Etiquetado inmunohistológica de microtúbulos en las dendritas neurona sensorial, tráqueas y los músculos en el Drosophila Larva pared del cuerpo

1. Preparación de los reactivos

Notas antes de comenzar: la disección y la tinción inmunohistoquímica se llevan a cabo en una cámara magnética y la larva se fija por el uso de clavos de insectos de forma especial. Las instrucciones detalladas para la construcción de una cámara magnética, y la preparación de estos pines se pueden encontrar en las referencias relacionadas con ^14,15. En resumen, un agujero cuadrado 1x1cm se corta en una hoja magnética y un cubreobjetos colocado en la parte posterior de la hoja para hacer una pequeña cámara. Los lados de la cámara está sellada con pegamento epóxico, después de esta cola se ha fijado la cámara se lava varias veces con etanol al 70% antes de su uso. Pines disección de insectos son preparados por la flexión a la forma deseada y luego pegado a una lengüeta metálica ^14,15. Como alternativa a una ficha de metal, se ha utilizado una invertida de cabeza plana chincheta de acero con un mango de una punta amarilla de corte. Uso de esta cámara magnética permite un estrecho control over posicionamiento pin y el tejido se extiende durante la disección.

Para conducir la expresión del gen en diferentes subgrupos de neuronas DA investigadores pueden utilizar varias líneas diferentes Gal4 (resumidos por Shimono y sus colegas ^16). Muchas de estas líneas están disponibles de los centros públicos de acciones. En este protocolo representante, llevamos a cabo la inmunotinción de una línea en la que dos clases opuestas de neuronas DA son co-etiquetado: el más simple de clase I y la mayoría de los complejos de clase IV (P10-Gal4 ^17,18, UAS-mCD8:: Kusabira-Orange (KO)).

1. Prepare Ca ^{+ +} libre HL3.1 solución salina
   1. En mM: 70 NaCl, 5 KCl, 20 de MgCl _2, 10 NaHCO _3, 5 HEPES, sacarosa 115, y trehalosa 5, pH 7,2 ^19. Filtro-esterilizar y almacenar a 4 ° C. Nota: Ca ^{+ +} sin solución impide la contracción muscular durante la disección.
2. Prepare 2x tampón PHEM
   1. En mM: 130 TUBOS, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4, pH 7,0. Filtro-esterilizar y almacenar a 4 ° C.

      Nota: Estos materiales no se disuelven hasta que se acerque el pH 7,0.

3. Preparar el fijador recién inmediatamente antes de la fijación.
   1. Con el fin de preparar una solución de 25 ml, paraformaldehído primera mezcla de 2 g, 100μl 1M NaOH y 10 ml de agua en un tubo de 50 ml Falcon.
   2. Agite el fijador en un baño de agua a 55 ° C con agitación hasta que la solución es clara. (Volumen total será de unos 11,5 ml.)
   3. Fijador de enfriar en hielo.
   4. Añadir buffer 12.5ml 2x PHEM.
   5. Ajustar el pH a 7.0 con HCl 1M.
   6. Llene la solución con agua hasta que el volumen es de 25 ml.
   7. Filtrar la solución con papel Whatman.

2. Disección de las larvas

Tenga en cuenta antes de empezar: las redes de microtúbulos, y en particular los de las dendritas sensorial, se descompondrá rápidamente después del inicio de la disección. Corriente alternahieving disección rápida en menos de cinco minutos, seguido de la fijación inmediata son factores clave en el éxito de este protocolo.

1. Lave la larva en el agua y rápidamente pasar a esta caída con un bucle de cabello.
2. Orientar la larva hasta la parte dorsal y la parte ventral en el cristal. Nota: Esta orientación es el de examinar las neuronas grupo ventral. Para examinar las neuronas dorsales cluster, invertir la orientación.
3. Use el centro de insectos-pin a pin del extremo anterior cerca de los ganchos de la boca. Coloque el pasador cerca del final para obtener mejores resultados.
4. Ponga una gota de solución salina HL3.1 en la cámara de disección.
5. Cortar la punta posterior de la larva de con micro tijeras. Nota: Este paso se abre una abertura en el extremo posterior de la larva que va a permitir el acceso de la micro tijeras (paso 2.7).
6. Coge con las pinzas de la región del intestino que está asomando de la abertura en el extremo posterior de la larva. Retire con cuidado todo el intestino.
7. Coloque elpunta de una hoja de la micro tijeras a través de la apertura y corte a lo largo de la línea media ventral hacia la parte anterior.
8. Utilizando los pines esquina, las esquinas del ahora libre, posterior, luego anterior. Al mismo tiempo estira suavemente abrir el filete de larvas.

3. Fijación, bloqueo, tinción y montaje de los filetes de larvas

Notas antes de empezar: Todas las medidas de fijación y tinción se llevó a cabo en la sala de disección. Durante este proceso, tenga cuidado de no tocar los pines de la celebración de la larva del insecto, ya que puede conducir a daños en los tejidos. Para evitar que el experimento de la desecación, se todos los pasos de tinción en un pequeño recipiente Tupperware rodeado por tejidos húmedos.

