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 JoVE Clinical and Translational Medicine

人乳内动脉（IMA）移植及内支架置入术：人体模型支架内再狭窄的研究开发

1,2, 1,2, 3, 3, 4, 4, 5, 5, 6, 1,2, 7, 1,2,7

1University Heart Center Hamburg, TSI-Lab, Germany, 2Cardiovascular Research Center, University of Hamburg, 3Department of Medicine, Cardiology Division, Pulmonary Hypertension Program, University of Alberta, 4Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 5Department of Biomedical Sciences, Institute of Physiology, Pathophysiology, and Biophysics, University of Veterinary Medicine, Vienna, 6Translumina GmbH, Hechingen, 7Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University School of Medicine

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Cite this Article: 人乳内动脉（IMA）移植及内支架置入术：人体模型支架内再狭窄的研究开发

Hua, X., Deuse, T., Michelakis, E. D., Haromy, A., Tsao, P. S., Maegdefessel, L., et al. Human Internal Mammary Artery (IMA) Transplantation and Stenting: A Human Model to Study the Development of In-Stent Restenosis. J. Vis. Exp. (63), e3663, doi:10.3791/3663 (2012).

Abstract: 人乳内动脉（IMA）移植及内支架置入术：人体模型支架内再狭窄的研究开发

体内研究模型的临床前研究后内膜增生的血管内支架置入术的发展中的病理生物学和病理生理过程转化为1,2的方法是至关重要的。

常用的动物模型包括小鼠，大鼠，兔，猪3-5。然而，进入临床的设置，这些模型的翻译仍然困难，因为这些生物的进程已经开始研究在动物血管，但以前从未在人类研究模型6,7。在这部影片中，我们展示了一个新的人性化的模型，以克服这种转化的差距。所示的过程，重现性好，操作方便，快速执行，并适合学习内膜增生的发展和多样化支架的适用性。

该视频演示了如何执行，通过移植到免疫缺陷大鼠的血管支架技术，标识作为人类的起源细胞增殖。

Protocol: 人乳内动脉（IMA）移植及内支架置入术：人体模型支架内再狭窄的研究开发

1。乳内动脉（IMA）准备

  1. 动脉内皮剥脱2法国福格蒂动脉取栓导管（百特医疗用品，迪尔菲尔德，IL，USA）的通过。拉导管贯穿整个船舶长度的两倍，以确保内皮损伤。
  2. 使用的长度为8mm和2.5毫米，直径3毫米（如Translumina，育空支架）的任何人的支架。注意：支架的直径应不超过10％以上的血管直径，以避免前，后支架狭窄。注意：请不要在同一研究中切换支架的长度。
  3. 使用合适的球囊压力（这是在支架上包说明），以达到所需的直径部署支架。
  4. 商店植入支架在4°C间的RPMI +肝素（500 IE/10毫升）上冰，直到移植IMA。

2。动物的制备

是侯，RNU裸体（CRL：NIH-Foxn1rnu）大鼠（300-350克）SED在scantainer常规条件下柜，标准大鼠饲料喂养和蒸压水广告libidum的的通风。

  1. 异氟醚麻醉大鼠（2.5-3％），使用的是感应室。
  2. 剃腹毛，放置老鼠在它的后面，将超过它的鼻子和嘴，以保持麻醉面罩。
  3. 消毒腹部地区广泛使用普罗沃碘，下次使用80％乙醇 - 重复此步骤两次。检查捏的后腿，要确保足够的麻醉大鼠的反射。
  4. 在微观角度，执行上的中位数开腹暴露腹主动脉。
  5. 将生理盐水滋润手套肠子。折叠肠子周围的手套，以防止水分流失。
  6. 主动脉解剖，从下腹地区分叉，不小心引起​​血管的分支损伤。
  7. 使用微观夹阻止主动脉的血流量。放置近端钳第一，其次是远端钳。
  8. 删除一个应用程序。 0.5-0.7毫米的主动脉段和冲洗余下的主动脉与肝素（200单位）。
  9. 采取的支架IMA和缩短到足够的长度和定位差距。
  10. IMA的连接到收件人主动脉，运行缝合使用8-0普理灵缝线（爱惜康，Norderstedt的，德国）。
  11. 小心地打开第一颅钳，然后尾钳。
  12. 应该有移植IMA与主动脉远端可见脉冲。
  13. 将肠子放回腹部。
  14. 预热的无菌生理盐水冲洗腹部。
  15. 关闭腹部墙上使用6-0普理灵缝线（爱惜康，Norderstedt的，德国）的肌肉层。
  16. 虽然仍然是在麻醉大鼠皮下注射，注射4-5毫克/公斤卡洛芬。
  17. 3天后外科手术后的镇痛管理适当（如卡洛芬或美洛昔康）红霉素。

