Umano arteria mammaria interna (IMA) Trapianti e Stenting: un modello umano per studiare lo sviluppo della ristenosi in-stent

1. Arteria mammaria interna (IMA) Preparazione

1. L'endotelio arteriosa è denudato dal passaggio di un 2-francese catetere di Fogarty embolectomia arteriosa (Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA). Il catetere viene tirato attraverso la lunghezza intera imbarcazione due volte per assicurare danno endoteliale.
2. Utilizzare qualsiasi stent umano 8 millimetri di lunghezza e 2,5 mm-3 mm di diametro (ad esempio Translumina, Yukon stent). ATTENZIONE: Il diametro dello stent non deve superare il diametro del vaso di oltre il 10% per evitare stenosi pre-e post-stent. ATTENZIONE: Non accendere la lunghezza dello stent all'interno dello stesso studio.
3. Distribuire la stent utilizzando la pressione appropriata palloncino (che è notato sul pacchetto stent) per ottenere il diametro desiderato.
4. Conservare stent IMA in 4 ° C RPMI + eparina (500 IE/10 ml) in ghiaccio fino al trapianto.

2. Preparazione degli animali

RNU Nude (Crl: NIH-Foxn1rnu) ratti (300-350 g) sono HOUsed in condizioni convenzionali in scantainer armadi ventilati, alimentato standard di ratto chow e autoclavato libidum ad acqua.

1. Anestetizzare ratto con isoflurano (2,5-3%) con una camera di induzione.
2. Radersi i capelli addominale e mettere il topo sul dorso e piazzare una maschera sul suo naso e bocca per mantenere l'anestesia.
3. Disinfettare la zona addominale ampiamente la diffusione tramite Provo-iodio, prossimo utilizzo 80% etanolo - ripetere questa operazione due volte. Controllare riflessi pizzicare i piedi posteriori per essere sicuri che il ratto è sufficiente anestetizzato.
4. In vista microscopico, eseguire una laparotomia mediana superiore per esporre l'aorta addominale sottorenale.
5. Mettere l'intestino in un guanto salina idratata. Piegare il guanto intorno gli intestini per evitare la perdita di umidità.
6. Staccare l'aorta dalla regione infrarenale alla biforcazione, con attenzione per non causare danni ai rami dei vasi.
7. Usare i morsetti micro per fermare il flusso aortico sangue. Posizionare ilmorsetto prossimale primo, seguito dal morsetto distale.
8. Rimozione di un app. 0,5-0,7 millimetri segmento di aorta e lavare l'aorta rimanente con eparina (200 unità).
9. Prendere la IMA stent e accorciare alla lunghezza adeguata e posizionarlo nello spazio.
10. Collegare l'IMA all'aorta destinatario, eseguendo con suture 8-0 prolene sutura (Ethicon, Norderstedt, Germania).
11. Aprire con cautela il primo morsetto cranica e poi il morsetto caudale.
12. Dovrebbe esserci un impulso visibile nella trapiantato IMA e all'estremità distale della aorta.
13. Posizionare gli intestini nuovamente dentro l'addome.
14. Lavare l'addome con pre-riscaldata soluzione salina sterile.
15. Chiudere lo strato muscolare della parete addominale con 6-0 punti di sutura Prolene esecuzione (Ethicon, Norderstedt, Germania).
16. Mentre il ratto è ancora in anestesia, iniettare 4-5 mg / kg per via sottocutanea Carprofen.
17. Amministrare analgesia post-chirurgica a seconda dei casi (ad esempio Carprofen o Meloxicam) per 3 giorni dopo Surgery.

