (figura 4 (2)), utilizzando la vite cilindrica (figura 4 (5)). Svitare e calibrare usando il misuratore di profondità sul lato corto (figura 4 (8)). A questo punto, è importante prestare una specifica attenzione al campione perché una parte di esso può fuoriuscire attraverso il foro distanziatore. Se questo è il caso, allora parte della biopsia viene distrutta e il peso del campione non è più affidabile. E 'quindi necessario ricominciare dall'inizio la preparazione del campione.
4. Posizionare il perno thead (Figura 4 (3)) e avvitare delicatamente con il cacciavite (Figura 4 (6)). Asciugare l'acqua residua con un pezzo di tessuto.
5. Posizionare il tappo (figura 4 (4)) alsuperiore del rotore e di inserirlo nel packer rotore (Figura 4 (6)). Premere con decisione fino a quando il tappo è a posto. Non ci dovrebbe essere alcuno spazio lasciato tra il rotore e il suo tappo.
6. Segna la metà del fondo del rotore con una penna nera marker per consentire il rilevamento ottico velocità di rotazione.
7. Posizionare il rotore all'interno dello spettrometro NMR e iniziano a girare a 5 kHz. Acquisire ¹ H NMR utilizzando CPMG sequenza di impulsi ¹³ secondo le linee guida del produttore.
8. Utilizzare la risonanza glucosio anomerico α a 5,22 ppm (doppietta) per calibrare gli spettri NMR.
9. Per decomprimere il rotore, procedere togliendo il tappo utilizzando il dispositivo di rimozione tappo (figura 4 (9)). Svitare thead pin e rimuovere distanziatore in Teflon con la vite cilindrica. Lavare accuratamente con acqua e detersivo.

5. Rappresentante Risultati

Attività microbica intestinale può essere monitorato tramite il profiling metabolico urinario. Un gran numero di microrganismi urinarico-metaboliti identificabili da ¹ H NMR sono stati descritti in letteratura ^7,14-17. Questi co-metaboliti microbici sono particolarmente utili per monitorare il processo di colonizzazione in quanto forniscono un modo rapido e non invasivo per valutare quando l'ecosistema di nuova costituzione è stabile. 5A figura illustra chiaramente l'aspetto del microbica intestinale co-metaboliti sul processo di colonizzazione. Questa figura mostra un profilo metabolico urinario ottenute seguendo la procedura descritta al punto 2 per un animale colonizzata 20 giorni utilizzando procedura descritta al punto 1. Questo animale non espellere qualsiasi solfato indossile e quantità molto piccola di phenylacetylglycine (PAG) e p-cresolo solfato presso il germe senza stato (giorno 0-blu). Come colonizzazione avanza, questi 3 marcatori del metabolismo delle proteine ​​dalla flora intestinale aumenta notevolmente per raggiungere un equilibrio al giorno 20 (rosso). Ciò è particolarmente facile da monitorare per un gruppo di animali, come illustrato in Figura 5B con il PAGrisonanza. Questo diagramma è stato ottenuto integrando l'area sotto le risonanze evidenziate in grigio nella Figura 5A (δ 7,40-7,43), corrispondente ad una risonanza specifica (tripletta) di PAG per un gruppo di 7 animali.

¹ H ad alta risoluzione Magia Angle Spinning (MAS HR) spettroscopia NMR è una tecnica non distruttiva che permette acquisizioni rapido e riproducibile di profili metabolici di ogni tipo di biopsia ^18. In questo protocollo, abbiamo usato questa tecnica potente per ottenere un profilo metabolico epatico di 2 topi prima (blu) e dopo (rosso) colonizzazione (Figura 6). Questa figura illustra bene le informazioni che possono essere derivati ​​da un MAS NMR basati su profilo metabolico. Numerosi aminoacidi e metaboliti derivati ​​da metabolismo energetico come il glucosio, il glicogeno, lattato, trigliceridi, (D)-3-idrossibutirrato e nicotinurate possono essere visualizzati. Questi profili contengono anche informazioni utili per lo stress ossidativo (cioè un ascorbicocid, glutatione), il metabolismo dei nucleotidi (cioè inosina, uridina) e il metabolismo metilammina (cioè colina, Trimetilammina-N-ossido). In questo esempio, è molto chiaro che la priva di germi del mouse viene visualizzata quasi glicogeno e gli importi molto bassi di glucosio e trigliceridi, come è stato precedentemente pubblicato ^7.

