MAME的模型四维活细胞成像肿瘤微环境的相互作用，影响的恶性进展

1。准备DQ-基板

1. 允许冻干DQ-基板预热至室温，然后再打开小瓶，准备去离子水1毫克/毫升DQ的基板库存的解决方案，在4°C到50μL分装和存储鸿沟

这可能是必要的，鼓动〜5分钟，热到50°C，以促进分散的超声波水浴DQ-基板 。

2. 在冰上解冻一夜之间在4的RBM℃; RBM，应处理在所有时间上冰。
3. 使10X磷酸盐缓冲液（PBS），溶解80克氯化钠（1.37男），2Ğ氯化钾（0.027男），14.4Ğ的Na ₂ HPO _4（1米），2.4克KH ₂ PO _4（0.02 mol） 800毫升的超纯水。 PBS缓冲液的pH值调整至7.4与1.0 M盐酸。带来体积为1升，过滤，消毒。
4. 准备胶原冰我的解决方案：冰鲜的胶原蛋白，我冰鲜10X PBS 1 8个部分。调整pH值混合7.2-7.6使用无菌0.1 M氢氧化钠。检查pH值pH值条，并用无菌水调整最终体积的10个部分。
5. DQ的I型胶原I型胶原溶液稀释至终浓度为25微克/毫升和2.4毫克/毫升，分别在prechilled管准备DQ的I型胶原：胶原蛋白，我矩阵。
6. 准备DQ - Ⅳ型胶原：稀释DQ胶原四在RBM（Cultrex或基底膜）在prechilled管，到终浓度为25微克/毫升和12-15毫克/毫升，分别由重组基底膜（RBM）矩阵。上混合使用轻柔的移液，以避免创建气泡的冰。

2。准备MAME的共同培养

参见图1为一个共同培养的示意图。

1. 将两个长方形塑料盖玻片（70％的酒精消毒10分钟和风干）培养皿在35毫米或35毫米μ盘使用IbiTreat。方向在这里盖玻片和μ-菜肴，这是我们使用STU直立显微镜死亡。倒置显微镜的研究，我们只用μ-菜肴。
2. 混合我与DQ胶原纤维母细胞所需的数字：I型胶原基质。我们在图2和图3所示的长期共同培养，使用500的成纤维细胞在10μL媒体DQ - I型胶原加60μL：I型胶原基质。
3. 使用100微升移液器，仔细移液器和传播70μL的成纤维细胞：DQ的I型胶原：胶原蛋白在每个盖玻片的整个表面，并留在37°C不饱和湿度培养箱中CO ₂为30分钟，以巩固我矩阵。
4. 转让35毫米盖玻片以37°Ç孵化含5％CO ₂为10分钟，以平衡的菜肴。
5. 从孵化器和离开，直到他们来到室温罩下的35毫米的菜肴。
6. 加入60μl的DQ - Ⅳ型胶原：凝固的DQ的I型胶原上RBM矩阵：嵌入式成纤维细​​胞I型胶原基质。用枪头，CArefully传播DQ的IV型胶原：RBM矩阵均匀，避免刮伤的成纤维细胞：DQ的I型胶原：I型胶原基质。
7. 转让35毫米含5％CO ₂为10分钟，以巩固盖玻片以37°Ç孵化器的菜肴。而在DQ-IV型胶原：RBM矩阵固化，trypsinize计数上皮细胞。
8. 50微升到盖玻片的上皮细胞/肿瘤细胞悬液涂有DQ的IV型胶原：RBM矩阵。地方35毫米的菜肴，含到37℃孵化器的盖玻片。允许附加到DQ的IV型胶原：RBM基质细胞的40％至60分钟。我们在图2和图3所示的长期共同培养，使用2500上皮细胞或肿瘤细胞。
9. 加入2毫升含有2％RBM文化中期每35毫米的菜。如果做任何药物治疗，药物应在这个时候加入。
10. 孵育前成像所需的时间。对于长期的文化，媒体应改为每3-4天。可维持细胞在正常培养基。 MAME的乳腺癌细胞株共同培养，我们用上皮细胞基底中等（MEBM-PRF）辅以MEGM SingleQuots的，。

3。执行现场MAME的共同培养​​4D（三维+时间）成像，共聚焦显微镜

1. 为原则的证明，说明研究，MAME的共同培养，用荧光的细胞追踪染料标记，根据我们公布的程序^1。用PBS洗涤后，共培养培养与5微米MEGM中等CellTracker的橙在37℃孵化45分钟，用PBS洗再次孵育30分钟的预热MEGMmedium 5％CO ₂培养箱在37℃前成像。
2. 图片MAME的共同培养​​生活在低倍率蔡司LSM 510 META激光共聚焦显微镜（10X，水浸泡镜片）。
3. 在整个结构的整个深度间隔的光学部分被捕获。对于我们的研究中，我们捕捉10光学切片微米的间隔。
4. 使用光学切片重建三维图像。我们使用Volocity软件生成三维重建。
5. 三维重建的电影，这样可以可视化的结构，细胞：细胞间的相互作用，并与周围的矩阵互动。我们与QuikTime Player 7的电影。

4。代表结果

我们开发的MAME的共同培养​​是一个听话的活细胞在乳腺肿瘤和其微环境，包括各种细胞成分之间的相互作用的实时成像的实验模型。在这里，我们展示的MAME的模型概括细胞的能力，按照时间的推移这些相互作​​用在乳腺癌的进展和活细胞成像的细胞间的相互作用。我们说明到图像1 MCF10.DCIS人类乳腺原位癌细胞株和人乳腺癌癌症相关的成纤维细胞线，WS-12TI之间的相互作用的能力，超过文化周期间超过三。 3，第16和23天，共培养了成像。图2中的三个时间点显示，光学部分通过的共同培养​​的整个体积重建在3D和有代表性的例子。图2中的红色荧光代表MCF10.DCIS和WS-12TI细胞。要区分两种类型的细胞和长期的共同培养​​，可以用荧光蛋白转染或转导单个细胞类型之前建立文化。 MAME的一个MCF10.DCIS和WS-12TI差异识别的荧光蛋白标记的细胞共培养如图3所示。

