Immunohistological Märkning av mikrotubuli i sensoriska neuron dendriter, Tracheae och muskler i Drosophila Larva Body Wall

1. Beredning av reagens

Anteckningar innan du börjar: Dissection och immunhistokemisk färgning utförs i en magnetisk kammare och larven är låst ner med speciellt formade insekter stift. Detaljerade anvisningar om byggandet av en magnetisk kammare, och beredning av dessa stift finns i referenser ^14,15. I korthet är en 1x1cm fyrkantigt hål skärs i en magnetisk plåt och ett täckglas som fästs på baksidan av bladet för att göra en liten kammare. Sidorna av kammaren förseglas med epoxy lim, varefter limmet har satt kammaren tvättas flera gånger med 70% etanol före användning. Dissection insekter stift är förberedda genom att böja till önskad form och sedan limmas på en metall flik ^14,15. Alternativt att en metall flik har vi använt en inverterad platt huvud stift stål ritning med ett handtag från en cut-off gul spets. Användning av denna magnetisk kammare arrangemang låter nära kontroll Over pin positionering och vävnad stretching under dissekering.

Att köra uttryck reporter genen i olika undergrupper av DA neuron utredare kan använda flera olika Gal4 linjer (sammanfattas av Shimono och kollegor ^16). Många av dessa rader är tillgängliga från offentliga lager centra. I detta representativa protokoll, utför vi immunfärgning av en linje där två kontrasterande klasser av DA neuron är co-märkt: de mest enkla klass I och mest komplexa-klass IV (P10-Gal4 ^17,18, UAS-mCD8:: Kusabira-Orange (KO)).

1. Förbered Ca ^{+ +-free} HL3.1 koksaltlösning
   1. I mm: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl _2, 10 NaHCO _3, 5 HEPES, 115 sackaros och 5 trehalos, pH 7,2 ^19. Filter-sterilisera och lagra vid 4 ° C. Obs: Ca ^{+ +-free-lösning} förhindrar muskelsammandragningar under dissekering.
2. Förbered 2x PHEM buffert
   1. I mm: 130 RÖR, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4, pH 7,0. Filter-sterilisera och lagra vid 4 ° C.

      Obs: Dessa material löses inte upp tills pH närmar sig 7,0.

3. Förbered fixativ nyligen omedelbart före fixering.
   1. I syfte att förbereda en 25ml lösning, först blanda 2g paraformaldehyd, 100μl 1M NaOH och 10 ml vatten i en 50 ml Falcon rör.
   2. Skaka fixativ i ett 55 ° C vattenbad med skakare tills lösningen är klar. (Total volym är ca 11,5 ml.)
   3. Cool fixativ på is.
   4. Tillsätt 12,5 ml 2x PHEM buffert.
   5. Justera pH till 7,0 med 1 M HCl.
   6. Fyll med vatten tills volymen är 25ml.
   7. Filtrera lösningen med Whatman papper.

2. Larver dissektion

Observera innan du börjar: mikrotubuli nätverk, och särskilt inom sensorisk dendriter, kommer fördelningen snabbt efter inledandet av dissekering. Achieving snabb dissektion på mindre än fem minuter följt av omedelbar fixering är viktiga faktorer för framgång i detta protokoll.

1. Tvätta larven i vatten och snabbt flytta dem till denna minskning med hjälp av en slinga av håret.
2. Orient larven ryggen uppåt och ventrala sidan på glaset. OBS: Denna inriktning är att undersöka den ventrala klustret nervceller. För att undersöka rygg kluster nervceller, invertera orientering.
3. Använd centrum insekt stift till stift den främre änden nära munnen krokar. Placera stift nära slutet för bästa resultat.
4. Placera en droppe HL3.1 koksaltlösning i dissekering kammaren.
5. Skär mycket bakre spetsen av larven iväg med microscissors. OBS: Detta steg öppnar en öppning i bakre änden av larven som kommer att ge tillgång till microscissors (steg 2,7).
6. Ta med pincett regionen tarmen som nu sticker ut från öppningen i den bakre änden av larven. Dra försiktigt ut hela tarmen.
7. Placeraspetsen på ett blad av microscissors genom öppningen och skär längs den ventrala mittlinjen mot den främre.
8. Använda hörnet stift, stift den nu fria hörn, bakre först, sedan främre. Samtidigt försiktigt tänja öppna larver filén.

3. Fixering, blockering, färgning, och montering av larver filéer

Anteckningar innan du börjar: Alla fixering och steg färgning utförs i dissekering kammaren. Under denna process, vara noga med att inte slå insekten stiften som håller larven eftersom detta kan leda till vävnadsskador. För att förhindra att experimentet torkar ut, göra allt färgning steg i en liten Tupperware behållare omgiven av fuktad vävnader.