Figura 1. Panoramica del protocollo di colonizzazione. Animali germ-free e convenzionali sono alloggiati in gabbie dotate di filtri fianco a fianco e le loro cucciolate vengono scambiati per consentire progressiva colonizzazione dalla flora intestinale convenzionale (1). Attività microbica intestinale è controllata mediante ¹ H NMR del profilo metabolico-based (2-3). Il metabolismo epatico è valutata da ¹ H HR MAS NMR basati su profili metabolici (4-5).

Figura 2. Topo vivor anatomia. Il fegato viene visualizzato come il lato piatto dell'organo di fronte al tavolo. Per le biopsie riproducibile, si consiglia di raccogliere campioni da sempre al centro del lobo sinistro, come indicato dal rettangolo tratteggiato.

Figura 3 1.7 mm Kit NMR capillare di lavorare con microvolumi chiave:.. 1: 2,5 microtubo NMR mm, 2: 1,7 mm Tubo NMR capillare, 3: adattatore capillare, 4: asta di estrazione.

. Figura 4 MAS attrezzature rotore chiave: 1.: Rotore MAS, 2: 50 microlitri distanziatore in Teflon, 3: THEAD pin, 4: cappuccio, 5: vite cilindrica, 6: cacciavite, 7: rotore packer, 8: profondimetro.

Figura 5. Evoluzione dei profili metabolici urinari durante colonization.

1. Zoom sulla regione aromatica degli spettri tra 6,8-7,8 ppm in cui microbica co-metaboliti possono essere visualizzati. Spettri ¹ H NMR sono stati ricavati da un singolo individuo, al giorno 0 (blu), 4 (verde), 15 (arancione) e 20 (rosso) post-colonizzazione. La zona grigia corrisponde alla zona che è stata integrata per rendere il diagramma in B. chiave: 1-MeHistamine: 1-methylhistamine; indossile-S: solfato indossile;:; suo p-cresolo, S Istidina: solfato di p-cresolo; PAG : Phenylacetylglycine.
2. PAG concentrazione media durante la colonizzazione (n = 7). Student t-test è stato utilizzato per confrontare la differenza di concentrazione PAG a vari time-punti: a: p <rispetto al giorno 0 0.05; b: p <0,01 rispetto al giorno 10.

Figura 6. Tipiche 600 MHz ¹ H HR spettri NMR MAS di biopsie epatiche derivate da privo di germi (blu) ed ex-priva di germi (rid) i topi. Protoni in grassetto sono responsabili per la risonanza trigliceridi chiave:. 3-MP: 3-idrossibutirrato, GSH: glutatione ridotto, TG: trigliceridi, TMAO: Trimetilammina-N-ossido.

In questo protocollo, abbiamo descritto una procedura di progressiva colonizzazione in un ambiente aperto di approfondire l'impatto della flora intestinale sul metabolismo epatico valutate di ¹ profiling H NMR HR MAS di intatto biopsia. Vari metodi di colonizzazione sono state descritte in letteratura. I metodi più comuni per colonizzare gli animali con un microbiota definiti sono sonda gastrica o l'acqua potabile contaminata ^19,20. Inoculazione fecale può essere utilizzato anche come descritto in precedenza ^21. Il metodo di colonizzazione presentato qui è derivato da un metodo di "normalizzazione" degli animali germ-free descritto da Koopman JP et al. nel 1986 ^22. In questa pubblicazione, gli autori hanno messo un animale vivente convenzionale nel isolatore tra il germe senza animali. Tuttavia, non è sempre possibile mantenere gli animali in isolatori, soprattutto se hanno bisogno di essere manipolato durante il processo di colonizzazione (questo è particolarmente difficile se campione collection è richiesto). In alternativa è quindi quella di casa ex-privo di germi animali in un ambiente convenzionale aperto in presenza di rifiuti contaminati da animali convenzionali che saranno utilizzati come controlli. In questo modo, la manipolazione degli animali a scopo di colonizzazione è minimo e questo si traduce in minore sforzo rispetto alla sonda gastrica. Questo metodo permette anche una progressiva colonizzazione dell'intestino che è più vicino ad un processo di colonizzazione naturale e offre una colonizzazione omogenea di animali condividono la stessa gabbia, come dimostrato da DGGE (elettroforesi su gel denaturante Gradient) valutazione dei profili di DNA microbico (disponibile come materiale supplementare in Natale et al. ^7).

