Mame Modeller för 4D Live-cell imaging av tumör: mikromiljö Interaktioner som påverkar malign progression

1. Förbered DQ-substrat

1. Tillåta lyofiliserades DQ-substrat värmas till rumstemperatur innan den öppnas ampuller, framställa förrådslösning av 1 mg / ml av DQ-substrat i avjoniserat vatten, dela upp i 50 | il alikvoter och förvaras vid 4 ° C.

Det kan vara nödvändigt att omröra DQ-substratet i en ultraljud-vattenbad under ~ 5 minuter och värm till 50 ° C för att underlätta dispergering.

2. Tö RBM på is över natten vid 4 ° C; RBM skall hanteras på is vid alla tidpunkter.
3. För att göra 10X fosfatbuffrad saltlösning (PBS), löses 80 g NaCl (1,37 M), 2 g KCl (0,027 M), 14,4 g Na-HPO _{2 4} (1 M) och 2,4 g KH PO _{2 4} (0,02 M) i 800 ml ultrarent vatten. Justera pH av PBS-buffert-lösning till 7,4 med 1,0 M HCl. Bringa volymen till 1 liter, sterilisera genom filtrering.
4. Framställa kollagen I-lösning på is: 8 delar kyld kollagen I och 1 del av kyld 10 X PBS. Justera pHav blandningen till 7,2-7,6 med användning av steril 0,1 M NaOH. Kontrollera pH med pH-remsor och justera den slutliga volymen till 10 delar med sterilt vatten.
5. Framställ DQ-kollagen I: kollagen I matrisen genom att späda DQ-kollagen I i kollagen I-lösning i en förkyld röret till en slutlig koncentration av 25 pg / ml och 2,4 mg / ml.
6. Framställ DQ-kollagen IV: rekonstituerade basalmembran (RBM) matris genom att späda DQ-kollagen IV i RBM (Cultrex eller Matrigel) i en förkyld röret till en slutlig koncentration av 25 pg / ml och 12-15 mg / ml. Blanda på is med försiktig pipettering att undvika att skapa bubblor.

2. Framställ MAME samodlingar

Se figur 1 för ett schematiskt diagram av samodlingar.

1. Placera två rektangulära plast täckglasen (steriliseras i 70% alkohol i 10 minuter och luft-torkade) i en 35-mm odlingsskål eller använda en IbiTreat 35-mm μ-Dish. Vägbeskrivning här är för båda täckglas och fi-rätter som vi använder för studör på en upprätt mikroskop. För studier på ett inverterat mikroskop, använder vi bara fi-rätter.
2. Blanda det önskade antalet fibroblaster med DQ-kollagen I: kollagen I matrisen. För de långsiktiga samodlingarna illustreras i figurerna 2 och 3, använder vi 500 fibroblaster i 10 pl media plus 60 pl DQ-kollagen I: kollagen I matris.
3. Användning av en 100-il mikropipett, och noggrant pipett sprida 70 pl av fibroblast: DQ-kollagen I: kollagen I matrisen över hela ytan av varje täckglas och lämnar vid 37 ° C i en fuktad inkubator utan _CO2 under 30 minuter för att stelna.
4. Överföring 35-mm skålar innehållande täckglasen till 37 ° C inkubator med _5% CO2 under 10 minuter till jämvikt.
5. Bort från inkubatorn och lämnar de 35-mm skålar under huven till dess de kommer till rumstemperatur.
6. Tillsätt 60 pl av DQ-kollagen IV: RBM matris ovanpå det solidifierade DQ-kollagen I: kollagen I matrisen med inbäddade fibroblaster. Med pipettspetsen, carefully sprids DQ-kollagen IV: RBM matrix jämnt undvika att repa fibroblast: DQ-kollagen I: kollagen I matris.
7. Överföring 35-mm skålar innehållande täckglasen till 37 ° C inkubator med _5% CO2 under 10 minuter för att stelna. Medan DQ-kollagen IV: RBM matris stelnar, Trypsinisera och räkna epitelceller.
8. Ställe 50 pl av en epitelial / tumörcell suspensionen på täckglas belagda med DQ-kollagen IV: RBM matris. Ställe 35-mm skålar innehållande täckglasen i en 37 ° C inkubator. Tillåta 40 till 60 min för de celler att fästa till DQ-kollagen IV: RBM matris. För de långsiktiga samodlingarna illustreras i figurerna 2 och 3, använder vi 2500 epitelceller eller tumörceller.
9. Tillsätt 2 ml odlingsmedium innehållande 2% RBM till varje 35 mm platta. Om du gör några läkemedelsbehandlingar, bör preparaten läggas vid denna tidpunkt.
10. Inkubera för önskad tid före avbildning. För långsiktiga kulturer bör media bytas var 3-4 dagar. Cellerna kan upprätthållasI sin normala odlingsmediet. För MAME samodlingar rader bröst cell, använder vi Epithelial Basal Medium (MEBM-PRF), kompletterat med MEGM SingleQuots.

