简单而强大在体内和在体外方法研究病毒大会

1。植物材料

1. 烟草在包壳实验中使用的植物应该是在4叶期（约3-4周老厂）。

2。植物注射浸润细胞病毒基因组的功能部件的交付和表达

1. 第1天：农杆菌菌株（如高血压105或GV 3101）窝藏pCass-BMV RNA，BMV RNA 2和BMV RNA 3 ^1,2种植为辅，卡那霉素50毫克/毫升LB琼脂板（选择农杆菌pCASS载体）和利福平100mg/ml（选择）。孵化器在28°C正在开展为期两天。
2. 第3天：从到2毫升含有50毫克/毫升，卡那霉素和利福平100毫克/毫升，1天在28°Ç轨道摇床设定在250转的LB肉汤LB琼脂平板上接种单菌落。
3. 第4天：接种50毫升的LB肉汤补充卡那霉素和100 mg / ml的利福平，10毫米MES的pH为5.6毫克/毫升和100毫米ED 50乙酰丁香酮与文化毫升在250毫升三角瓶，16小时在28°的轨道摇床在250 RPMÇ 。
4. 第5天：文化转移（外径₆₀₀时达到1.0）橡树岭管或无菌猎鹰管和离心机于5000 rpm 10分钟，在4°C
5. 溶于10毫升的10 mM MgCl _2的离心沉淀10分钟，于5000 rpm，在4°C，重复这一步，更多的时间，以确保完全去除抗生素。
6. 暂停10毫升含有MgCl _2的 10毫米和10毫米的MES（pH值5.6）的缓冲沉淀。
7. 衡量每个BMV RNA的RNA的1，2和RNA 3文化的OD ₆₀₀调整到₆₀₀外径0.1使用10毫米MgCl _2的和10mm MES（pH值5.6）。
8. 混合1毫升每所有三个0.1外径₆₀₀文化停牌。
9. 添加乙酰丁香酮100毫米，搭配绅士LY和混合物不受干扰，在室温下保持3小时。
10. 吸引到培养液1毫升。注射器没有针头。
11. 2-3扩大北叶的背面一侧渗入以上文化暂停本生 （5叶期，老厂3-4周），轻轻按下一个半叶的背面表面注射器。
12. 这种渗透过程重复到其他叶片。
13. 绿房子保持在24°C的渗透植物
14. 收获渗入3到4天的渗透（dpi）的叶。

3。 BMV病毒颗粒的纯化

1. 收集N。本生留下一个包含所有三个野生型BMV agrotransformants混合物agroinfiltrated。
2. 在无菌杵和迫击炮叶片研磨与等量的：BMV提取缓冲液（0.5 M的醋酸钠（W / V）; 0.08 M MgAc，pH值4.5和1/100，这是要在使用前添加β-巯基乙醇的体积^）3。为了最大限度地提高病毒产量，建议加酸水洗砂（约0.5-1克），有利于细胞破碎容易磨和高效。
3. 通过2-3层薄纱布叶提取物的筛选，收集乱舞。
4. 再次研磨的薄纱布上的留成部分与BMV提取液等体积的叶片材料的初始重量。
5. 重复过滤程序，用薄纱布。这些步骤应在4°C进行
6. 滤液转移到离心管中，并添加5分钟，在室温下预冷的氯仿和涡量相等（或震动），直到悬浮液的颜色变成浅绿色。
7. 离心15分钟，12,000 RPM乳化的解决方案，在4°C。
8. 收集水相，搅拌30分钟，以消除任何残留氯仿磁力搅拌器。
9. 暂停转移到无菌超离心管。
3。
10. 在贝克曼超速离心机为3小时，在30000转离心4°C。
11. 弃上清，并暂停BMV暂停缓冲量所需的颗粒（准备用无菌蒸馏水悬浮缓冲液稀释BMV提取液的1/10）。
12. 从上面的步骤部分纯化的病毒粒子的制备受到150分钟28000转的10-40％蔗糖密度梯度离心，在4°C
13. 收集病毒带手动或由分馏。病毒带将出现蓝白色的光照下。
14. 稀蔗糖溶液含有至少50％的病毒样本与病毒悬浮缓冲。
15. 3个小时在贝克曼超速离心机转速在30000离心稀释病毒含有蔗糖溶液在4°C。
16. 最后暂停在VIR所需量的高纯度的病毒颗粒我们暂停缓冲。
17. 测量外径₂₆₀分光光度计（毫克/毫升）的病毒颗粒的浓度。

