종양의 4D 라이브 세포 이미징을위한 MAME 모델 : Microenvironment 상호 작용 영향을 미치는 악성 진행

1. 아이스크림 - 기판을 준비한다

1. 허용 아이스크림 - 기판은 4 ° C.에 50 μl aliquots 및 매장으로, 탈이온수에서 아이스크림-기판의 1 밀리그램 / ML의 재고 솔루션을 준비 열기 튜브 전에 실내 온도에 격차 따뜻하게 동결 건조된

그것은 ~ 50-5 분, 열이 ° C 분산을 촉진하기위한 초음파 중탕 냄비에서 아이스크림 - 기판을 선동하는 데 필요할 수 있습니다.

2. 4에 하룻밤 얼음 해동의 rBM는 ° C; rBM 항상 얼음 다루어 져야합니다.
3. 10X 인산염을 만들려면 염분이 (PBS), 80g NaCl을 용해 (1.37 M), 2g KCl (0.027 M), 14.4 g 나 ₂ HPO ₄ (1 M) 및 2.4 g KH ₂ PO ₄ (0.02 M)에서는 버퍼 800 ML의 ultrapure 물. 1.0 M HCL과 7.4로 PBS 버퍼 용액의 산도를 조정합니다. 볼륨 1리터에 지참, 여과하여 멸균.
4. 냉장 콜라겐 전 냉장 10X PBS 1 일부로 8 부품 : 얼음 콜라겐 전 솔루션을 준비합니다. 산도를 조절혼합물의 멸균 0.1 M NaOH를 사용하여 7.2-7.6 있습니다. 산도 스트립과 산도를 확인하고 멸균 물로 10 부분에 최종 볼륨을 조정합니다.
5. 각각, 25 μg / ML 및 2.4 밀리그램 / ML의 최종 농도로 prechilled 튜브에 콜라겐 전 용액에 아이스크림 - 콜라겐 봐도 diluting하여 콜라겐 나는 매트릭스 : 아이스크림 - 콜라겐 전을 준비합니다.
6. 각각, 25 μg / ML 및 12-15 밀리그램 / ML의 최종 농도로 prechilled 튜브 rBM에서 아이스크림 - 콜라겐 IV를 (Cultrex 혹은 Matrigel) diluting에 의해 재구성 지하 막 (rBM) 매트릭스 : 아이스크림 - 콜라겐 IV를 준비합니다. 거품을 만드는 피하기 위해 부드러운 pipetting을 사용하여 얼음에 섞는다.

2. MAME cocultures 준비

cocultures의 개략도 그림 1을 참조하십시오.

