Étiquetage immunohistologique des microtubules dans dendrites des neurones sensoriels, trachées et les muscles dans la Drosophile Mur Corps Larve

1. Préparation des réactifs

Remarques avant de commencer: la dissection et la coloration immunohistochimique sont effectués dans une chambre magnétique et la larve est coincé utilisant des broches insectes de forme spéciale. Des instructions détaillées sur la construction d'une chambre magnétique, et la préparation de ces broches peuvent être trouvés dans les références liées ^14,15. En bref, un trou carré 1x1cm est coupé dans une feuille magnétique et d'une lamelle apposée à l'arrière de la feuille pour faire une petite chambre. Les côtés de la chambre sont scellés avec de la colle époxy, après cette colle a mis la chambre est lavé plusieurs fois avec de l'éthanol à 70% avant l'utilisation. Dissection broches insectes sont préparés par la flexion de la forme requise et ensuite collés sur un onglet ^14,15 métal. Alternativement à une languette métallique, nous avons utilisé une tête plate inversée punaise d'acier avec une poignée faite d'une pointe de coupure jaune. L'utilisation de cet arrangement chambre magnétique permet un contrôle étroit over goupille de positionnement et de tissus d'étirement lors de la dissection.

Pour diriger l'expression du gène rapporteur en différents sous-ensembles de neurones DA enquêteurs peuvent utiliser différents Gal4 lignes (résumé par Shimono et ses collègues ^16). Beaucoup de ces lignes sont disponibles auprès des centres d'actions publiques. Dans ce protocole représentatifs, nous effectuons immunomarquage d'une ligne dans laquelle deux classes contrastantes de DA neurone sont co-marqués: le plus simple de classe I et les plus complexes de classe IV (P10-Gal4 ^17,18, SAMU-mCD8:: Kusabira-Orange (KO)).

1. Préparer Ca ^{+ +} libre HL3.1 salines
   1. En mm: 70 NaCl, KCl 5, 20 _MgCl2, 10 NaHCO _3, HEPES 5, 115 le saccharose, le tréhalose et 5; pH 7,2 ^19. Filtre-stériliser et conserver à 4 ° C. Note: Ca ⁺ solution ⁺ libre empêche la contraction des muscles lors de la dissection.
2. Préparer 2x tampon PHEM
   1. En mm: 130 TUBES, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4; pH 7,0. Filtre-stériliser et conserver à 4 ° C.

      Note: Ces matériaux ne se dissoudra pas jusqu'à ce que le pH des approches 7.0.

3. Préparer le fixateur fraîchement immédiatement avant la fixation.
   1. En vue de préparer une solution de 25ml, d'abord paraformaldéhyde 2g mélanger, 100 ul de NaOH 1 M et de l'eau dans un tube 10ml 50ml Falcon.
   2. Agiter fixatif dans une 55 ° C avec bain d'eau jusqu'à ce shaker la solution est claire. (Le volume total sera d'environ 11,5 ml).
   3. Fixatif refroidir sur glace.
   4. Ajouter 12,5 ml de tampon 2x PHEM.
   5. Ajuster le pH à 7,0 avec HCl 1M.
   6. Remplissez la solution avec de l'eau jusqu'à ce que le volume est de 25ml.
   7. Filtrer la solution en utilisant du papier Whatman.

2. Dissection des larves

Notez avant de commencer: les réseaux de microtubules, et en particulier ceux dans les dendrites sensoriels, se décompose rapidement après l'initiation de la dissection. Achieving dissection rapide en moins de cinq minutes, suivie d'une fixation immédiate sont des facteurs clés dans la réussite de ce protocole.

1. Laver la larve dans l'eau et rapidement les déplacer dans cette chute en utilisant une boucle de cheveux.
2. Orientez le côté jusqu'à la larve dorsale et la face ventrale sur le verre. Note: Cette orientation est d'examiner les neurones pôle ventral. Pour examiner les neurones pôle dorsale, inverser l'orientation.
3. Utilisez le centre d'insectes-broche à broche à l'extrémité antérieure près de la bouche des crochets. Placez la tige près de la fin pour obtenir les meilleurs résultats.
4. Déposer une goutte de sérum physiologique HL3.1 dans la chambre de dissection.
5. Couper la pointe très postérieure de la larve hors d'microciseaux. Remarque: Cette étape ouvre une ouverture à l'extrémité postérieure de la larve qui va permettre l'accès à l'microciseaux (étape 2.7).
6. Grab avec la pince de la région de l'intestin qui est maintenant piquer hors de l'ouverture à l'extrémité postérieure de la larve. Tirez doucement sur le tube digestif tout entier.
7. Placez lela pointe d'une pale de l'microciseaux à travers l'ouverture et coupé le long de la ligne médiane ventrale vers la partie antérieure.
8. En utilisant les broches angle, broches les coins maintenant libre, postérieure d'abord, puis antérieure. Simultanément étirer doucement le filet ouvert larvaire.

