丝绸电影文化系统在体外分析和生物材料设计

Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M. D., Kaplan, D. L., Rosenblatt, M. I. Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design. J. Vis. Exp. (62), e3646, doi:10.3791/3646 (2012).

丝绸薄膜许诺可以在一个研究实验室环境^1,2高保真和经济捏造的蛋白质为基础的生物材料。这些材料是可取的，因为他们所拥有的高度可控的尺寸和材料特性，生物相容性和促进细胞粘附，可以修改，通过地形图案，或通过化学方法改变​​表面，可以作为一种生物活性分子药物相关的应用交付车厂使用^3-8。此外，丝膜是相对简单的定制设计，可以在几分钟之内解散或超过多年在体外或体内降解，并产生与额外的好处是透明的性质，因此非常适合成像应用^{9 - 13。}文化系统的方法，这里介绍一个可扩展的细胞丝膜表面的快速评估方法相互作用。特别感兴趣的是利用表面图案的丝绸薄膜，研究在细胞增殖和细胞的反应差异对齐^12,14。种子文化培养微图案和平面丝膜基板，然后通过时间推移相衬成像，扫描电子显微镜，生化代谢活性和核酸含量的评估评估。总之， 在体外培养体系的丝膜提供了一个可定制的实验装置，研究细胞表面相互作用的生物材料的基板上，然后可以优化，然后在体内模型转化为适合。使用这里的文化系统提出的意见是目前正在使用中的应用范围从基本的细胞相互作用，医疗设备设计，以帮助，因此相关的生物医学领域的广泛。

1。硅橡胶模具制作

1. 生产或购买所需的地形表面的铸造。有关本刊物将一个标准的100毫米的蚀刻硅片（ 图1）。
2. 掂量出聚二甲基硅氧烷（PDMS）灌封（组分A）和催化剂（B组分）在1:9的比例（9克灌封和1 g催化剂），在购买套件提供的解决方案。
3. 混合解决方案，全面启动固化过程。
4. 场所内铸造菜的硅晶片表面。
5. 掂量出到硅片上的PDMS解决方案4.5Ğ。
6. 蔓延的PDMS解决方案，涵盖了100毫米直径的晶圆表面面积。
7. 倾斜的晶圆均匀散布的PDMS解决方案。
8. 直径100毫米的培养皿盖盖上晶圆。
9. 现浇设置到60℃以上烤箱晚上，使得某些固化在一个平面上。
10. 地方治愈的PDMS /硅片到70％的乙醇洗澡前去除。
11. 开始去除从晶圆硅橡胶用刀片，首先解除边缘（整个圆周）。
12. 轻轻拉断钳小心不要撕硅橡胶浇铸在70％乙醇浴中使用的硅橡胶。
13. 冲床出个人的PDMS模具使用14毫米打孔。这个直径的设计以适应24孔板设置。

2。生产的丝绸解决方案

1. ⁷在一个玻璃烧杯，带2 L的蒸馏水（DH _{2 O）}的沸腾。
2. 切成三分之二家蚕蚕茧5Ğ。
3. 广泛污染茧过度昆虫颗粒涂层内的茧表面处理。
4. 测量4.24Ğ碳酸钠。
5. 慢慢加入碳酸钠煮DH ₂ O量，以防止过 ​​水的沸点，并允许完全溶解，然后再继续。
6. 添加茧件沸腾DH
7. 煮沸后，用手工精心排出DH _{2 O的}丝绸提取出来的成片和环，以去除多余的水。
8. 洗丝绸提取20分钟三次。每1 ₂ DH L在实验室烧杯中，用搅拌棒烧杯容积内流通。
9. 经过洗涤，丝绸提取出来的手环和地方蚕丝纤维提取的化学物质罩内，以便为12小时干燥。时期。
10. 第二天，权衡干燥的蚕丝纤维，这是典型〜3.5Ğ：__________-G
11. 准备了20％W / V解决丝绸溴化锂溶液9.3米。利用下列公式计算所需的重量和体积：
    1. （从第10步丝绸提取物重量）×（4）= __________总额9.3米溴化锂溶液的毫升
    2. （807.705）（溴化锂从量的一部分11.A）] / 1000 = __________克至溴化锂添加到DH ₂
    </ LI>
12. 添加到以下DH ₂ O容量的玻璃烧杯测量溴化锂重量：
    1. （0.8）×（从步骤11.A计算量）= __________ DH毫升₂
13. 倒入一个大小合适的量筒这一解决方案，并带来了解决方案最终成交量为部分11.a.计算
14. 放入烧杯丝绸提取物和溴化锂溶液倒在丝纤维确保蚕丝纤维沉浸在溴化锂使用解决实验室锅铲。
15. 溶解丝放入60°C间4小时的烤箱：
    开始时间：___________
    结束时间：___________
16. 使用适当大小的注射器，制定12毫升丝绸解决方案。将一个18G的针头，注射器，然后注入透析卡式（3,500兆瓦的coutoff，滑一仪，Thermo Scientific的）解决方案。填补了录像带后，剩余的空气抽出纸盒空的注射器。
17. 地方科幻在1 L DH _{2 O} lled透析卡带
18. 更改后1小时，4小时，8小时，然后每12小时共6变化的3倍DH ₂ O容量：
    1. 开始：___________
    2. 1小时：_______________
    3. 4小时：_______________
    4. 8小时：_______________
    5. 12小时：_______________
    6. 12小时：_______________
    7. 12小时：_______________
    8. 最终：_______________
19. 透析后，慢慢地收集从磁带用注射器丝绸的解决方案。到10,000 g的额定离心管到位的解决方案。
20. 解决方案的两倍，在4°C离心20分钟每个在10,000 g。经过每个的离心地方上清到一个新的管。
21. 商店THR丝在4℃冰箱中的解决方案。
22. 2吸取0.5毫升到小重量菜，地方丝绸解决方案的样品称量菜内60℃干燥12小时，或直至丝解决方案干燥炉。
23. 从BOT的权衡剩下的固体丝膜Ĥ样本量蛋白浓度来衡量丝绸溶液％重量：
    1. 合并2丝膜样品：______毫克的重量
    2. （从23.a重量）×（100）= ______％真丝

