Immunohistological Merking av mikrotubuli i Sensory Neuron dendritter, trakéene, og musklene i Drosophila Larva Body Wall

1. Forberedelse av reagenser

Merknader før du begynner: disseksjon og immunhistokjemisk farging utføres i et magnetisk kammer og larven er låste ned med spesielt formet insekt pinner. Detaljerte instruksjoner om bygging av et magnetisk kammer, og utarbeidelse av disse pinnene kan finnes i relaterte referanser ^14,15. I korte trekk er en 1x1cm firkantet hull inn i et magnetisk ark og et dekkglass festet til baksiden av arket for å gjøre et lite kammer. Sidene av kammeret er forseglet med epoxy lim, og etter dette limet har satt kammeret er vasket flere ganger med 70% etanol før bruk. Disseksjon insekt pins er forberedt ved å bøye til ønsket form og deretter limt på en metall fane ^14,15. Alternativt til en metall-kategorien, har vi brukt en omvendt flat-head stål tegnestift med et håndtak laget av en cut-off gul spissen. Bruk av denne magnetiske kammeret ordningen gir god kontroll over pin posisjonering og vevet strekker seg under disseksjon.

Å kjøre reporter genuttrykk i ulike undergrupper av DA nevroner etterforskere kan bruke flere forskjellige Gal4 linjer (oppsummert av Shimono og kolleger ^16). Mange av disse linjene er tilgjengelig fra offentlige lager sentre. I denne representative protokollen, gjennomfører vi farging av en linje der to kontrasterende klasser av DA nervecellen er co-merket: de mest enkle-klasse I og mest komplekse-klasse IV (P10-Gal4 ^17,18, UAS-mCD8:: Kusabira-Orange (KO)).

1. Forbered Ca ^{+ +-free} HL3.1 saltvann
   1. I mM: 70 NaCl, 5 KCl, 20 ₂ MgCl, 10 ₃ NaHCO, 5 HEPES, 115 sukrose, og 5 trehalose; pH 7,2 ^19. Filter-sterilisere og oppbevar ved 4 ° C. Merk: Ca ^{+ +-free} løsning forhindrer muskel sammentrekning ved disseksjon.
2. Forbered 2x PHEM buffer
   1. I mm: 130 RØR, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4, pH 7,0. Filter-sterilisere og oppbevar ved 4 ° C.

      Merk: Disse materialene vil ikke oppløse før pH nærmer seg 7.0.

3. Klargjør fiksativ fersk umiddelbart før fiksering.
   1. For å forberede en 25ml løsning, første mix 2g Paraformaldehyde, 100μl 1M NaOH og 10ml vann i en 50ml Falcon tube.
   2. Rist fiksativ i en 55 ° C vannbad med shaker til løsningen er klar. (Totalt volum vil være ca 11,5 ml.)
   3. Cool fiksativ på is.
   4. Legg 12.5ml 2x PHEM buffer.
   5. Juster pH til 7,0 med 1M HCl.
   6. Fyll løsningen med vann til volumet er 25ml.
   7. Filter løsningen bruker Whatman papir.

2. Larve disseksjon

Merk før du begynner: microtubuli nettverk, og særlig de i sensorisk dendritter, vil nedbrytningen raskt etter oppstart av disseksjon. Achieving rask disseksjon på mindre enn fem minutter etterfulgt av umiddelbar fiksering er sentrale faktorer i suksessen til denne protokollen.

1. Vask larve i vann og raskt flytte dem inn i dette slippe å bruke en sløyfe av hår.
2. Orient larven dorsale siden opp og den ventrale siden på glasset. Merk: Denne orienteringen er å undersøke ventrale klynge nerveceller. Å undersøke dorsal cluster nevroner, snu retningen.
3. Bruk sentrum insekt-pin til pin fremre enden nær munningen kroker. Plasser pin nær slutten for best resultat.
4. Legg en dråpe HL3.1 saltvann i disseksjon kammeret.
5. Kutt svært posterior tuppen av larven av med microscissors. Merk: Dette trinnet åpner en blenderåpning på bakre enden av larven som vil tillate tilgang for microscissors (trinn 2,7).
6. Grab med pinsett regionen tarmen som nå poking ute av blenderåpning ved bakre enden av larva. Trekk ut hele tarmen.
7. Plassertuppen av ett blad av microscissors gjennom åpningen og kutt langs ventrale midtlinjen mot anterior.
8. Bruke hjørnet pins, pin den nå frie hjørnene, posterior først, deretter anterior. Samtidig forsiktig strekke åpne larve fileten.

