الاستقراء من احتشاء عضلة القلب في الزرد الكبار باستخدام Cryoinjury

Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury. J. Vis. Exp. (62), e3666, doi:10.3791/3666 (2012).

قلب الثدييات غير قادرة على تجديد كبير اثر اصابة الحادة مثل احتشاء عضلة القلب ^1. على النقيض من ذلك، urodele البرمائيات والأسماك مكتملة العظام الاحتفاظ قدرة فائقة على التجدد القلب مع القليل أو لا تندب طوال حياته ^2،3. ومن غير المعروف لماذا فقط بعض الفقاريات غير الثدييات يمكن إعادة جهاز كامل من بقايا أنسجة ^4،5. فهم الفروق الجزيئي والخلوي بين استجابات التجدد في مختلف الأنواع، ونحن في حاجة إلى استخدام نهج مماثل لإحداث الإصابات الحادة.

في الثدييات، لقد كان النموذج الأكثر استخداما لدراسة إصلاح القلب نقص تروية حاد بعد عملية ربط الشريان التاجي أو تدمير الأنسجة بعد cryoinjury ^6،7. وقد تم تجديد القلب في سمندل الماء والزرد درس في الغالب بعد استئصال جزئي للقمة البطين ^2،3. في الآونة الأخيرة، عدة مجموعات لديها أنشأناished تقنية cryoinjury في ^8-10 الزرد الكبار. هذا الأسلوب لديها امكانات كبيرة لأنه يسمح للمناقشة النسبية للنتائج التي تم الحصول عليها من أنواع الثدييات وغير الثدييات.

هنا، نقدم طريقة للحث على استنساخه على شكل قرص احتشاء البطين الزرد بواسطة cryoinjury. ويستند هذا النموذج على إصابة الأنسجة تجميد لاذابة سريع، مما يؤدي الى موت الخلايا هائلة من حوالي 20٪ من العضلية للجدار البطين. أولا، قدم من خلال شق صغير في الصدر مع مقص قطع القزحية للوصول إلى القلب. تم تجميده مباشرة جدار البطين من قبل التقدم بطلب للحصول 23-25 ​​ثوان مسبار بالبرد الفولاذ المقاوم للصدأ precooled في النيتروجين السائل. لوقف تجميد أسماك المياه القلب، في درجة حرارة الغرفة والتي ألقيت على غيض من مسبار بالبرد. لأنه يتحمل جيدا الإجراء من قبل الحيوانات، مع معدل البقاء على قيد الحياة من 95٪.

لوصف عملية التجدد، وكانت قلوبجمعها وثابتة في أيام مختلفة بعد cryoinjury. بعد ذلك، كانت جزءا لا يتجزأ من العينة لcryosectioning. تم تجهيز الشرائح مع أقسام للتحليل النسيجي، في التهجين الموضع والمناعي. هذا المشروع يعزز فهمنا للعوامل التي مطلوبة من أجل اللدونة التجدد في الزرد، وتقديم رؤى جديدة في آلية تجديد القلب. وهناك فهم المفاهيم والجزيئي للتجديد في قلب الزرد تؤثر على حد سواء البيولوجيا التطورية والطب التجديدي.

1. معدات انشاء

1. الأداة الرئيسية المستخدمة لأداء cryoinjury هو مسبار بالبرد، وأداة القلم مثل هذا مصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ (الشكل 1A). مقبض أسطواني هو 40 ملم طويلة والتي يبلغ قطرها 8 ملم. غيض من قضيب هو 6 مم و 0.8 مم من القطر. مفترق الطرق بين طرف والتعامل مع غير مخروطي الشكل 4 مم طويل. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون معزولة مقبض مسبار بالبرد مع أنبوب من البلاستيك وشريط لتجنب قضمة الصقيع والأصابع في حين الضغط على أداة أثناء العملية.
2. غيرها من المواد التي يحتاجها لجراحة قرية هي stereomicroscope، ملقط حاد، ربيع الصغير مقص تشريح وماصة نقل من البلاستيك. وبالإضافة إلى ذلك إعداد كوب من أجل التخدير السمك وملعقة بلاستيكية لنقل الأسماك.
3. خلال عملية جراحية، يتم وضع الأسماك على اسفنجة رطبة مع ما يصل به الجانب البطني (الشكل 1B). لعقد هذا الحيوان في إجراء مستقر، وهووينبغي أخدود مناسب قطع يدويا في الاسفنج.
4. يعد خزان المياه مع نظام لنقل الأسماك بعد الجراحة.
5. إنشاء جهاز توقيت مزدوج الأولى مع العد التنازلي في الثانية (10) وبعد ذلك تلقائيا العد التنازلي 24 ثانية.