DQ-胶原在这种情况下，通过整合基板，到MAME的共同培养​​，我们可以评估和量化了侵入型过渡到在水解时间的变化。我们已经建立了量化荧光裂解产品的方法，结果从DQ胶原降解^2,3。我们正常化降解产物的每一个细胞的基础上，整个3D体积MAME的共同培养​​细胞核标记和计数。此外，我们还可以本地化的降解细胞外和细胞内的车厢和量化总，细胞内和细胞外降解产品正如我们前面所述^2。在图2和3的绿色荧光代表裂解两个DQ胶原的基板产品。在这个时候，差异标记的胶原蛋白是无法使用，将使我们能够区分降解IV型胶原和I型胶原的降解。

在MAME的共同培养​​的相互作用是动态的，可以随时间而改变。为了获得时间和动态信息，相同的视野可以通过整个标本体积超过一段时间从几分钟到几周反复成像和光学部分，因此，在2,4-D收集数据。在图2中，我们说明，而超过23天发生的戏剧性的变化：细胞数量的变化，细胞迁移和细胞间的相互作用，结构，体积，结构，形状，结构偏离球形，侵入副产物和蛋白质。此外，我们也表现出货量的整体变化，由于MAME的共同培养​​有辱其周围的细胞外基质，超过这个时间段。在3天图2A所示，体积11万³微米。相比之下，MAME的共同培养，在16日和23日成交量为46,250微米^3，图2B和C所示

图1。 MAME的共同培养。示意图塑料盖玻片涂有I型胶原，含有DQ的I型胶原和成纤维细胞（洋红色）。第二层的重组基底膜（RBM）DQ-COL拉根四是增加了。肿瘤细胞（红色）被镀上顶部和2％的培养基中RBM是覆盖与每一个媒体的变化（白点）。绿色代表DQ胶原I和IV荧光裂解产物。

图2。 MAME的MCF10.DCIS人乳腺癌细胞和WS-12TI人类乳腺成纤维细胞共培养 。被嵌入的成纤维细胞胶原蛋白的I / DQ-胶原含有DQ - Ⅳ型胶原RBM我和覆盖。原位癌细胞，然后接种于含有2％RBM媒体RBM和覆盖​​。这里说明多年来共培养23天，细胞增殖，DQ - Ⅳ型胶原和我（绿色）和胶原基质的降解量减少的共同培养​​。细胞定位与原位 CellTracker橙色标签前成像（红色）。同一现场共培养超过23天的观察，拍摄的图像由C3，16和23天的共培养onfocal显微镜。 Volocity软件所产生的光学切片的三维重建。放大倍率，10X。

图3。 MAME的16一天MCF10.DCIS人乳腺癌细胞和WS-12TI人类乳腺成纤维细胞共同培养，快递RFP（红色）和YFP（白），分别 。共培养，建立和分析，如图2。这里显示两种细胞类型，然而，被差异标记，使他们可以从彼此区分。这个数字在高倍率的图像相比，图2，说明DQ的IV型胶原蛋白水解原位癌细胞弥漫性蛋白质和DQ胶原我在附近的成纤维细胞等领域的表面。放大，20X。

作为证明，MAME的共同培养​​，可用于活细胞成像在乳腺肿瘤和其微环境，包括各种细胞成分之间的相互作用的实时。在我们的实验室正在进行的研究中，我们已经使用MAME的共同培养​​，以确定过渡，从原位癌到浸润性导管癌的蛋白水解途径，以及相关的蛋白水解途径和其他途径参与这种过渡，如趋化因子/细胞因子/生长因子途径之间的相互作用。我们进一步表明MAME的模型可以用来作为筛选小分子抑制剂的作用，阻断抗体的shRNA调节蛋白/趋化因子/细胞因子/生长因子的途径^3-5的工具。 MAME的模型可以用于活细胞成像的肿瘤生长，侵袭和蛋白质多分钟和小时不等的时间，因为我们先前的研究显示^6,7，周在图2和3所示。 “被观察的相互作用是一个物种，即，人类肿瘤细胞和肿瘤相关的细胞，而不是在活体成像⁸之间的人类肿瘤细胞和小鼠基质细胞的细胞之间。 MAME的模型是一个听话的系统。感兴趣的分子可以在单个细胞类型的shRNA下调前共培养，使他们DQ-胶原降解，细胞类型中的贡献可以在三维成像和量化。 MAME的型号的空调媒体可以采样来衡量蛋白酶分泌的改变，细胞因子等获得的信息提供了一个测试的小分子抑制剂的影响，封闭抗体等实验依据

MAME的共同培养​​的细胞组成，可以很容易地操纵，使人们可以用它们来评估其他类型的细胞在肿瘤微环境（例如，肌上皮细胞，单核细胞，内皮细胞的血液中发现的贡献血管和淋巴管的起源）恶性进展^6,7。各种细胞类型的种子，一个细胞类型的比例，到另一个文化中的时间长度将取决于在特定的细胞类型和实验的问题。 MAME的模型也可以扩展到周围的乳腺肿瘤微环境的变化，如pH值，氧分压的影响评估。例如，我们已经表明，MAME的文化时，都保持在微酸性pH值，pH值6.8，即有增加蛋白质和侵袭。此外，我们还表明，我们可以使用类似的共同培养​​，以模拟其他癌症，如前列腺癌。