3. Fiksering, blokkering, flekker, og montering av larve filet

Merknader før du begynner: All fiksering og farging av trinnene er gjennomført i disseksjon kammeret. Under denne prosessen være forsiktig med å banke insekt pinnene som holder larven da dette kan føre til vevsskade. For å hindre forsøket tørker ut, gjør alt flekker trinn i en liten Tupperware container omgitt av fuktet vev.

1. Aspirer Ca ^{+ +-free} HL3.1 buffer ved hjelp av en gul tupp. Umiddelbart legger fiksativ bruker en annen pipetteman.
2. Forsiktig pipette opp og ned for å blande fiksativ med rester av Ca ^{+ +-free} HL3.1 bufferi kammeret. Umiddelbart aspirer det og deretter legge til frisk fiksativ inn i kammeret.
3. Inkuber ved romtemperatur i 20 minutter.
4. Vask 6x 10mins i PBST (0,1% Triton X-100 i PBS).
5. Blokker med 5% geit serum i PBST for 20 min ved RT.
6. Erstatt blokkering løsningen med primære antistoffer fortynnet i 5% geit serum i PBST. Den primære antistoffer som brukes er mus anti-α-tubulin (DM1A) og rotte anti-CD8 (5H10) begge fortynnet 1 / 1000.

   Merk: Etterforskeren kan ønske å erstatte mus anti-α-tubulin (DM1A) med mus anti-Futsch (22C10) ^20,21 fortynnet 1 / 1000 i noen tilfeller (se diskusjon).

7. Inkuber over natten (minst 16h) ved 4 ° C.
8. Vask 6x 10mins i PBST.
9. Legg sekundært antistoff løsning fortynnet i 5% geit serum i PBST. Den sekundære antistoffer som brukes er Alexa Fluor 488 geit anti-mus IgG og Cy3 esel anti-rotte IgG. Hold prøven tildekket for å forhindre fluoroforenfoto-bleking ^22.
10. Inkuber enten ved RT i to timer eller over natten ved 4 ° C, etterfulgt av en time ved romtemperatur.
11. Vask 6x 10mins i PBST.
12. Plasser larve fileten på lysbildet skjellaget-side ned, montere i 80% glyserol, og forsegle sidene av dekkglass med neglelakk for en "rask" mount.
    Merk: For forbedret vev clearing, og en varig stabil prøve, monter i DPX som tidligere beskrevet ^23.

Fire. Representant Resultater:

Fluorescent farging ble undersøkt under et confocal mikroskop. I figur 1-2, forskjellige grener innenfor et dendrite arbor har forskjellige cytoskeletal organisasjon. Figur 1 viser en region av arbor av en klasse IV DA nervecellen på den ^1. Instar larvestadiet. Hele arbor er merket med mCD8:: KO og oppdaget ved hjelp av en anti-CD8 antistoff og fluorescerende sekundære (Cy3). Tubulin er oppdaget ved hjelp av anti α-tubulin antistoff og fluorescent sekundær (Alexa Fluor 488). Er de viktigste grenene positive til tubulin, noen tynne sidegreiner er tubulin-negative. Movie 1 er et sett av seriell seksjoner gjennom en lignende farging av en klasse jeg DA neuron. Figur 2 viser en region av arbor av en klasse IV DA neuron farget med antistoffer mot Futsch og CD8 på ^1. Instar larvestadiet. Er de viktigste grenene Futsch-positive, noen tynne sidegreiner er Futsch-negative. Figur 3. Trakéene i larve kroppen veggen viser en kompleks microtubuli organisasjon. Movies 2 og 3 viser seriell deler av misfarging gjennom kroppen veggen muskler og luftrør.

Figur 1. Fig. 1 viser en region av arbor av en klasse IV DA nervecellen på den ^1. Instar larvestadiet. Hele arbor er merket med mCD8:: KO og oppdaget ved hjelp av anti-CD8 antistoff og fluorescerende sekundære (Cy3). Tubulin er oppdaget ved hjelp av anti-&-Tubulin antistoff og fluorescerende sekundære (Alexa 488). Paneler AC sekvensiell confocal z-seksjoner (0.5μm), C'-C ", single antistoff flekker fra panel C. Eksempel på grener med (gul pilhode) eller uten (lilla pilspiss) mikrotubuli er uthevet. Red pilspisser høydepunkt mikrotubuli i underliggende epitelceller.

Figur 2. Fig. 2 viser en lignende region av arbor av en klasse IV da neuron farget med antistoffer mot Futsch og CD8 på ^1. Instar larvestadiet. Hele arbor er merket med mCD8:: KO og oppdaget ved hjelp av anti-CD8 antistoff og fluorescerende sekundære (Cy3). Futsch er oppdaget ved hjelp av anti-Futsch antistoff og fluorescerende sekundære (Alexa 488). Er de viktigste grenene Futsch-positive, noen tynne sidegreiner er Futsch-negative. Eksempel på grener med (gule pilspissen) eller uten (lilla pilspiss) Futsch er uthevet.