1. 장소 35 mm 배양 접시 또는 IbiTreat μ-요리 35-mm를 사용하여이 사각형 플라스틱 coverslips (10 분, 공기 건조를 위해 70 % 알코올로 소독). 여기 오시는 길 우리가 스튜에 사용하는 coverslips 및 μ-요리 모두를위한직립 현미경에 죽는다. 거꾸로 현미경에 대한 연구를 위해, 우리는 μ-접시를 사용합니다.
2. 콜라겐 나는 매트릭스 : 아이스크림 - 콜라겐 I과 섬유아 세포의 원하는 번호를 섞는다. 콜라겐 나는 매트릭스 : 그림 2와 3에서 그림 장기 cocultures 위해서는 미디어의 10 μl 플러스 아이스크림 - 콜라겐 전 60 μl 500 섬유아 세포를 사용합니다.
3. 조심스럽게 피펫은 100 μl micropipettor를 사용하고 fibroblast의 70 μl 확산 : 아이스크림 - 콜라겐 I : 콜라겐 I 행렬 각 coverslip의 전체 표면 이상 고체화하기 위해 30 분 동안 CO _2없이 humidified 배양기에서 37 ° C에서 떠나야합니다.
4. 양도 35-mm 평형하는 10 분 5 % CO _2와 37 ° C 배양기에 coverslips를 포함하는 요리.
5. 인큐베이터에서 제거하고 그들이 실내 온도에 올 때까지 후드를 35-mm 요리를 둡니다.
6. 경화 아이스크림 - 콜라겐 제가 위에 rBM 매트릭스 : 임베디드 섬유아 세포와 콜라겐 I 행렬 아이스크림 - 콜라겐 IV의 60 μl를 추가합니다. 피펫 팁, CA와아이스크림 - 콜라겐 나 : 저는 콜라겐 매트릭스 fibroblast를 긁적 피하 골고루 rBM 매트릭스 : refully 아이스크림 - 콜라겐 IV 뿌리 더군요.
7. 양도 35-mm 고체화하는 10 분 5 % CO _2와 37 ° C 배양기에 coverslips를 포함하는 요리. 아이스크림 - 콜라겐 IV 동안 rBM 행렬이 응고되어 trypsinize과 상피 세포를 계산합니다.
8. rBM 매트릭스 : coverslips 향해 상피 / 종양 세포 현탁액의 장소 50 μl는 아이스크림 - 콜라겐 IV와 코팅. 37 ° C 배양기에 coverslips를 포함하는 장소 35-mm 요리. rBM 매트릭스 : 전지 40-60 분 아이스크림 - 콜라겐 IV에 연결하도록 허용합니다. 그림 2와 3에서 그림 장기 cocultures 위해 2500 상피 또는 종양 세포를 사용합니다.
9. 각각 35 mm 접시에 2 % rBM를 포함하는 배지 2 ML을 추가합니다. 어떠한 약물 치료를하는 경우, 약물이 시간에 추가되어야합니다.
10. 이미징 전에 시간 원하는 기간 동안 품어. 장기 배양의 경우, 미디어마다 3~4일 변경해야합니다. 세포 유지하실 수 있습니다그들의 정상적인 문화 매체 인치 유방암 세포 라인 MAME cocultures 위해 MEGM의 SingleQuots로 보충 상피 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간에 (MEBM-PRF)을 사용합니다.

3. 공촛점 현미경으로 살아있는 MAME cocultures의 4D (3D + 시간) 이미징을 수행

1. 그림 증명 주요 연구 내용은 MAME cocultures 우리의 출판 절차 ^1에 따라 형광 셀 추적 염료로 분류했다. 이미징 전에 5% CO ₂ 배양기와 37 ° C에서 PBS로 세척 후 cocultures는 37 ° C 배양기에서 45 분 동안 MEGM 매체에 5 μm의 제품 CellTracker의 오렌지와 incubated했다 PBS로 다시 씻어 30 분 prewarmed MEGMmedium 함께 incubated .
2. 이미지 MAME cocultures은 자이스 혈구 LSM-510 메타 공촛점 현미경의 낮은 배율 (10X, 물 마른 렌즈)에 살고 있습니다.
3. 광학 부분은 구조의 전체 깊이에 걸쳐 간격으로 캡처됩니다. 우리의 연구에 대해서는 10 광학 부분을 캡처μm의 간격.
4. 3D의 이미지를 재구성하기 위해 광학 섹션을 사용합니다. 우리는 3 차원 reconstructions를 생성합니다 Volocity 소프트웨어를 사용합니다.
5. 세포 상호 작용과 그 주변 매트릭스와 상호 작용을 시각이 될 수있다 : 구조, 세포 있도록 3D reconstructions의 동영상을 확인하십시오. 우리는 QuikTime 플레이어 7에서 영화를했다.

4. 대표 결과

우리가 개발한 MAME cocultures은 유방 종양과 그 microenvironment을 구성하는 다양한 세포 성분 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징을위한 취급하기 쉬운 실험 모델입니다. 여기에 휴대폰 요점을 되풀이하는 MAME 모델의 기능을 설명 : 유방암의 진행 중에, 라이브 세포 이미징의 세포 상호 작용은 시간이 지남에 따라 이러한 상호 작용을 수행합니다. 우리는 이상, preinvasive MCF10.DCIS 인간 유방암 세포주와 인간의 유방 암 관련 fibroblast 라인, WS-12Ti 사이의 이미지 상호 작용에 대한 능력을 보여주는문화의 3 주 이상의 기간. cocultures 3, 16, 23 일 정도 몇 군데 있었다. cocultures의 전체 볼륨을 통해 광학 부분은 그림 2에서 세 timepoints 각각에 대해 표시됩니다 3D 및 대표 예제 년에 복원되었다. 그림 2의 붉은 형광은 MCF10.DCIS 및 WS-12Ti 세포를 나타냅니다. 두 세포 유형 간의 장기 cocultures에 대한 차별하기 위해, 하나는 문화를 확립하기 전에 형광 단백질에 각각의 셀 유형을 transfect 또는 transduce 수 있습니다. differentially 식별을위한 형광 단백질로 분류되어 MCF10.DCIS 및 WS-12Ti 세포의 MAME의 coculture는 그림 3과 그림한다.