3。代表结果

组织学标本固定在4％福尔马林，在酒精梯度脱水，1％干燥过氧化苯甲酰的80％和20％的甲基丙烯酸甲酯，邻苯二甲酸二丁酯为1天，我甲基丙烯酸甲酯的混合物（甲基丙烯酸甲酯一）渗透1天，和甲基丙烯酸甲酯我干3％的过氧化苯甲酰（三甲基丙烯酸甲酯）为1-2天，在4°C。此后，标本第三新鲜的甲基丙烯酸甲酯聚合在水浴上预聚合基地的玻璃小瓶。缓慢聚合取得小瓶保持在26°C过夜，提高温度至28°C的第二天早上，然后逐渐增加0.5°C，超过12小时的温度，直到聚合发生。聚合块切片在5微米厚度使用MICROM HM 360切片机，配备的钨硬质合金刀。

以确定细胞增殖的起源（图1），幻灯片staine确定绿色荧光蛋白（GFP）或鼠抗体ðMHC-Ⅰ和人类平滑肌细胞。对于这些研究，人类的IMA记者基因GFP过夜使用稳定的IMA细胞传导的慢病毒颗粒的培养。从人类起源的女儿细胞分裂可以识别表达GFP。经过deparaffinization，热诱导抗原检索进行加热的幻灯片，在抗原检索解决方案使用一个蒸笼。图像FX信号增强器可用于阻断步骤。人类起源的细胞确定对绿色荧光蛋白（在1:100稀释的一抗稀释液（DAKO））的小鼠单克隆抗体，并进一步的Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG（1:1000稀释在二次抗体稀释剂标记）。平滑肌细胞标记兔polycolonal抗平滑肌α-肌动蛋白（初级抗体稀释液稀释1:100），羊抗兔IgG的Alexa Fluor 555（1:1000 DIL在二次抗体稀释剂uted）。每个抗体孵育步骤进行1小时3次PBS洗涤之间，在37°C。细胞核用DAPI染色10分钟。安装使用延长黄金抗淬灭试剂幻灯片后，利用激光共聚焦显微镜样品进行了分析。

图1
图1。作为人类平滑肌细胞内膜细胞。A：绿色=抗GFP的标记人类起源的细胞;红色=抗人平滑肌细胞肌动蛋白，蓝色的DAPI，确定细胞核乙 ：绿色=抗大鼠的MHC-Ⅰ，贴标鼠源细胞;红色=抗人平滑肌细胞肌动蛋白，蓝色的DAPI，确定细胞的细胞核。被确定为平滑肌细胞和GFP阳性细胞增殖，但负鼠MHC-Ⅰ分子。因此，细胞增殖是人类的起源。

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Discussion: 人乳内动脉（IMA）移植及内支架置入术：人体模型支架内再狭窄的研究开发

虽然在体内研究模型不同的是现有的调查支架植入后内膜增生的发展，这些车型仍然面临着转化的障碍需要克服。此外，大量的动物模型是昂贵和特殊的住房条件以及手术设备是不是所有实验室。

使用人类的IMA研究人类的内膜增生及支架内再狭窄的发展进行了研究之前， 当然在器官培养8,9 原位 。新的人性化的IMA模型构成了翻译的办法来解决支架再狭窄的问题， 在体内植入人类免疫缺陷大鼠腹主动脉位置的IMA。人类的IMA对大鼠腹主动脉的大小是一个完美的匹配。因此，我们提出的模型，重现性好，容易和快速执行，并不需要特殊的手术训练，并价格低廉。