Figur 3. Luftrøret farget med anti-tubulin protokoll beskrevet ovenfor. Denne larva er tredje Instar og dissekert som tidligere beskrevet ^23,24. Movie 3 viser forstørret seriesnitt fra feltet markert med en firkant.

Movie 1. Serial seksjoner tracing tubulin flekker over hele dendrittiske arbor av en klasse jeg neuron. Hele arbor er merket med mCD8:: KO (Magenta) og oppdaget ved hjelp av anti-CD8 antistoff og fluorescerende sekundære (Cy3). Tubulin (Green) er oppdaget ved hjelp av en anti-α-tubulin antistoff og fluorescerende sekundær (Alexa Fluor 488). Skala: en side av videobildet tilsvarer 46.88μm i seksjonen. Klikk her for å vise filmen.

Movie 2. Serial seksjoner tracing tubulin flekker i body veggen muskler av en tredje Instar larve. Tubulin er oppdaget ved hjelp av anti-α-tubulin antistoff og fluorescerende sekundær (Alexa Fluor 488). Skala: en side av videobildet tilsvarer 46.88μm i seksjonen. Klikk her for å vise filmen.

Movie 3. Serial seksjoner tracing tubulin flekker i en kropp vegg trachea av en tredje Instar larve, markert med en firkant i Figure.3. Tubulin er oppdaget ved hjelp av anti-α-tubulin antistoff og fluorescerende sekundær (Alexa Fluor 488). Skala: en side av videobildet tilsvarer 46.88μm i seksjonen. Klikk her for å vise filmen.

For å forstå hvordan komplekse celle former er oppnådd er det viktig å kunne nøyaktig analysen microtubuli organisasjon. Her beskriver vi en robust immunohistological merking metode for å analysen microtubuli organisering av dendrittiske arborization neuron sensoriske dendritter. I tillegg til flekker sensoriske nevroner, oppnår denne metoden robust immunohistological farging av trachea, muskler og andre organ veggen vev.

Vi bruker denne protokollen å undersøke microtubuli organisasjon i utvikling av sensoriske dendritter av DA nerveceller. Disse dendritter er svært følsomme for skade eller stress ^25, og bryte ned raskt etter begynnelsen av disseksjon ^23. Disseksjon bør utføres på fem minutter eller mindre. Mikrotubuli i luftrøret og andre organ veggen vev er mer stabile. Denne protokollen er tilpasset fra de som brukes forberede larve fileter for analyse av nevromuskulære krysset ^14,15, og er optimalisert for raske fixation etter en rask disseksjon.

Når analysere dendritter av DA nevroner, robust anti-tubulin flekker i overliggende muskler, og underliggende epitelceller ²⁶ kan føre til en komplisert flekker mønster (Figur 1, Movie1). Derfor nøye sporing av dendrittiske flekker gjennom flere serial seksjoner (Movie1) kan være nødvendig for en full analyse av microtubuli organisasjon i DA neuron dendrite Arbor. Monoklonale antistoffer mot den spesifikke Drosophila homologue av MAP1B, ^20,21 Futsch, kan også brukes til å merke microtubuli cytoskjelettet i Drosophila perifere nervesystemet ^5,9,20. Futsch uttrykkes bare i nevroner og dermed den produserer en mindre komplisert flekker mønster enn α-tubulin (figur 2). GFP-merket-endogene-Tau har også blitt brukt som en markør av DA nervecellen dendrittiske mikrotubuli ^27. Bruk av disse markørene er effektiv, men det bør bemerkes at i axon-Termini av the neuromuscular junction Futsch etiketter spesielt buntet mikrotubuli ^28. Den eksakte romlige relasjoner mellom Futsch, Tau, og mikrotubuli i DA dendritter er ennå ikke fullstendig karakterisert. I denne protokollen har vi adressert endogen microtubuli organisasjon. Det er også mulig å merke mikrotubuli bruke overuttrykte GFP tagget Tau eller tubulin. Forsiktighet bør utvises mot framkalle uventede fenotyper når overekspresjon tilnærminger brukes ^29.

I våre hender, er immunhistokjemisk farging av mikrotubuli i DA nevroner og andre organ veggen vev best oppnås når den sekundære antistoffer brukes til å oppdage den anti-tubulin primære antistoff er koblet til en lett-visualized fluoroforen slik som Alexa Fluor 488. Derfor ved bruk av transgene verktøy å merke DA nevroner i konsert med anti-tubulin merking f.eks via Gal4/UAS system, Lexa systemet, eller i MARCM ²³ og MARCM derivater, foretrekker vi markør proteiner medut spektral overlapp med denne sekundære, som mCD8:: Cherry og mCD8: KO.