통합 기판으로,이 경우 아이스크림 - 콜라겐에 MAME cocultures로, 우리는 침략 표현형으로의 전환과 관련된 proteolysis의 시간이지나면서 변화를 평가하고 계량하실 수 있습니다. 우리는 형광 절단 제품을 quantifying위한 메소드를 설립했습니다 그 결과아이스크림 - 콜라겐 저하 ^2,3에서. 우리는 레이블링 및 세포 핵을 세어 당 셀 단위로 MAME cocultures의 전체 3D 볼륨에 걸쳐 저하 제품을 정상화. 더욱이, 우리는 세포와 세포 내 구획에 저하를 집중하고 우리가 ^이전에이 설명한 것처럼 총 세포내 및 세포외 저하 제품을 계량하실 수 있습니다. 그림 2와 3의 녹색 형광은 두 개의 아이스크림 - 콜라겐 기판 절단 제품을 나타냅니다. 이때 differentially-라벨이 콜라겐은 우리가 유형 나 콜라겐 유형 IV는 콜라겐과 열화의 저하를 구분할 수 있겠 사용할 수 없습니다.

MAME cocultures의 상호 작용은 동적이고 시간이 지남에 따라 변경할 수 있습니다. 현세와 동적 정보를 얻으려면,보기 같은 분야는 주 분부터 일정 기간 동안 반복해서 볼륨의 전체 표본을 통해 찍은 몇 군데와 광학 섹션 수따라서 4-D에 데이터를 수집. 그림 2에서는 23 일 동안에 발생할 오히려 극적인 변화를 보여주는 : 휴대폰 번호의 변화, 세포 마이 그 레이션 및 세포 상호 작용, 구조 볼륨, 구조 모양, 구형의 구조의 편차, 침략 outgrowths과 proteolysis합니다. 또한, 우리는 또한 인한 MAME cocultures로 볼륨의 전반적인 변화를 보여주는 굴욕적인 그들의이 기간 동안 세포외 기질을 둘러싼. 그림 2A에서 그림과 같이 삼일에서 볼륨 110000 μm의 ^3. 반면, 16 23일에서 MAME cocultures의 볼륨은 그림 2B와 C로 그림에만 46250 μm의 ^3입니다

1 그림. MAME cocultures.의 개략도는 플라스틱 coverslip는 아이스크림 - 콜라겐 I 및 섬유아 세포 (마젠타)를 포함하는, 콜라겐 나는 코팅됩니다. 아이스크림 - 열을 포함하는 재구성 지하 막의 두번째 레이어 (rBM)lagen IV가 추가됩니다. 종양 세포 (적색)은 위에 도금과 문화 미디어의 2 % rBM는 오버레이 (흰색 도트) 미디어의 모든 변화가있는가 있습니다. 녹색은 아이스크림 - 콜라겐 I와 IV의 형광 절단 제품을 나타냅니다.

그림 2. MCF10.DCIS 인간 유방암 세포와 WS-12Ti 인간 유방 섬유아 세포의 MAME cocultures. 섬유아 세포는 콜라겐 아이스크림 - 콜라겐 IV를 포함 rBM와 I / 아이스크림 - 콜라겐 I 및 오버레이에 박혀 있었다. DCIS 세포 그런 다음 2 % rBM을 포함 매체와 rBM 및 오버레이에 놓는되었다. cocultures의 볼륨의 감소에 표시된대로 여기에 그림 coculture에서 23 일 동안 세포 증식, 아이스크림 - 콜라겐 IV와 (녹색)과 콜라겐 매트릭스의 저하가 발생했습니다. 세포 이미징 (적색)하기 전에 원래의 장소에 CellTracker의 오렌지와 레이블링에 의해 현지되었다. 같은 라이브 cocultures는 C로 촬영한 이미지를 23 일 동안 관찰되었다coculture 3, 16, 23 일 정도 onfocal 현미경. 그 결과 광학 조각은 Volocity 소프트웨어로 3D 년에 복원되었다. 배율, 10X.