1. Aspirera Ca ^{+ +-free} HL3.1 buffert med hjälp av en gul spets. Omedelbart lägga till fixativ med en annan pipetteman.
2. Försiktigt pipettera upp och ner att blanda fixativ med de återstående spår av Ca ^{+ +-free} HL3.1 bufferti kammaren. Omedelbart aspirera den och sedan lägga till färska fixativ in i kammaren.
3. Inkubera vid rumstemperatur i 20 minuter.
4. Tvätta 6x 10mins i PBST (0,1% Triton X-100 i PBS).
5. Block med 5% get serum i PBST i 20 minuter vid RT.
6. Byt ut den blockerande lösningen med primära antikroppar utspädd i 5% get serum i PBST. De primära används antikroppar mus-anti-α-tubulin (DM1A) och råtta anti-CD8 (5H10) både utspädd 1 / 1000.

   Obs: Utredaren kan vilja ersätta mus-anti-α-tubulin (DM1A) med mus-anti-Futsch (22C10) ^20,21 utspädd 1 / 1000 i vissa fall (se diskussion).

7. Inkubera över natten (i minst 16 timmar) vid 4 ° C.
8. Tvätta 6x 10mins i PBST.
9. Lägg sekundär antikropp lösning utspädd i 5% get serum i PBST. De sekundära används antikroppar Alexa Fluor 488 get anti-mus IgG och Cy3 åsna anti-råtta IgG. Håll provet täckas för att förhindra fluoroforenfoto-blekning ^22.
10. Inkubera antingen på RT för två timmar, eller över natten vid 4 ° C följt av en timme i rumstemperatur.
11. Tvätta 6x 10mins i PBST.
12. Placera larver filén på bilden nagelbanden och ner, montera i 80% glycerol och täta sidor täckglas med nagellack för en "snabb" mount.
    OBS: För att förbättra vävnad clearing, och en permanent stabil prov montera i DPX som tidigare beskrivits ^23.

4. Representativa resultat:

Fluorescerande infärgning undersöktes under ett konfokalmikroskop. I figur 1-2, olika grenar inom en Dendrite berså har olika cytoskelettala organisation. Figur 1 visar en region i bersån en klass IV DA neuron vid 1: ^a INSTAR larvstadiet. Hela berså är märkt med mCD8:: och KO påvisas med en anti-CD8 antikropp och fluorescerande sekundära (Cy3). Tubulin detekteras med hjälp av anti α-tubulin antikropp och fluorescent sekundära (Alexa Fluor 488). De viktigaste grenarna är positivt för tubulin, några tunna sidogrenar är tubulin-negativa. Film 1 är en uppsättning seriella delar genom en liknande färgning av en klass I DA neuron. Figur 2 visar en region i bersån en klass IV DA neuron som färgats med antikroppar mot Futsch och CD8 vid 1: ^a INSTAR larvstadiet. De viktigaste grenarna är Futsch-positiva, några tunna sidogrenar är Futsch-negativa. Figur 3. Tracheae i larvkroppen väggen visar en komplex mikrotubuli organisation. Filmer 2 och 3 visar seriella delar av färgning i muskler kroppen vägg och luftstrupe.

Figur 1. Fig. 1 visar en region i bersån en klass IV DA neuron vid 1: ^a INSTAR larvstadiet. Hela berså är märkt med mCD8:: KO och detekteras med anti-CD8 antikropp och fluorescerande sekundära (Cy3). Tubulin upptäcks med hjälp av anti-&-tubulin antikropp och fluorescerande sekundära (Alexa 488). Paneler AC sekventiell konfokala Z-profiler (0.5μm), C'-C ", enda antikropp fläckar från panel C. Exempel på grenar med (gul pil) eller utan (lila pilspets) mikrotubuli är markerade. Röda pilspetsar markerar mikrotubuli i den underliggande epitelceller.

Figur 2. Fig. 2 visar en liknande region i bersån en klass IV da neuron som färgats med antikroppar mot Futsch och CD8 vid 1: ^a INSTAR larvstadiet. Hela berså är märkt med mCD8:: KO och detekteras med anti-CD8 antikropp och fluorescerande sekundära (Cy3). Futsch upptäcks med hjälp av anti-Futsch antikropp och fluorescerande sekundära (Alexa 488). De viktigaste grenarna är Futsch-positiva, några tunna sidogrenar är Futsch-negativa. Exempel på branscher med (gul pil) eller utan (lila pilspets) Futsch är markerade.