1. Aspirar el Ca ^{+ +} libre HL3.1 buffer usando una punta amarilla. Inmediatamente añadir el fijador con otro pipetteman.
2. Pipeta suavemente arriba y abajo para mezclar el fijador con las trazas restantes de Ca ^{+ +} libre HL3.1 bufferen la cámara. Inmediatamente aspirado y luego añadir el fijador fresco en la cámara.
3. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
4. Lavado de 10 minutos 6 veces en PBST (0,1% Triton X-100 en PBS).
5. Bloquear con suero de cabra al 5% en PBST durante 20 minutos a temperatura ambiente.
6. Vuelva a colocar la solución de bloqueo con anticuerpos primarios diluidos en suero de cabra al 5% en PBST. Los anticuerpos primarios utilizados son el ratón anti-α-tubulina (DM1A) y la rata anti-CD8 (5H10), tanto diluido 1 / 1000.

   Nota: El investigador puede desear a sustituir el ratón anti-α-tubulina (DM1A) con el ratón anti-Futsch (22C10) diluido ^20,21 1 / 1000 en algunas circunstancias (véase la discusión).

7. Incubar toda la noche (por lo menos a las 16h) a 4 ° C.
8. Lavado de 10 minutos 6 veces en PBST.
9. Añadir la solución de anticuerpo secundario diluido en suero de cabra al 5% en PBST. Los anticuerpos secundarios utilizados son Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG y Cy3 burro IgG anti-rata. Mantener la muestra cubierta para evitar fluoróforofoto-blanqueo ^22.
10. Incubar ya sea a temperatura ambiente durante dos horas, o durante la noche a 4 ° C, seguida de una hora a temperatura ambiente.
11. Lavado de 10 minutos 6 veces en PBST.
12. Coloque los filetes de larvas en la diapositiva de la cutícula hacia abajo, monte en el 80% de glicerol, y el sello de los lados del cubreobjeto con esmalte de uñas para un "rápido" de montaje.
    Nota: Para limpiar el tejido mejora, y una muestra de estabilidad permanente, montar en DPX como se describió previamente ^23.

4. Los resultados representativos:

Tinción fluorescente se examinan bajo un microscopio confocal. En las Figuras 1-2 ramas, diferentes dentro de un jardín de dendritas tienen la organización del citoesqueleto diferentes. La figura 1 muestra una región de la glorieta de la clase IV DA neuronas en la 1 ^ª fase estadio larval. La pérgola entera está marcada con mCD8:: KO y detectado usando un anticuerpo anti-CD8 y fluorescentes secundaria (Cy3). Tubulina se detecta el uso de anti α-tubulina de anticuerpos y fluorescent secundario (Alexa Fluor 488). Las ramas principales son positivos para la tubulina, algunas ramas laterales delgadas son tubulina-negativo. Movie 1 es un conjunto de secciones en serie a través de una coloración similar de una clase I DA neuronas. La figura 2 muestra una región de la glorieta de la clase IV DA neuronas teñidas con anticuerpos contra Futsch y CD8 en la 1 ^ª fase estadio larval. Las ramas principales son Futsch-positivas, algunas ramas laterales delgadas son Futsch negativo. Figura 3. Tráqueas en la pared del cuerpo de larvas muestran una organización compleja de microtúbulos. Películas 2 y 3 muestran las secciones de serie de manchas a través de los músculos de la pared del cuerpo y la tráquea.

Figura 1. Fig. 1 muestra una región de la glorieta de la clase IV DA neuronas en la 1 ^ª fase estadio larval. La pérgola entera está marcada con mCD8:: KO y detectado usando anticuerpo anti-CD8 y fluorescentes secundaria (Cy3). Tubulina se detecta el uso de anti-&-túbulosn de anticuerpos fluorescentes y secundario (Alexa 488). Paneles AC secuencial confocal z-secciones (0.5μm), C '-C ", la tinción de anticuerpos única desde el panel de C. Ejemplo de ramas con (punta de flecha amarilla) o sin (púrpura punta de flecha) se destacan los microtúbulos. Puntas de flecha roja microtúbulos destacar en el subyacente las células epiteliales.

Figura 2. Fig. La figura 2 muestra una región similar de la glorieta de la clase IV da neuronas teñidas con anticuerpos contra Futsch y CD8 en la 1 ^ª fase estadio larval. La pérgola entera está marcada con mCD8:: KO y detectado usando anticuerpo anti-CD8 y fluorescentes secundaria (Cy3). Futsch se detecta el uso de anti-anticuerpos fluorescentes y Futsch secundario (Alexa 488). Las ramas principales son Futsch-positivas, algunas ramas laterales delgadas son Futsch negativo. Ejemplo de las ramas con (punta de flecha amarilla) o sin (púrpura punta de flecha) Futsch se destacan.

