Normal ve Anormal İnsan Hematopoezin ex vivo Mimicry

1. Iskelelerinin İskele imalatı ve Bio-fonksiyonlandırmalar

1. Petri tabağı disk şeklinde poliüretan iskelesi (100-250 gözenek büyüklüğü mm, gözenekliliği% 90-95) imal etmek için, ardından bir polimer solüsyonu (Dioksan içinde 5wt%) hazırlayarak ısının neden olduğu faz ayırma işlemi kullanan ¹³ donmaya ve müteakip solvent yüceltme (Şekil 1A).
2. ECM proteinleri (Şekil 1B) ile kaplama öncesinde 0.5 x 0.5 x 0.5 mm küpler halinde iskele diski kesin.
3. Sonra 1 dk ve fosfat içine aktarmak için etanol (% 70) onları daldırarak Öncesi ıslak iskeleleri 20 dakika (PBS) tamponlu tuz. Daha sonra 3630 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edilir ve protein çözeltisi ilave edin.
4. 20 dakika boyunca 1420 x g'de protein çözeltisi içinde iskelesi santrifüjlenir.
5. Yüzey boşluklannın engeli ve iskelesi içine derin nüfuz tohumlanmış hücreleri imkan vermek üzere, 10 dakika boyunca 910 x g'de bir kez daha iskeleleri santrifüjPBS içinde.
6. Etanol içinde 2 saat (% 70) için daldırma ile 230 v, 50 Hz, 0.14 A, UV lamba, az 8 dakika maruz kalma bir arada kullanarak iskeleleri sterilize edin. Bundan sonra,% 30 fetal bovin serumu (FBS) ve% 1 penisilin ve streptomisin (P / S) ile desteklenmiş Iscove modifiye Dulbecco Orta (IMDM) eklenmeden önce PBS ile iki kez iskelesi yıkanır. ° C _ve% 5 CO2 kullanımdan önce 37 az 3 gün süreyle nemlendirilmiş bir inkübatörde iskelesi yerleştirin. Steril iskelesi bir 24 well-doku kültür plakaları (kuyu başına bir yapı iskelesi) yerleştirilir.

2. Mononükleer Hücre İzolasyon ve İskele Seeding

1. Ficoll-Paque yoğunluk gradiyenti santrifüj (1500 rpm de 35 dakika) (Şekil 1C) kullanarak, kordon kanı veya lösemi kemik iliği örneklerinden, insan MNC ayıklayın.
2. IMDM in Pastör pipetiyle MNC% 30 FBS ve 1%, P / S içeren
3. Bir mikro-pipet kullanarak iskeleler üzerine MNC süspansiyon Tohum 100μl (2 × 10 ⁶ hücre / iskelet).
4. İskeleler yerleşmeye hücreleri için 10 dakika _boyunca% 5 CO2 altında 37 ° C'de numaralı seribaşı iskeleleri inkübe edin.
5. 37 kuvöz% 30 FBS ve% 1 P / S ve yer kuyucuğu içeren IMDM 1.5 ml ile her yanı kadar kontör ° C ve deneme süresi için% 5 CO _2.
6. Numaralı seribaşı iskelelerinin tüm medya günlük değişime uğrarlar.

3 in situ Hücre Çoğalması ve Morfoloji olarak:. MTS, SEM ve Cytospins

1. MTS deneyi: kültür bir un numaralı seribaşı ve temiz yeni bir 24 iyi plaka iki numaralı seribaşı iskeleler ve yerden çıkarın. Ortamın 1 ml ve 37 MTS çözeltisi ve 3 saat süre ile inkübe edilir ve 200 ul ekleme ° C'de _ve% 5 CO2.
   1. Bir mikroplak okuyucu kullanarak 490 nm'de 96-plaka ve ölçü absorbans yer, üstteki 8 x 100 ul örnek alabilir.
2. Th farklı zaman noktalarında: elektron mikroskobu (SEM)e kültür, medya MNC ile tohumlanan iskeleleri kaldırmak ve 4 40 dakika boyunca% 2.5 PBS-tamponlanmış glutaraldehit çözüm ° C düzeltmek, daha sonra PBS ile iki kez yıkayın.
   1. Susuz 4 saat için aseptik ortamda 10 dakika ve kuru etanol için bir aşamalı dizisi (25, 50, 70, 80, 90, 95, ve% 100), her bir destek mi.
   2. Bölüm örnekleri ve daha sonra önceden SEM değerlendirilmesi için 2 dakika süre ile, bir argon atmosfer altın sputter-kaplama, bunların, 20 kV voltaj bir hızlanma kullanabilir.
3. Cytospins: kültüründe farklı zaman noktalarında iskele gelen hücreleri aspire tarafından 2.0 x 10 ⁴ hücre / slayt toplayın.
   1. 1500 rpm'de 3 dakika için bir cam slayt üzerine hücreler santrifüjleyin.
   2. Wright-Giemsa Modifiye Leke ve optik mikroskop kullanılarak gözlemlemek ile slaytlar Leke. Yumuşak Görüntüleme Sistemi fotoğraf çekmek için kullanılabilir F-görüntüleyebilirsiniz.
   3. Mikroskop gözlem öncesinde slaytlar yıkayın.
4. M ultiphoton analizi: Daha fazla analiz kadar -20 etanol buharı (% 70) gece ve daha sonra kuru ve mağaza ° C ile farklı zaman noktalarında Fix iskeleleri. Önce multiphoton mikroskop 30 mikron kalınlığında slaytlara bölümünde iskele ve PBS ile ıslak görselleştirme için.
   1. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle% 10 fetal bovin serumu ile PBS içinde tohumlu iskelesi bloke eder.
   2. Fare anti-insan CD71: ° C karanlıkta primer monoklonal antikorun a 1:50 seyreltme ile 4 azından iskelesi gece boyunca inkübe edilir.
   3. PBS ile üç kez yıkanır örnekleri ve sekonder antikor ile lekesi: karanlık oda sıcaklığında 1 saat boyunca anti-fare Alexa Fluor 488.
   4. PBS ile numuneler üç kere yıkayın ve bir su emisyon x60 objektif lens kullanarak bir konfokal mikroskop ile gözlemlemek.
   5. Fluorofor Alexa Fluor 488 pulsatil lazerler 488 nm de heyecanlı. Volocity 5.3.2 yazılımı sonraki görüntü analizi için de kullanılabilir.