作为人类平滑肌细胞内膜细胞的鉴定关闭临床设置和平移的差距显示的机会，探讨在人体内的病理生理过程。

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Disclosures: 人乳内动脉（IMA）移植及内支架置入术：人体模型支架内再狭窄的研究开发

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements: 人乳内动脉（IMA）移植及内支架置入术：人体模型支架内再狭窄的研究开发

作者感谢她的贡献：克里斯蒂安Pahrmann。特别感谢爱惜康，Norderstedt的，汉堡（德国）提供的缝合材料。

资金

宋佳Schrepfer已收到来自德意志研究联合会（DFG）（SCHR992 / 3 1 SCHR992/4-1）研究补助金。这项工作是由ISHLT沙姆韦事业发展基金2010年和福尔克研究经费（斯坦福大学）的支持。

Materials: 人乳内动脉（IMA）移植及内支架置入术：人体模型支架内再狭窄的研究开发

Name Company Catalog Number Comments
2 French Fogarty catheter Baxter Internationl Inc. 120602F
Yukon Stent Translumina GmbH, Hechingen, Germany Use the stent of your choice according to your study protocol
RPMI media Biochrom AG Nr.F1275
heparin Baxter Internationl Inc. 2B0953
isoflurane Abbott Laboratories B506
Provo-Iodine Betadine Puredue Pharma EAN:5995327165830
80% ethanol Geyer ETV 80/0500
Micro clamp Harvard Apparatus PY2-61-0186
Sutures 8-0 Johnson & Johnson 2808G
Sutures 6-0 Johnson & Johnson 1698 H
Carprofen Feizer Vet PZN:0110208
Metamizol Ratiopharm
Target retrieval solution, pH9 Dako S2368
Image-iT FX signal enhancer Invitrogen I36933
mouse monoclonal anti-GFP antibody BD Biosciences 632381
primary antibody diluent Dako S3022
goat-anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11017
secondary antibody diluent Dako S0809
rabbit polycolonal anti-smooth muscle α-actin Abcam ab5694
goat-anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21430
Prolong Gold antifade reagent Invitrogen P36930

References: 人乳内动脉（IMA）移植及内支架置入术：人体模型支架内再狭窄的研究开发

  1. Deuse, T., Ikeno, F., Robbins, R.C., & Schrepfer, S. Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model. J. Vis. Exp. (31), e1346, DOI: 10.3791/1346 (2009).
  2. Oyamada, S., et al. Trans-iliac rat aorta stenting: a novel high throughput preclinical stent model for restenosis and thrombosis. J. Surg. Res. 166, e91-95, doi:10.1016/j.jss.2010.11.882 (2011).
  3. Chamberlain, J., et al. A novel mouse model of in situ stenting. Cardiovascular research. 85, 38-44, doi:10.1093/cvr/cvp262 (2010).
  4. Deuse, T., et al. Introducing the first polymer-free leflunomide eluting stent. Atherosclerosis. 200, 126-134, doi:10.1016/j.atherosclerosis.2007.12.055 (2008).
  5. Finn, A.V., et al. Differential healing after sirolimus, paclitaxel, and bare metal stent placement in combination with peroxisome proliferator-activator receptor gamma agonists: requirement for mTOR/Akt2 in PPARgamma activation. Circulation research. 105, 1003-1012, doi:10.1161/CIRCRESAHA.109.200519 (2009).
  6. Tellez, A., et al. Coronary bare metal stent implantation in homozygous LDL receptor deficient swine induces a neointimal formation pattern similar to humans. Atherosclerosis. 213, 518-524, doi:10.1016/j.atherosclerosis.2010.09.021 (2010).
  7. Suzuki, Y., Yeung, A.C., & Ikeno, F. The pre-clinical animal model in the translational research of interventional cardiology. JACC Cardiovasc. Interv. 2, 373-383, doi:10.1016/j.jcin.2009.03.004 (2009).
  8. Holt, C.M., et al. Intimal proliferation in an organ culture of human internal mammary artery. Cardiovascular research. 26, 1189-1194 (1992).
  9. Swanson, N., Javed, Q., Hogrefe, K., & Gershlick, A. Human internal mammary artery organ culture model of coronary stenting: a novel investigation of smooth muscle cell response to drug-eluting stents. Clin. Sci. (Lond). 103, 347-353 (2002).

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