3. Risultati rappresentativi

Per l'istologia, i campioni sono stati fissati in formalina 4%, disidratati in una serie graduata di alcol, e infiltrati in una miscela (MMA I) del 80% e 20% metilmetacrilato dibutilftalato per 1 giorno, MMA I con 1% di perossido di benzoile per secco 1 giorno, e MMA io con 3% di perossido di benzoile secco (MMA III) per 1-2 giorni a 4 ° C. Successivamente, i campioni sono stati polimerizzati in fresco MMA III in fiale di vetro in un bagno di acqua su un pre-polimerizzato base. Polimerizzazione lenta è stato raggiunto mantenendo le fiale a 26 ° C per una notte, aumentando la temperatura a 28 ° C la mattina successiva, e poi aumentare gradualmente la temperatura di 0,5 ° C per 12 h fino a polimerizzazione avvenuta. I blocchi polimerizzate sono stati sezionati a 5 um di spessore con un microtomo microM HM 360 dotato di un coltello carburo di tungsteno.

Per identificare l'origine delle cellule in proliferazione (figura 1), slides sono state colorate con anticorpi che identificano sia la proteina fluorescente verde ratto (GFP) o MHC-I e cellule muscolari lisce. Per questi studi, IMA umana è stato incubato con il gene reporter GFP ore, usando particelle lentivirali per la trasduzione di cellule IMA stabile. Cellule figlie Divisione di origine umana potrebbe essere identificato esprimendo GFP. Dopo deparaffinizzazione, indotta dal calore epitopo recupero viene eseguito riscaldando i vetrini in una soluzione di antigene recupero utilizzando un piroscafo. La Image-iT FX segnale enhancer può essere usato per la fase di blocco. Le cellule di origine umana sono identificati con gli anticorpi monoclonali murini contro la GFP (diluito 1:100 nel diluente dell'anticorpo primario (Dako)), e ulteriormente marcato con capra anti-IgG di topo, Alexa Fluor 488 (1:1000 diluito in diluente anticorpo secondario ). Le cellule muscolari lisce sono state contrassegnate con il polycolonal coniglio anti-muscolo liscio α-actina (1:100 diluito nel diluente anticorpo primario), seguita da capra-anti-IgG di coniglio, Alexa Fluor 555 (1:1000 diluito in diluenti anticorpo secondario). Ogni passaggio di incubazione anticorpo viene effettuata a 37 ° C per 1 ora con tre volte in PBS tra lavaggio. I nuclei sono colorati con DAPI per 10 minuti. Dopo il montaggio delle diapositive utilizzando Prolungare reagente oro antifade, i campioni sono stati analizzati usando la microscopia confocale.

Figura 1. Le cellule neointimale le cellule muscolari lisce A:. Verde = anti GFP, l'etichettatura, le cellule di origine umana, rosso = anti umane actina delle cellule muscolari lisce, blu = DAPI, individuando nuclei delle cellule B: Verde = anti ratto MHC-I, l'etichettatura cellule di origine ratto, rosso = anti umane actina delle cellule muscolari lisce, blu = DAPI, individuando nuclei delle cellule. Cellule in proliferazione sono identificate come cellule muscolari lisce e positive per GFP, ma negativo per la molecola MHC-I di ratto. Pertanto, le cellule proliferanti sono origine umana.

Sebbene in diversi modelli di ricerca in vivo esistenti per indagare lo sviluppo di iperplasia intimale dopo il posizionamento dello stent, questi modelli ancora affrontando ostacoli traduzionali da superare. Inoltre, i modelli animali di grandi dimensioni sono condizioni abitative costosi e speciali, nonché attrezzature chirurgiche non è disponibile per tutti i laboratori.

Utilizzo di un IMA umano per studiare lo sviluppo delle risorse umane proliferazione intimale e la ristenosi in-stent è stata studiata prima di conservazione ex situ in colture d'organo ^8,9. Il nuovo modello umanizzato IMA costituisce un approccio traslazionale per affrontare la questione delle stent restenosi in vivo, mediante l'impianto della IMA umana nella posizione dell'aorta addominale di topi immunodeficienti. Umano IMA sono un fiammifero perfetto per la dimensione della aorta addominale di topi. Pertanto, il modello presentato è riproducibile, facile e rapida da eseguire, non richiede particolari formazione chirurgica, eeconomico.

L'identificazione delle cellule della neointima come cellule muscolari lisce chiude lo spazio traslazionale di impostazioni cliniche e mostra la possibilità di indagare processi patofisiologici umani in vivo.