그림 3. MAME 16일의 MCF10.DCIS 인간 유방암 세포와 WS-12Ti 인간 유방 섬유아 세포의 cocultures 그 각각 명시 RFP (적색)와 YFP (흰색). Cocultures 설립과 그림 2에서와 같이 분석했다. 여기에 표시된 두 세포 유형은 그러나 differentially 그들은 서로 구분할 수 있도록 분류 하였다. 이 그림에서 높은 배율 이미지, 그림 2에서 이들에 비해, DCIS 세포 및 섬유아 세포 근처 분야에서 아이스크림 - 콜라겐 내의 확산 proteolysis의 표면에서 아이스크림 - 콜라겐 IV의 proteolysis를 보여줍니다. 배율, 20X.

보여준 바와 같이, MAME cocultures은 유방 종양과 그 microenvironment을 구성하는 다양한 세포 성분 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징에 사용될 수 있습니다. 저희 연구실에서는 지속적인 연구에서 우리는 proteolytic DCIS의 침략 ductal 암종으로의 전환과 연관된 경로뿐만 아니라 같은 케모카인 / 시토킨 / 성장 인자의 통로로서 이런 변화에 참여 proteolytic 경로와 다른 경로 간의 상호 작용을 확인하기 위해 MAME cocultures을 사용한 . 우리는 더 MAME 모델, 작은 분자 억제제의 효과를 심사한 proteolytic / 케모카인 / 시토킨 / 성장 인자 경로에게 ^3-5 변조 항체 또는 shRNAs을 차단하기위한 도구로 사용될 수 있다고했다. 여기에 그림 2와 3의 그림과 같이 우리가 이전에 주, ^{6,7 보여준대로} MAME 모델, 분, 시간에 이르기까지 배 이상의 종양 성장, 침략과 proteolysis의 라이브 세포 이미징에 사용될 수 있습니다.관찰되는 상호 작용 한 종, intravital 영상 ^8과 같은 즉, 인간의 종양 세포와 종양 - 관련 세포가 아닌 인간의 종양 세포와 마우스 stromal 세포 사이의 세포 사이입니다. MAME 모델은 다루기 쉬운 시스템입니다. 관심 분자 아이스크림 - 콜라겐의 저하로 그 세포 유형들의 기여가 몇 군데와 3D ² 계량 수 있도록 사전 coculturing 개별 셀 타입의 shRNAs과 downregulated 될 수 있습니다. MAME 모델의 에어컨 미디어 얻은 정보 등을 항체를 차단하고, 작은 분자 억제제의 효과를 테스트하기위한 실험적인 근거를 제공하는 프로 테아제의 분비의 변화, 크린 시토킨 등을 측정하는 샘플 수

한 종양 microenvironment (예 : myoepithelial 세포, monocytes, 혈액의 내피 세포에서 발견 다른 세포 유형의 기여를 평가하기 위해이를 사용할 수 있도록 MAME cocultures의 세포 성분이 쉽게 조작할 수 있습니다악성 진행 ^6,7에 혈관과 림프의 기원). 다양한 세포 유형의 씨앗을 품고, 또 다른 하나의 세포 유형의 비율과 문화 시간의 길이의 숫자가 사용되는 특정 세포 유형 및 실험 질문에 따라 달라집니다. MAME 모델은 또한 유방 종양을 둘러싸고있는 microenvironment의 변화, 예를 들어, 산도, 산소 장력의 효과를 평가하기 위해 확장할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 MAME 문화가 약​​산성 산도, 즉 pH를 6.8로 유지하는 경우, proteolysis 및 invasiveness의 증가가있다는 것을 보여주었다. 또한, 우리는 우리가 전립선암과 같은 다른 암 모델링을 유사한 cocultures를 사용하는 것으로 나타났습니다.