1. Akış sitometresi (FC) hücresel analizinden önce tespiti için ilgili immünfloresan antikorlar ile ilgi hücreleri etiketleyin. Örnekleri arasında bir dizi tespiti için seçilen antikorlar göre hazırlanmaktadır. MNC algılaması için antikor kombinasyonları kullanılır: CD45-FITC/CD71-PE/CD235a-PE-Cy5.
2. Farklı zaman noktalarında ve santrifüj azından iskelesi gelen hücreleri aspire. 100 ul FC tamponu (PBS +% 0.1 sodyum azit) içinde ⁶ 1x10 etrafında hücreleri bir hücre peleti eritilir ve her bir antikor floresans boyasının 10 uL ekleyebilir. 4 azından 30 dakika ° C'de inkübe hücreleri, PBS ile iki kez yıka, sonuçta FC tampon içinde tekrar askıya.
3. Antikor ifade "olumsuzluk" kurmak ve akış sitometresi kontrolü ile tespit kanalları kalibre izotip kontrolü ile akış sitometresi lekeli içine örnek yükleyin.
4. Örnek lekeli w Oku Üç farklı antikorları i ve en sonunda WinList yazılımı kullanılarak veri temsil eder.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Eksojen büyüme faktörlerinin ilave edilmeden hematopoietik hücre büyümesi kinetik bir örnek, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Hematopoiesis heterojen, iki farklı hücre nedeniyle: normal ve anormal hücre hematopoetik gösterilmiştir. Şekil 2A, insan CBMNC hücre proliferasyonu kültüründe 28 gün sonra açıktır. Şekil 2B, insan primer lösemi hücre kullanılarak taklitçilik büyüme kinetikleri gösterir. Hücresel proliferasyon absorbans ilişkin hücresel metabolik aktivitesini ölçer MTS testi kullanılarak değerlendirilir. Her iki durumda da, hücrelerin çoğalması ve modeli kuruldu. Büyüme kinetiği farklılıklar gözlenir; kültür kurmak, normal hematopoetik hücreler daha hızlı lösemik hücrelerden daha.

Şekil 1. PU iskele imalatı ve bio-fonksiyonlandırmalar yer alan süreçlerin İllüstrasyon. A) poliüretan Dioksan (5wt%) içinde çözülür ve ısının neden olduğu faz ayırma işlemi ve daha sonra çözücü, süblimleştirme yolu ile iskelesi Safinia ark ¹³ tarafından tarif edildiği gibi, üretilir. B) İskele diski sonra int kesiliro küpleri 0.5 x 0.5 hücre dışı matriks (ECM) proteinleri ile santrifüj kaplı x 0,5 mm ve daha sonra. C) MNC insan umbilikal CB veya bir mikropipet ile yoğunluk gradiyenti santrifüj ve PU iskeleleri taneli (2x10 ⁶ hücre / iskelet) ile BM aspirasyon ayıklanır.

. Şekil 2 Hücresel proliferasyon MTS deneyi ile ölçülmüştür: A) insan kordon kanı ÇUŞ kullanarak; insan birincil lösemik hücreleri kullanarak) B. Eksojen sitokinlerin ilave edilmeden poliüretan iskelesi tohumlanmış olduğunda kolon zamanla hücrelerinin büyümesini göstermektedir.