Figur 3. Luftstrupe färgas med den anti-tubulin protokoll som beskrivs ovan. Denna larv är tredje INSTAR och dissekeras som tidigare beskrivits ^23,24. Movie 3 visar utvidgade seriella avsnitt från fältet markeras med en kvadrat.

Film 1. Serial avsnitt spåra tubulin färgning hela dendritiska berså i en klass I neuron. Hela berså är märkt med mCD8:: KO (Magenta) och detekteras med anti-CD8 antikropp och fluorescerande sekundära (Cy3). Tubulin (Grön) upptäcks med hjälp av en anti-α-tubulin antikropp och fluorescerande sekundära (Alexa Fluor 488). Skala: ena sidan av videobilden motsvarar 46.88μm i avsnittet. Klicka här för att se filmen.

Film 2. Serial sektioner spåra tubulin färgning i BODy vägg muskler en tredje INSTAR larv. Tubulin upptäcks med hjälp av anti-α-tubulin antikropp och fluorescerande sekundära (Alexa Fluor 488). Skala: ena sidan av videobilden motsvarar 46.88μm i avsnittet. Klicka här för att se filmen.

Film 3. Serial sektioner spåra tubulin färgning i en kropp vägg luftstrupen i tredje INSTAR larv, märkt med ett torg i Figure.3. Tubulin upptäcks med hjälp av anti-α-tubulin antikropp och fluorescerande sekundära (Alexa Fluor 488). Skala: ena sidan av videobilden motsvarar 46.88μm i avsnittet. Klicka här för att se filmen.

För att förstå hur komplexa cell former uppnås är det viktigt att kunna korrekt analys mikrotubuli organisation. Här beskriver vi ett robust immunohistological märkning metod för analys mikrotubuli organisation av dendritiska sensoriska arborization neuron dendriter. Förutom färgning sensoriska nervceller, uppnår denna metod robusta immunohistological färgning av luftstrupe, muskler och andra kroppsvävnader vägg.

Vi använder detta protokoll för att undersöka mikrotubuli organisation i u-sensoriska dendriter av DA neuron. Dessa dendriter är mycket känsliga för skada eller stress ^25, och bryta ner snabbt efter början av dissekering ^23. Dissektion bör genomföras i fem minuter eller mindre. Mikrotubuli i luftstrupen och andra kroppsvävnader väggen är mer stabila. Detta protokoll är anpassad från dem som förbereder larver filéer för analys av den neuromuskulära förbindelsen ^14,15, och är optimerad för snabb fixation efter en snabb dissektion.

Vid en analys av dendriter av DA neuron, robust anti-tubulin färgning i överliggande muskler och underliggande epitelceller ²⁶ kan leda till en komplicerad färgningsmönster (figur 1, Movie1). Därför noggrann spårning av dendritiska färgning genom flera seriella sektioner (Movie1) kan krävas för en fullständig analys av mikrotubuli organisation i DA neuron Dendrite berså. Monoklonala antikroppar mot specifika Drosophila homolog av MAP1B, Futsch ^20,21, kan också användas för att märka mikrotubuli cytoskelettet i Drosophila perifera nervsystemet ^5,9,20. Futsch uttrycks bara i nervceller och därmed den producerar en mindre komplicerad färgningsmönstret än α-tubulin (Figur 2). GFP-märkta-endogen-Tau har också använts som en markör av DA neuron dendritiska mikrotubuli ^27. Användning av dessa markörer är effektivt, men det bör noteras att i axonet-ändstationer the neuromuskulära förbindelsen Futsch etiketter specifikt medföljande mikrotubuli ^28. Den exakta rumsliga relationer mellan Futsch, Tau och mikrotubuli i Da dendriter är ännu inte helt beskrivas. I detta protokoll har vi riktat endogena mikrotubuli organisation. Det är också möjligt att märka mikrotubuli med hjälp av överuttryck av GFP taggade Tau eller tubulin. Försiktighet bör vidtas mot inducera oförutsedda fenotyper när överuttryck metoder används ^29.

I våra händer är immunhistokemisk färgning av mikrotubuli i Da nervceller och andra kroppsvävnader vägg bäst när den sekundära antikroppar används för att upptäcka anti-tubulin primära antikroppen är kopplad till en lätt-visualiseras fluoroforen såsom Alexa Fluor 488. Därför när du använder transgena verktyg för att märka DA neuron i samförstånd med anti-tubulin märkning t.ex. via Gal4/UAS systemet, Lexa systemet, eller i MARCM ²³ och MARCM derivat, föredrar vi markör proteiner medur spektral överlappning med denna sekundära, såsom mCD8:: Cherry och mCD8:: KO.