3. Utför 4D (3D + tid) avbildning av levande MAME samodlingar med konfokalmikroskopi

1. För de illustrerade proof-of-principle studierna var MAME samodlingarna märkta med ett fluorescerande celler spårning färgämne enligt vår publicerad procedur ^1. Efter tvättning med PBS samodlingar inkuberades med 5 nM CellTracker Orange i MEGM mediet under 45 min i en 37 ° C inkubator, tvättades igen med PBS och inkuberades med förvärmd MEGMmedium under 30 min i 37 ° C med 5% _CO2 inkubator innan avbildning .
2. Bild MAME samodlingar bor på en låg förstoring (10X, vatten att doppa objektiv) på en Zeiss LSM-510 META konfokalt mikroskop.
3. Optiska sektioner tagna vid intervall genom hela djupet av strukturerna. För våra studier fångar vi optiska sektioner vid 10xm mellanrum.
4. Använd optiska sektioner för att rekonstruera bilder i 3D. Vi använder Volocity programvara för att generera 3D-rekonstruktioner.
5. Gör filmer av 3D rekonstruktioner så att strukturer, mobil: interaktioner cell och samspel med de omgivande matriserna kan visualiseras. Vi gjorde filmer med QuikTime Player 7.

4. Representativa resultat

Den MAME samodlingar som vi utvecklat är en lätthanterlig experimentell modell för live-cell imaging i realtid av interaktioner mellan de olika cellulära komponenter som utgör en brösttumör och dess mikromiljö. Här visar vi förmåga Mame modeller för att sammanfatta cell: cell interaktioner under bröstcancer progression och live-cell imaging att följa dessa interaktioner över tiden. Vi illustrerar förmågan att bilden interaktioner mellan en preinvasive MCF10.DCIS human bröst-cellinje och en human bröstcancer-associerad fibroblast line, WS-12Ti, överen period av mer än tre veckor i kultur. Samodlingarna avbildas vid 3, 16 och 23 dagar. Optiska snitt genom hela volymen av samodlingarna rekonstruerades i 3D och representativt exempel visas för var och en av de tre tidpunkterna i figur 2. Den röda fluorescensen i figur 2 representerar MCF10.DCIS och WS-12Ti-celler. Att skilja mellan de två celltyper och på lång sikt samodlingarna kan man transfektera eller transducera enskilda celltyper med fluorescerande proteiner före upprättandet av kulturer. En MAME samodling av MCF10.DCIS och WS-12Ti-celler som är differentiellt märkta med fluorescerande proteiner för identifiering illustreras i figur 3.

Genom innehåller substrat, i detta fall DQ-kollagener, i MAME samodlingarna kan vi bedöma och kvantifiera förändringar över tiden i proteolys i samband med övergången till en invasiv fenotyp. Vi har etablerat metoder för att kvantifiera de fluorescerande sönderdelningsprodukterna som resulterarfrån DQ-kollagennedbrytning ^2,3. Vi normalisera nedbrytningsprodukter i hela 3D-volym MAME samodlingarna på en per cell basis av märkning och räkning cellkärnor. Dessutom kan vi lokalisera nedbrytning till extracellulära och intracellulära fack och kvantifiera de totala och intracellulära och extracellulära nedbrytningsprodukter som vi har beskrivits tidigare ^2. Den gröna fluorescensen i figurerna 2 och 3 representerar klyvningsprodukter av de två DQ-underlag av kollagen. Vid denna tidpunkt differentiellt märkta kollagener inte är tillgängliga som skulle tillåta oss att särskilja mellan nedbrytning av kollagen av typ IV och nedbrytningen av typ I kollagen.

Samspelet i MAME samodlingarna är dynamiska och kan förändras över tiden. För att erhålla temporal och dynamisk information kan samma synfält skall avbildas och optiska sektioner tagna genom hela provet av volymen upprepade gånger under en tidsperiod från minuter till veckor,därmed insamling av data i 4-D. I figur 2, visar vi ganska dramatiska förändringar som uppkommer över 23 dagar: förändringar i antalet celler, cell migration och interaktioner cell, volymer struktur, former struktur, avvikelser i de strukturer från sfärisk, invasiva utväxter och proteolys. Dessutom visar vi även en övergripande förändring i volym på grund av MAME samodlingarna försämras omgivande extracellulära matrix under denna tidsperiod. Vid tre dagar såsom visas i fig 2A, är volymen 110 tusen xm ^3. I motsats härtill är den volym av MAME samodlingarna vid 16 och 23 dagar endast 46.250 xm ^3, såsom illustreras i figurerna 2B och C.