Il monitoraggio del processo di colonizzazione da profili metabolici urinari è un non invasivo, semplice, veloce ed efficace per rilevare quando l'attività microbica diventa stabile. Poiché non è necessario manipolare gli animali ogni giorno a tale scopo, come mostrato nella Figura 5B, il livello di stress è tenuto asuo minimo. È degno di nota ricordare che anche se la colonizzazione è iniziata da una lettiera sporca da animali di controllo convenzionale, è necessario mantenere lo stesso numero di quegli animali di controllo che permettono di stimare gli effetti misti dello stress e dell'invecchiamento sul metabolismo epatico. Altre tecniche sulla base di spettrometria di massa (MS) quali la GC-MS (gascromatografia) o LC-MS (cromatografia liquida) può anche essere usato per determinare microbiche urinarie co-metaboliti nonché di ottenere un profilo metabolico dei campioni liquidi (cioè l'urina, plasma, estratti di tessuto), ma non possono essere applicati sul tessuto bioptico intatti. GC-MS è stata applicata con successo per l'analisi mirata di stabili acidi grassi volatili ^23. Questa tecnica richiede un passo derivatizzazione che introduce distorsioni che devono essere attentamente presi in considerazione durante l'analisi dei dati ^24. LC-MS può essere particolarmente utile per migliorare l'individuazione di metaboliti microbici co-in profilazione mirata ^25. Sebbenenon mirati LC-MS profiling metabolico migliora notevolmente la sensibilità di rilevazione di metaboliti a bassa concentrazione, l'identificazione può essere difficile e un gran numero di metaboliti rilevati possono rimanere non assegnate ^26. Pertanto, la maggior parte degli studi non mirati metabonomic sono state effettuate utilizzando una dimensione ¹ H NMR basati su piattaforme. Una interessante discussione dei vari metodi analitici a disposizione a fini di profilazione metabolica è stato recentemente pubblicato da Ryan et al. ^27.

Metabolismo epatico è stata valutata da non distruttivo ¹ H HR MAS spettroscopia NMR. Questo metodo è stato scelto perché non richiede una fase di estrazione che distrugge il tessuto e determina l'ossidazione dei composti altamente reattivi come il glutatione. ¹ H NMR basati su profili metabolici presenta anche il vantaggio di offrire un profilo non mirati metabolico della biopsia. Permette quindi l'osservazione di una vasta gammametaboliti di copertura energetica, aminoacidi, i percorsi di stress nucleotide, metilammina e ossidativo correlati. L'unica restrizione è il limite di rilevazione che varia a seconda della struttura molecolare di un composto. Infatti, il limite di rilevazione è determinato dalla chimica (cioè metabolita) concentrazione così come il numero di protoni dando al picco di risonanza e il loro ambiente chimico. Identificazione di risonanze metabolita può anche essere difficile sulla base di ¹ H HR spettri MAS NMR sola ed è quindi consigliato di eseguire alcuni esperimenti NMR 2D in più per confermare le assegnazioni (ad esempio J-risolto, COSY, TOCSY, HSQC, HMBC esperimenti ^{28-30) 31,32.} Questa H ¹ HR MAS NMR tecnica viene comunemente utilizzato per gli studi metabonomic, nel qual caso l'uso della statistica multivariata (chiamati anche metodi di pattern recognition) è necessario ^33. L'H ¹ NMR basati su metodi di profiling metabolico descritto in questo protocollo sono stati ampiamente applicati a vari biocondizioni logiche e non si limitano all'analisi dei campioni di urina e fegato ^34-36. Generale i protocolli di preparazione del campione per NMR basati metabonomica sono stati esaminati dagli Beckonert et al. ^18,37.