3。丝素膜的制备和文化系统设置

1. 准备的PDMS铸造表面用透明胶带清洗，以去除灰尘。
2. 清洁的PDMS基板浸泡在70％乙醇洗三次DH _{2 O}
3. 放置到14毫米的PDMS模具架板，这通常是一个24孔板盖。
4. 以生产50微米厚的薄膜，传播上的PDMS模具用液体的传播工具，通常是1 mL注射器针尖² 70 8％的丝绸溶液μls。
5. 允许干上一个干净的运行期为90分钟，直到电影霸150的空气流动压力的长凳上发现的丝膜干燥。
6. 一旦电影干燥的地方，整个集电影，包括硅橡胶米孩子，到了4小时产生不溶于水的薄膜，退火水室。这通常是在盆地底部的水空干燥器在25 ¹⁵ kPa的真空室拉。
7. 除去丝膜退火水室和地方到一个干净的长椅。
8. 准备在35毫米培养皿内70％的乙醇浴，和地方的控制基板（如玻璃或塑料表面）和不锈钢戒指，为至少10分钟，消毒水井。
9. 丝膜的PDMS模具使用镊子取出，浸入70％乙醇，1毫升70％乙醇确保图案的一面预先填写的24孔板的样品放入朝上，使细胞粘附。
10. 在每个丝膜样品放入顶部以及相应的地方不锈钢圈重量（内直径11.65毫米，外直径15.45毫米，1.18毫米厚度）。
11. 允许带环的样品孵育10分钟，以确保无菌。
12. 圣雷莫VE的乙醇和1毫升的PBS冲洗每个样品3倍。让每个洗坐5分钟，以便完整扩散。
13. 除去PBS用玻璃吸管吸气，同时确保消除气泡丝膜样品下方的多数。
14. 准备播种的细胞株。作为一个例子，trypsinize人角膜缘上皮细胞（HCLE）线，用0.25％胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）的解决方案，为7分钟。停用胰蛋白酶使用含10％胎牛血清1:1杜尔贝科的改良Eagle培养基（DMEM培养基）通过媒体的体积增加。离心胰酶消化HCLE细胞，角质细胞无血清媒体8毫升（的K-SFM）添加到细胞沉淀轻轻搅拌分散HCLEs的，并产生细胞计数。
15. 样品500μL以及通常使用10,000个细胞/厘米²的密度每HCLE暂停。
16. 孵化器内的地方文化，在37°C和5％CO ₂和运行所需的实验协议。

4。代表结果

（一）21染料的阵列图案根据90毫米直径的硅用人标准光刻和干法刻蚀技术的晶圆生产线表面地形图2。 （二）丝绸电影后保留原来的平行线图案的特点，铸造硅橡胶成型表面。 （三）示意图展示功能尺寸设计选择促进蜂窝对齐。 （四）说明保留平行内衬表面图案的丝绸电影的横截面。