Figur 1. Skiss av MAME samodlingar. Plast täckglaset är belagd med kollagen I, som innehåller DQ-kollagen I och fibroblaster (magenta). En 2:e lager av rekonstituerade basalmembran (RBM) som innehåller DQ-collagen IV tillsätts. Tumörceller (röd) stryks ovanpå och 2% RBM i kultur media är överlappande (vita prickar) med varje byte av media. Grön representerar de fluorescerande klyvningsprodukter av DQ-kollagen I och IV.

Figur 2. MAME samodlingar av MCF10.DCIS mänskliga bröst celler och WS-12Ti mänskliga fibroblaster bröst. De fibroblaster bäddades in i kollagen I / DQ-kollagen I och täcktes med RBM innehåller DQ-kollagen IV. DCIS celler såddes sedan på RBM och överskiktades med medium innehållande 2% RBM. Under de 23 dagarna i samodling visas här, det var cellproliferation, nedbrytning av DQ-kollagen IV och I (grön) och kollagenmatriser som indikeras av minskningen i volym av samodlingarna. Celler lokaliserades genom märkning med CellTracker Orange på plats innan imaging (röd). Samma levande samodhngar observerades under 23 dagar med bilder tagna av confocal mikroskopi vid 3, 16 och 23 dagar av samodling. De resulterande optiska skivorna rekonstruerades i 3D med Volocity programvara. Förstoring, 10X.

Figur 3. Mame 16 dygn samkulturer av MCF10.DCIS humana bröstceller och WS-12Ti humana fibroblaster bröst som uttrycker RFP (röd) och YFP (vit), respektive. Samodlingar etablerades och analyserades som i figur 2. De två celltyper som visas här hade dock fått differentiellt märkta så att de kunde skiljas från varandra. De högre förstoring bilder i denna figur, i jämförelse med de i Figur 2, visar proteolys av DQ-kollagen IV vid ytan av de DCIS celler och diffus proteolys av DQ-kollagen I, i områden i närheten av fibroblasterna. Förstoring, 20X.

Som framgår kan MAME samodlingarna användas för live-cell imaging i realtid av interaktioner mellan de olika cellulära komponenter som utgör en brösttumör och dess mikromiljö. I pågående studier i vårt laboratorium har vi använt MAME samodlingarna att identifiera proteolytiska vägar i samband med övergång från DCIS till invasiv duktal cancer, som liksom samspelet mellan proteolytiska vägar och andra vägar är inblandade i denna övergång som kemokiner / cytokin / tillväxtfaktor vägar . Vi visade vidare att Mame modeller skulle kunna användas som ett verktyg för screening av effekterna av små molekylinhibitorer, blockerande antikroppar eller shRNAs som modulerar proteolytisk / kemokin / cytokin / tillväxtfaktor vägar ^3-5. De Mame modeller kan användas för live-cell imaging av tumörtillväxt, invasion och proteolys över tid från minuter och timmar, som vi har tidigare visat ^6,7 till veckor som visas här i figurerna 2 och 3. Deninteraktioner som observerats är mellan celler av en art, dvs humana tumörceller och tumör-associerade celler, snarare än mellan humana tumörceller och mus stromaceller såsom i intravital avbildning ^8. De Mame modellerna är en foglig systemet. Molekyler av intresse kan vara nedregleras med shRNAs i individuella celltyper innan samodling, så att deras bidrag i den celltyp till nedbrytning av DQ-kollagen kan avbildas och kvantifieras i 3D ^2. Konditionerat medium från Mame modeller kan samplas för att mäta förändringar i sekretion av proteaser, cytokiner etc. Den information som erhålls ger en experimentell bas för att testa effekterna av små molekylinhibitorer, blockerande antikroppar etc.

Det cellulära sammansättning MAME samodlingar kan lätt manipuleras så att man kan använda dem för att bedöma bidraget från andra celltyper som finns i tumören mikromiljö (t.ex. myoepiteliala celler, monocyter, endotelceller av blodfartyg och lymfatiska ursprung) till malign progression ^6,7. Antalet av de olika celltyperna ympad, förhållandet av en celltyp till en annan och den tid i odling kommer att bero på de specifika celltyper och den experimentella fråga. Mame modeller kan också utökas för att bedöma effekterna av förändringar i mikromiljö kring brösttumörer, t.ex. pH, syre spänning. Till exempel har vi visat att när Mame Kulturerna upprätthölls vid en något surt pH, dvs pH 6,8, sker en ökning i proteolys och invasivitet. Dessutom har vi visat att vi kan använda liknande samodlingarna att modellera andra cancerformer som prostatacancer.