Şekil 3: iskelelerinin etrafında Hücre morfolojisi ve dağılımı, scanni cytospins kullanarakng elektron mikrografikleri. (AB) kültür 28 gün sonra PU iskeleleri toplanan A) kordon kanı mononükleer hücrelerinin Temsilcisi Wright-Giemsa lekeli cytospins, ve B) kemik aspire lösemik hücrelerin kültür 14 gün sonra PU iskeleleri toplanmıştır. Her ikisi de deneylerin sitokin serbest durumda gerçekleştirilmiştir. (A'-B ')) tohumlu kordon kan ÇUŞ ve B') 28 gün süreyle kültüre edildikten sonra lösemi hücre ve hiçbir hücreleri ile birlikte C) kontrolü iskelesi A poliüretan iskelesi SEM temsil eden merkezi bölümü.

Şekil 4. Eritroid belirteç CD71 ile kültür ve lekeli 28 gün sonra kordon kanı ÇUŞ ile PU iskele numaralı seribaşı ve Multiphoton mikrografı.

Şekil 5. Flow sitometri 3D nokta araziler CD45, CD71 ve CD235a yüzey ifade belirteçleri için boyandı. Elde edilen izotip kontrolü de nispi floresans yoğunluğunu ve karşılaştırma için verilmiştir. Panel A yukarıdaki belirteçler pozitif insan kordon kanı mononükleer hücreler gösterir; B Paneli insan birincil lösemik hücreleri gösterir.

Burada sunulan ex vivo 3D kültür sistemi bize hematopoiesis 3D biyomimikri kurmaya olanak veren özetlediği BM özgün mimarisi ve eksojen sitokinler bağımsız hücre fenotipi. 3D modeli yapısı ve normal ve anormal hücre hematopoetik in vivo olarak karşılaşılan benzer koşullarda prolifere sağlayan mikro sağlar.

Polimerik iskelesi malzeme seçimi biyomimikri tasarım kritik bir adımı temsil ediyordu. Biyomalzeme Önemli avantajları gerekli mimari, yapısal özellikleri ve gerekli yüksek sınıflama sağlayarak in vivo ortamda taklit polimerler artan bir ilgi yol açmıştır. Onların yakın çevreye duyarlı canlı hücreler, doğrudan temas her zaman, çünkü polimerler biyomedikal, bunların uygulanması için gerekli minimum gereksinimleri karşılaması gerekir. Genel olarak, bir Ganlaşma iskelesi tanımlanan bir 3D yapısı hacim oranında ve tekrarlanabilir bir imalat başına yüksek bir yüzey alanı sağlamak için yeterli mekanik mukavemet ile, çok gözenekli, biyo-uyumlu olmalıdır. Yüksek porozite ve mekanik mukavemeti uyarlanan ve TIPS işlemi sırasında soğutmadan sıcaklığına bağlı olarak değiştirilebilir halde poliüretan hep birlikte bu özellikler içerir. Sonuç olarak, bu biyomimikri artan ya da gerektiği gibi porozite ve gözenek boyutuna azaltarak Diğer hücre tipleri adapte edilebilir.

Bu deneyde iskelesi ECM proteini kollajen tip I ile kaplanır; bu proteinin, bir arada diğer ECM proteinleri ile 3D modeli ¹¹ ile daha önceden test edildi. Bu da, kollajen tip I hücre yapışması hızlandırmış ve bu nedenle seçildi gösterdi. Kaplama incelenmektedir hücre türüne bağlı olarak farklı bir ECM proteinleri ile değiştirilebilir. Sentetik üzere ECM proteinleri birleştirmek için bir avantaj i iskeleleris ki bunlar sadece hücre yapışması için hücre-bağlayıcı dizisi sağlar, fakat, aynı zamanda, diğer ECM proteinleri ve böylece daha iyi bir hücre büyümesini ve olgunlaşmasını sonuçlanır hücre yapışması, arttırmak hücrelerinin bağlayıcı stabilize büyüme faktörleri ile etkileşimi ile ikincil etkileşimler sunmaktadır.

Çeşitli çalışmalar 2D ve 3D sistemlerinin her ikisini de kullanarak ex vivo hematopoiezis yapılmıştır ve hepsinin eksojen sitokinler anormal derecede yüksek konsantrasyonlarda eklenmesi. Bu çalışmalar hematopoiesis moleküler belirleyicileri aydınlatmak için yardımcı olmuştur, ancak bu sürecin ayrılmaz hücresel ve microenvironmental elemanları aynı teknikleri sınırlamaları dayalı deşifre etmek zor olmuştur.

Burada anlatılan yöntem, BM bir biyomimikri ECM kaplama ile birleştiğinde çok gözenekli polimerik iskele yapılmış sürdürülmesi ve olmaksızın normal ve anormal hematopoiesis büyümeye istikrar için en iyi yöntemdirsitokinlerin herhangi bir ek ihtiyacı. Taklit normal ve anormal hematopoez ex vivo mekanizmaları içine ilaç keşfi ve bilimsel çalışma için bir platform olarak kullanıma uygun hale sistemi çoklu-çizgisel hematopoez destekler.