注：基于RNA的含量，为BMV的消光系数是5 ^4。

19. 验证纯度的病毒颗粒的透射电镜下观看（图A）

4。在体外组装衣壳蛋白亚基的制备

1. 准备1X病毒分离缓冲液（0.5 M的_氯化钙 ;的50 mM Tris盐酸，pH值7.5，1.0毫米EDTA;数码地面1.0毫米，0.5毫米PMSF）1升^5。
2. 准备透析膜，根据Sambrook 等 ^6。
3. 免除需要将透析袋纯化病毒的浓度。
4. 放入包含1X病毒分离缓冲区烧杯中含有的病毒透析袋。
5. 透析24小时内，在4°Çwhilé搅拌。
6. 在12000 XG 15分钟收集24小时后，离心透析袋的解决方案，在4°C。这将BMV RNA的分离游离的病毒粒子。
7. 收集上清贝克曼离心机35000转和3个小时在4°C至颗粒任何未游离的病毒粒子的离心机。
8. 收集上清。
9. 在这个阶段，当务之急是从任何污染的病毒粒子RNA的分离衣壳蛋白亚基。要做到这一点，从第8步上清应受到另一轮重组衣壳蛋白亚基超过晚上不添加任何核糖核酸（RNA 1X装配缓冲，见下文），由高速离心（30,000 rpm的3小时在4°c）颗粒任何组装病毒颗粒。这个重组的步骤后，上清含外壳蛋白亚基将无任何残留污染的RNA。然而，以确保这一点，它是最好执行附加在V体外重组与利用RNA 1X装配缓冲唯一的外壳蛋白亚基。经过一夜重组，准备必须是自由组装病毒颗粒（验证用TEM）。
10. 在外径254和280 nm测量或其他方法，如Bradford法确定的衣壳蛋白亚基的浓度。
11. 执行12-15％的SDS-PAGE印迹，以确定分离衣壳蛋白亚基的完整性。

5。含有病毒颗粒的RNA 在体外装配

1. 准备RNA被重新组装成病毒颗粒的成绩单，并计算浓度^7。
2. 混合衣壳蛋白亚基和转录RNA的比例为1:5（重量/重量^）5。
3. 免除上述混合物透析袋，并妥善保护，以避免任何泄漏。
4. 准备1000毫升。 RNA的，1X装配缓冲液（50 mM氯化钠的50 mM Tris-盐酸，pH值7.2 10毫米氯化钾;氯化镁₂ 5毫米，1.0毫米的数码地面电视^）5。
5. 将透析袋，含有对1X装配缓冲反应混合物倒入烧杯，搅拌。
6. 在4°C透析轻轻搅拌24小时内重新组装反应。
7. 24小时后收集透析袋的混合物，并添加1.5毫升RNA装配缓冲。
8. 通过这种混合物通过Centricon-100柱离心30分钟，在低转速（2000 XG）。
9. 洗一次列在4°C，30分钟装配缓冲1.5毫升。
10. 重复两次以上的洗涤步骤。
11. 最后，通过离心洗脱重新组装的病毒粒子，在10,000 g，4°C下5分钟。
12. 估计在外径260纳米的病毒粒子浓度。

6。制造光学病毒鬼（OVGs）

1. 吲哚菁绿^{（ICG）8日}至所需的浓度比（吲哚本报告中使用的绿色和衣壳蛋白的重量比为1:10）衣壳蛋白的纯化 ð调匀吸取。
2. 透析衣壳蛋白对OVG组装缓冲器（1 M氯化钠和1 mM的数码地面电视，pH4.8，50毫米醋酸钠; 1毫米EDTA）和ICG解决方案，在4°C 24小时。
3. 24小时后，收集透析袋（12 kDa的孔径）和离心机的解决方案，1小时9万转4℃（图B）
4. 去除上清，涡旋或在4°C，允许它本身暂停BMV暂停缓冲隔夜暂停BMV暂停缓冲沉淀
5. 验证通过TEM（图C）OVGs形态。
6. 测量吸光度，从240纳米到950纳米，使用分光光度计（卡里50，瓦里安公司）;证实ICG的存在特征吸收峰大约700 nm和790 nm的^8。 （图D）
7. ICG的典型〜700 nm和800 nm的荧光峰，可以看到后OVG解决方案620 nm激发荧光光谱仪（图D）（3的Fluorolog，乔宾-Yvon公司）。

负染BMV纯化病毒从北 图A. TEM图像本生的植物agroinfiltrated与所有三个野生型的BMV agroconstructs（比例尺= 100纳米）的混合物。

图B颗粒在体外组装，高速离心后，ICG的含OVGs。

图C. TEM图像（比例尺= 100纳米）的负染ICG的含OVGs。

（底部） 图四吸光度（上）和荧光光谱OVGs。激发波长为用于OVG排放瓦特为620纳米。

这里介绍的注射浸润方法，可以广泛适用于广泛的植物病毒。这种方法的一个共同特征是同步交付多个agroconstruct相同的细胞，通常经常使用的植物病毒机械接种相关的一个主要缺点。 在体内和体外装配使用雀麦花叶病毒模型的研究，可以有效地进行，由以下几个小技巧。（i）对于N 的成功渗透本生离开，没有水的浸润前24小时的植物;（二）农杆菌悬浮培养扩散到细胞内的空间，运用自如，如果下午4:00-5:00之间进行渗透;（三）文化的光密度不应超过在₆₀₀外径1.0。浸润的细胞密度较高的agrocultures被称为诱导细胞毒性和叶片衰老^9,10，可能会严重影响病毒复制和随后的病毒粒子形成过程中渗透温和的压力（四）应适用于背面侧叶，以防止叶广泛的破坏，这可能会引发植物的免疫反应;（五）从10％至40％的蔗糖密度梯度可在BMV暂停缓冲25％的蔗糖（添加浓度最高和最低浓度和除以2， 即 10％+ 40％/ 2 = 25％），并立即在-80℃冻结2管-4小时，并进一步使蔗糖保持在4°C在直线位置一夜之间慢慢解冻。