3. Fixation, le blocage, la coloration, et le montage de filets larvaires

Remarques avant de commencer: Toutes les étapes de fixation et de coloration sont effectuées dans la chambre de dissection. Pendant ce processus, faites attention de ne pas heurter les broches insectes tenant la larve, car cela pourrait conduire à des lésions tissulaires. Afin d'éviter l'expérience de se dessécher, faire toutes les étapes de coloration dans un petit récipient Tupperware entourées de tissus humidifiés.

1. Aspirer le Ca ^{+ +} libre HL3.1 tampon en utilisant une pointe de jaune. Ajoutez immédiatement le fixateur en utilisant un autre pipetteman.
2. Délicatement la pipette de haut en bas pour mélanger le fixateur avec les traces restantes de Ca ^{+ +} libre HL3.1 tampondans la chambre. Immédiatement l'aspirer et ensuite ajouter fixateur frais dans la chambre.
3. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes.
4. Lavez 10mins 6x dans le PBST (0,1% de Triton X-100 dans du PBS).
5. Bloc avec du sérum de chèvre de 5% en PBST pendant 20 min à température ambiante.
6. Remplacer la solution de blocage avec des anticorps primaire dilué dans du sérum de chèvre de 5% en PBST. Les anticorps primaires utilisés sont de souris anti-α-tubuline (DM1A) et de rat anti-CD8 (5h10) à la fois dilué au 1 / 1000.

   Remarque: L'investigateur peut souhaiter substitut de souris anti-α-tubuline (DM1A) avec souris anti-Futsch (22C10) ^20,21 dilué au 1 / 1000 dans certaines circonstances (voir la discussion).

7. Incuber une nuit (au moins 16h) à 4 ° C.
8. Lavez 10mins 6x dans le PBST.
9. Ajouter une solution d'anticorps secondaire dilué dans du sérum de chèvre de 5% en PBST. Les anticorps secondaires utilisés sont Alexa Fluor 488 de chèvre anti-IgG de souris et Cy3 âne anti-IgG de rat. Conserver l'échantillon couvert pour empêcher fluorophorephoto-décoloration ^22.
10. Incuber soit à température ambiante pendant deux heures ou une nuit à 4 ° C suivie d'une heure à température ambiante.
11. Lavez 10mins 6x dans le PBST.
12. Mettez le filet des larves sur la diapositive cuticule vers le bas, montez dans le glycérol 80%, et sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles pour une «rapide» de montage.
    Note: Pour la compensation des tissus améliorés, et un échantillon permanent stable, monter dans DPX ²³ comme décrit précédemment.

4. Les résultats représentatifs:

Fluorescent coloration a été examiné sous un microscope confocal. Dans les figures 1-2, les différentes branches au sein d'une tonnelle dendrites ont différentes organisation du cytosquelette. La figure 1 montre une région de la tonnelle d'un neurone de classe IV DA à l'étape 1 ^er stade larvaire. La tonnelle entière est marquée par mCD8:: KO et détectés à l'aide d'un anticorps anti-CD8 et secondaire fluorescent (Cy3). La tubuline est détectée à l'aide anti-α-tubuline anticorps et Fluorescent secondaire (Alexa Fluor 488). Les branches principales sont positives pour la tubuline, certaines branches latérales minces sont tubuline-négatif. Film 1 est un ensemble de sections de série grâce à une coloration semblable d'un neurone de classe I DA. La figure 2 montre une région de la tonnelle d'un neurone de classe IV DA colorées avec des anticorps contre le Futsch et CD8 au stade 1 ^er stade larvaire. Les branches principales sont Futsch-positifs, certains branches latérales minces sont Futsch-négatif. Figure 3. Trachées dans la paroi du corps larvaire montrent une organisation des microtubules complexes. Films 2 et 3 montrent des coupes en série de la coloration grâce muscles de la paroi du corps et de la trachée.

Figure 1. Fig. 1 montre une région de la tonnelle d'un neurone de classe IV DA à l'étape 1 ^er stade larvaire. La tonnelle entière est marquée par mCD8:: KO et détectés à l'aide d'anticorps anti-CD8 et secondaire fluorescent (Cy3). La tubuline est détecté utilisant des anticorps anti-&-tubulid'anticorps fluorescents n et secondaire (Alexa 488). Panneaux AC séquentielle confocale z-sections (0.5μm), C'-C ", la coloration seul anticorps à partir du panneau C. Exemple de branches avec (flèche jaune) ou sans (violet pointe de flèche) microtubules sont mis en surbrillance. Red microtubules pointes de flèches en évidence dans le sous-jacentes les cellules épithéliales.

Figure 2. Fig. 2 montre une région similaire de la tonnelle d'un neurone de classe IV da colorées avec des anticorps contre le Futsch et CD8 au stade 1 ^er stade larvaire. La tonnelle entière est marquée par mCD8:: KO et détectés à l'aide d'anticorps anti-CD8 et secondaire fluorescent (Cy3). Futsch est détecté à l'aide d'anticorps anti-Futsch et secondaire fluorescent (Alexa 488). Les branches principales sont Futsch-positifs, certains branches latérales minces sont Futsch-négatif. Exemple de branches avec (flèche jaune) ou sans (violet pointe de flèche) Futsch sont mis en évidence.