图3。扫描电子显微镜（一）图案秉承的HCLE细胞株（二）在文化2天在的扁丝电影。 HCLE文化继续扩散（三）图案及（D）平面合流文化8天。

图4（A，D和G）的图案和（B，E高）扁丝电影文化HCLE细胞相对（C，F）控制基板玻璃（交流）第1天，（DF）的第4天， （GI），在培养的第8天。 （十）CyQuant核酸含量和（k）（3 - （4,5 - 二甲基-2 - 基）-2,5 - 二苯基盐（MTT）代谢活性测定的数据表明图案和平面丝膜基板上HCLE可行性时相比，随着时间的推移玻璃控制面（比例尺= 100微米）。

视频1。时间流逝相衬成像HCLE细胞在18小时通过图案的丝膜表面迁移。一段时间。在² 10k/cm密度和细胞接种培养2小时。前成像。 点击这里观看电影 。

视频2。时间流逝相衬成像HCLE细胞在18小时平坦的TCP控制表面迁移。一段时间。细胞接种在² 10k/cm密度和培养2小时。前成像。 点击这里观看电影 。

再生丝膜细胞培养基材的使用日益普及，在过去的二十年，由于这种蛋白质的物质属性的广泛特性，并增加理解它的生物材料的实用^3,8。这里所描述的文化系统代表在体外测试系统评估图案的丝膜生物材料的基板⁷细胞表面相互作用的小说。该系统可在细胞随着时间的推移，可以很容易地通过高通量数据收集的相互作用进行深入分析。这在很大程度上启用，因为丝膜具有可以修改，直接影响细胞的功能^8,9,12可调生物材料特性，其中包括：控制表面微/纳米表面形貌^7;通过共价修饰或吸附各种表面化学生物活性分子^13，强大的机甲^15,16 anical性能;控制材料的亲水/疏水^16;批量加载释放的生物化合物^4,8,17和控制溶解/酶的降解率，通过控制的二级结构（β表内容^）11,18,19 。

丝膜的透明度，通过退火薄膜为下一段时间的真空期在水汽^7,15存在。这种处理方法使β-折叠二级结构的形成，促进不溶于水的材料，同时允许最小衍射光^15。这种薄膜的透明度，使直接的活细胞成像成像方式使用任意数量的显微镜系统^12,20（即宽视场和荧光），可根据就业的关键。除了活细胞成像，丝膜可以很容易地从日移除ê文化系统，以使更多的固定和分析。因此，可以在这个系统上进行直接的实验评估的种类繁多，适用于许多的^{3,8,9,12,13,21}技术领域各种各样的细胞/组织来源。时间推移成像结果说明，文化数据实时收集和利用作为一个例子来说明如何表面地形影响细胞间的相互作用。代表结果表明，丝膜生物材料，可以用来支持HCLE文化增长，是可修正到标准的细胞增殖和代谢实验（ 图4）。此外，文化是固定的，处理扫描电子成像或其他协议（ 图3）。

丝膜基板生产中具有较高的保真度，一致性实验室，成本相对较低（ 图1）。这使reproducibility在两种文化的系统设置和实验结果。它已被证明水退火处理，产生一个稳定的丝绸文化内的薄膜材料，定义待^2,15,22解决方案中的蛋白酶浓度的降解率。因此，这些材料可用于长时间的长期细胞培养，或保持植入取决于生理位置⁸个月或年。此外，最近的工作表明，蛋白质的结构和水退火丝膜材料性能是一致的批次为允许重复性文化成果，通过各种机械和生物物理检测方法^15,16所示。此外，在材料的表面之间的电影批次伟大的保真度，扫描电镜，原子力micrscopy（AFM）和细胞培养的研究劳伦斯：2008wr，Omenetto：2008tc，布雷：2011kq}表示^7,23,24。材料STABILITY和一致性是通过各种机械传导途径细胞如何感知的文化基底，并最终产生^25,26所需的/不需要的细胞反应的一个重要因素。

培养基质，如组织培养处理的塑料或玻璃的历史标准，提供细胞附着足够的基板。然而，这些材料是不是可修正为进一步在体内的效用。可以设想，丝膜生物材料可以在体外定制，一次实验的期望已经实现定制的电影，可以直接转化为体内模型。这种配对之间在体外和体内实验设计提供了一个很大的优势超过其他基板，经常在体外用这种植入丝绸生物材料。

没有利益冲突的声明。

资金从K08EY015829国立卫生研究院，R21EY019561 R24EY015656，P41 EB002520，以R01 EY020856研究，以防止失明的职业发展奖，机构三干细胞倡议。 HCLE细胞株提供礼貌博士艾琳吉普森。笔者想感谢她的技术援助和指导博士爱红刘威尔康乃尔医学院的细胞培养，安东尼在她用扫描电镜成像，组织工程资源中心（TERC）的技术援助特别手术医院Labissiere塔夫茨大学材料的开发，技术支持和康奈尔大学纳米科学与技术设施中心（CNF的）在硅晶片制造的援助。

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