Figura 3. Tráquea teñidas utilizando el protocolo anti-tubulina se ha descrito anteriormente. Esta larva es el tercer estadio y diseccionado como se describió previamente ^23,24. Movie 3 muestra ampliada de serie de secciones en el campo marcado por un cuadrado.

Secciones de cine 1. Serie trazado tinción tubulina a través de la glorieta dendríticas de una clase que las neuronas. La pérgola entera está marcada con mCD8:: KO (Magenta) y detectado usando anticuerpo anti-CD8 y fluorescentes secundaria (Cy3). Tubulina (verde) se detecta mediante un anticuerpo anti-α-tubulina y fluorescentes secundario (Alexa Fluor 488). Escala: de un lado de la imagen de vídeo se corresponde con 46.88μm en la sección. Haga clic aquí para ver la película.

Movie 2. Serie secciones trazado tinción tubulina en cuerposy la pared muscular de un tercer instar de la larva. Tubulina se detecta el uso de anti-α-tubulina de anticuerpos fluorescentes y secundario (Alexa Fluor 488). Escala: de un lado de la imagen de vídeo se corresponde con 46.88μm en la sección. Haga clic aquí para ver la película.

Movie 3. Las secciones seriadas búsqueda tinción tubulina en un cuerpo de la pared de la tráquea tercera instar de la larva, marcado con un cuadrado en Figure.3. Tubulina se detecta el uso de anti-α-tubulina de anticuerpos fluorescentes y secundario (Alexa Fluor 488). Escala: de un lado de la imagen de vídeo se corresponde con 46.88μm en la sección. Haga clic aquí para ver la película.

Para entender la complejidad de las formas celulares se logró es importante ser capaz de precisión organización de microtúbulos ensayo. Aquí se describe un método robusto de etiquetado inmunohistoquímico para la organización de los microtúbulos ensayo dendríticas dendritas arborización neurona sensorial. Además de la tinción de las neuronas sensoriales, este método logra tinción inmunohistoquímica robusta de la tráquea, músculos y otros tejidos de la pared del cuerpo.

Nosotros usamos este protocolo para examinar la organización de microtúbulos en las dendritas de las neuronas sensoriales desarrollo DA. Estas dendritas son muy sensibles a lesión o estrés en ^25, y se descomponen rápidamente después del inicio de la disección de ^23. La disección debe llevarse a cabo en cinco minutos o menos. Microtúbulos en la tráquea y otros tejidos de la pared del cuerpo son más estables. Este protocolo es una adaptación de los utilizados preparar filetes de larvas para el análisis de la unión neuromuscular ^14,15, y está optimizado para f rápidaixation después de una disección rápida.

Al analizar las dendritas de las neuronas DA, robusto anti-tubulina tinción en el músculo por encima, y las células epiteliales subyacentes ^{de 26 años} pueden conducir a un complicado patrón de tinción (Figura 1, Película1). Por lo tanto, una cuidadosa búsqueda de manchas dendríticas a través de varias secciones en serie (Película1) puede ser requerido para realizar un análisis completo de la organización de los microtúbulos en la DA neuronal dendrita cenador. Los anticuerpos monoclonales específicos para el homólogo de Drosophila MAP1B, Futsch ^20,21, también puede ser utilizada para etiquetar los microtúbulos del citoesqueleto en el sistema nervioso periférico de Drosophila ^5,9,20. Futsch se expresa sólo en las neuronas y por lo tanto produce un patrón de tinción menos complicada que la α-tubulina (Figura 2). GFP-etiquetados-endógena-Tau también ha sido utilizada como un marcador de las neuronas DA dendríticas microtúbulos ^27. El uso de estos marcadores es eficaz, pero es preciso señalar que en el axón-terminales de the unión neuromuscular Futsch específicamente las etiquetas de paquetes de microtúbulos ^28. La relación exacta espacial entre Futsch, Tau, y los microtúbulos en las dendritas DA aún no se han caracterizado completamente. En este protocolo se han ocupado de la organización de microtúbulos endógeno. También es posible a los microtúbulos de etiqueta con la sobreexpresión de Tau GFP etiquetados o tubulina. Se debe tener cuidado en contra de la inducción de fenotipos no anticipados cuando se acerca la sobreexpresión se utilizan ^29.

En nuestras manos, la tinción inmunohistoquímica de los microtúbulos de las neuronas DA y otros tejidos de la pared del cuerpo se logra mejor cuando los anticuerpos secundarios utilizados para detectar el anticuerpo anti-tubulina primaria está acoplado a un fluoróforo fácilmente visualizados como Alexa Fluor 488. Por lo tanto cuando se utilizan herramientas para etiquetar transgénicos neuronas DA en concierto con anti-tubulina por ejemplo, el etiquetado a través del sistema GAL4/UAS, sistema de LexA, o en MARCM ²³ y derivados MARCM, preferimos las proteínas marcadoras dede superposición espectral con esta secundaria, como mCD8:: Cherry y mCD8:: KO.