Figure 3. Trachée teinté en utilisant le protocole anti-tubuline décrit ci-dessus. Cette larve est le troisième stade larvaire et disséqués, comme décrit précédemment ^23,24. Movie 3 montre élargie des sections en série à partir du champ marqué par un carré.

Sections Film 1. Serial traçage coloration tubuline travers la tonnelle dendritiques d'un neurone de classe I. La tonnelle entière est marquée par mCD8:: KO (Magenta) et détectés à l'aide d'anticorps anti-CD8 et secondaire fluorescent (Cy3). Tubuline (vert) est détecté en utilisant un anticorps anti-α-tubuline et secondaire fluorescent (Alexa Fluor 488). Échelle: d'un côté de l'image vidéo correspond à 46.88μm dans la section. Cliquez ici pour voir le film.

Film 2 sections. Serial traçage coloration tubuline en DBOY muscles de la paroi d'une larve de troisième stade larvaire. La tubuline est détectée à l'aide anti-α-tubuline anticorps et secondaire fluorescent (Alexa Fluor 488). Échelle: d'un côté de l'image vidéo correspond à 46.88μm dans la section. Cliquez ici pour voir le film.

Movie 3. Sections de série traçage coloration tubuline dans un corps mur trachée d'une larve de troisième stade larvaire, marquée d'un carré dans Figure.3. La tubuline est détectée à l'aide anti-α-tubuline anticorps et secondaire fluorescent (Alexa Fluor 488). Échelle: d'un côté de l'image vidéo correspond à 46.88μm dans la section. Cliquez ici pour voir le film.

Pour comprendre comment des formes complexes cellulaires sont qu'elle atteint est important d'être en mesure de précision de dosage organisation des microtubules. Nous décrivons ici une méthode de marquage robuste immunohistologiques à l'organisation des microtubules dendritiques dosage des dendrites des neurones sensoriels arborisation. En plus de coloration des neurones sensoriels, cette méthode permet d'obtenir robustes coloration immunohistochimique de la trachée, muscles et autres tissus de la paroi du corps.

Nous utilisons ce protocole d'examiner l'organisation des microtubules dans les dendrites des neurones sensoriels de développement DA. Ces dendrites sont très sensibles aux blessures ou au stress ^25, et se décomposent rapidement après le début de la dissection de ^23. Dissection doit être réalisée en cinq minutes ou moins. Les microtubules dans la trachée et les autres tissus de la paroi du corps sont plus stables. Ce protocole est adapté de préparer les filets de ceux utilisés pour l'analyse des larves de l'jonction neuromusculaire ^14,15, et est optimisé pour f rapidesixation après une dissection rapide.

Lorsque l'on analyse les dendrites des neurones DA, robuste anti-tubuline coloration dans le muscle sus-jacente, et les cellules épithéliales sous-jacentes ²⁶ peut conduire à un motif de coloration compliquées (figure 1, Cinéma1). Par conséquent prudents traçage des taches dendritiques à travers plusieurs sections en série (Cinéma1) peut être nécessaire pour une analyse complète de l'organisation des microtubules dans la tonnelle DA neurone dendrites. Les anticorps monoclonaux spécifiques pour l'homologue drosophile de MAP1B, Futsch ^20,21, peut également être utilisé pour étiqueter le cytosquelette de microtubules dans le système périphérique nerveux chez la drosophile ^5,9,20. Futsch est exprimé uniquement dans les neurones et donc il produit un motif de coloration moins compliqué que α-tubuline (figure 2). GFP-tagged-endogènes-Tau a également été utilisé comme marqueur de l'dendritiques DA neurone microtubules ^27. L'utilisation de ces marqueurs est efficace, mais il convient de noter que dans l'axone-terminales de ee jonction neuromusculaire Futsch étiquettes spécialement regroupés microtubules ^28. Les relations spatiales entre Futsch exacte, Tau, et les microtubules dans les dendrites DA ne sont pas encore complètement caractérisés. Dans ce protocole, nous avons abordé l'organisation des microtubules endogène. Il est également possible de microtubules étiquette en utilisant la surexpression de Tau GFP étiqueté ou la tubuline. Des précautions doivent être prises contre induisant phénotypes inattendus lorsque les approches sont utilisées surexpression ^29.

Dans nos mains, la coloration immunohistochimique des microtubules dans les neurones DA et d'autres tissus de la paroi du corps est mieux réalisée lorsque les anticorps secondaires utilisés pour détecter les anticorps anti-tubuline primaire est couplé à un fluorophore facilement visualisés comme Alexa Fluor 488. Ainsi lors de l'utilisation des outils transgéniques pour étiqueter les neurones DA de concert avec des anti-tubuline, par exemple via le système d'étiquetage Gal4/UAS, système LexA, ou dans MARCM ²³ et MARCM dérivés, nous préférons protéines marqueurs avechors chevauchement spectral avec cette secondaires, tels que mCD8:: Cherry et mCD8:: KO.