2. وCryoinjury الداخلي

1. تهدئة مسبار بالبرد بغمر طرف في 3-5 سم من النيتروجين السائل لا يقل عن 3 دقائق.
2. تخدير 1 الزرد الكبار بحلول immerging في tricaine 0.02٪ حتى السمك تتحول على ظهرها ولها خياشيم توقف تقريبا المتحركة (حوالي 90 ثانية).
3. نقل السمك مع ملعقة من البلاستيك لاسفنجة رطبة أنه قد تم قطع لعقد السمك رأسا على عقب (الشكل 1B). عقد السمك ثابت مع ملقط استخدام المنظمات غير المهيمنة اليد. تحديد موقع بصريا الهامش الخلفي وسطي للقلب واستخدام مقص قطع القزحية مباشرة الى ثقب الجلد. (الشكل 1C).
4. جعل صغيرة (حوالي 2 مم) شق فوق القلب بواسطة مكعبtting الأمامية مباشرة من خلال الجلد والعضلات (1D الشكل). لا قطع طريق جهاز للخيشومي عظمي، حيث سيؤدي ذلك إلى قتل الحيوان.
5. المسيل للدموع بلطف طبقة فضي الظهارية من اللحمة (الشكل 1E) مع غيض من مقص لديها وصول مباشر إلى البطين الضرب. لا تدخل مقص أعمق في تجويف الجسم، وهذه الإرادة ثقب في القلب. وينبغي أن القلب النابض تكون مرئية بشكل جيد، وعدم وجود نزيف واسع وينبغي أن تحدث خلال بضع الصدر (الشكل 1F).
6. بدء موقت المبرمج الذي تم تعيينه لمدة 10 ثانية يليه 24 ثانية. خلال 10 ثانية إخراج مسبار بالبرد من النيتروجين السائل. تأكد من أنه لا يوجد أكثر النيتروجين على مسبار بالبرد عن طريق هز برفق. نشر شق باستخدام ملقط جانبيا لفتح الصدر (الشكل 1F).
7. مرة واحدة في توقيت الحلقات 10 ثانية، ولمس على الفور لكن بلطف البطين مع غيض من العلاقات العامةه المبردة مسبار بالبرد (الشكل 1G).
8. مرة واحدة في حلقات توقيت 24 ثانية، صب 2-3 مل من الماء باستخدام نظام ماصة بلاستيكية على الصدر لاطلاق سراح مسبار بالبرد من الأنسجة، ونقل الأسماك إلى خزان ماء مع النظام.
9. وينبغي للأسماك إعادة التنفس بعد بضع ثوان، ومن ثم فإنه ينبغي أن تستأنف السباحة. إذا لم تتنفس بعد حوالي 45 ثانية، وحفز هذا الحيوان من خلال دفق الماء في الخياشيم مع ماصة بلاستيكية حتى يبدأ في التنفس من تلقاء نفسه. في تجربتنا، 95٪ من الأسماك البقاء على قيد الحياة لعملية جراحية، وجميع الوفيات تحدث في يوم من عملية جراحية. فإنه لن يكون من الضروري خياطة الجروح.

3. مجموعة القلب والتثبيت

1. إعداد 1 مل من 2٪ من الفورمالين في أنبوب microcentrifuge لإصلاح القلب، وملقط 2، مقص الدقيقة تشريح وباسفنجة رطبة فترة زمنية محددة.
2. في اليوم المحدد بعد cryoinjury، الموت ببطء السمك في tricaine 0.1٪ لمدة 5 دقائق.
3. ضعسمك الجانب بطني تصل إلى اسفنجة رطبة، وفترة زمنية محددة. تقدم كبير (حوالي 4 ملم) شق فوق القلب من خلال غضروف خيشومي مع مقص الجزئي تشريح. فتح على نطاق واسع شق بالملقط (الشكل 1H).
4. قرصة قبالة بصلة شريانية، بنية بيضاء الأمامي إلى البطين (الشكل 1 مرحبا)، وإزالة القلب من تجويف بسحبه. ويرد في قلب كل تشريح 1J الشكل والشكل 2A.
5. وضع ما يصل إلى 3 قلوب في أنبوب microcentrifuge مع 1 مل من 2٪ من الفورمالين. بدوره بلطف الأنبوب عدة مرات، ويبقيه بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

4. قلب تركيب

1. شطف قلوب في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. نقل نفوس الى 10 مل من السكروز 30٪ أنه ينبغي مسبقا تبريده في 4 درجات مئوية، وتخلط بلطف. وينبغي أن العينة تطفو على السطح في البداية من حل السكروز. تستمر الحضانة لمدة 1 ساعة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية. بعدهذه المرة، فإن قلوب تنزل الى قاع الأنبوب.
2. إعداد مربع مع الثلج الجاف. تأخذ قالب التضمين، وتصب طبقة المتوسطة من 5 مم أكتوبر المتزايدة في الجزء السفلي من العفن.
3. بالملقط وضع القلب في تي OC تصاعد المتوسطة في قالب. تحت stereomicroscope، وضبط اتجاه عينة لتحقيق قمة البطين على الجزء السفلي من القالب، والشريانية بصلة نحو الأعلى.
4. وضع قوالب مع عينة على الثلج الجاف. عندما يبدأ المتوسطة المتزايدة لتجميد، ملء ما تبقى من العفن مع متوسط ​​أكتوبر والسماح لها تجمد تماما. الحفاظ على القالب لمدة لا تقل عن 1 في ح -80 درجة مئوية قبل باجتزاء. ويمكن تخزين العينات المجمدة لعدة شهور في -80 درجة مئوية.

5. قلوب باجتزاء

1. انشاء ناظم البرد مع حجم القطع من 16 ميكرون، ودرجة حرارة الغرفة -24 درجة مئوية ودرجة حرارة العينة في -22 درجة مئوية.
2. وضع كتلة المجمدة مععينة في ناظم البرد وتحديد توجهها للبدء في خفض مواز في الجزء السفلي من الكتلة.
3. إعداد ست Superfrost زائد شرائح في كتلة واحدة والكتابة والحساب عليها من 1 الى 6. بدء خفض حتى يتم الوصول إلى الأنسجة، وتقليم كتلة حول العينة مع razorblade.
4. للحصول على 6 نسخ مكررة من قلب واحد، تناول القسم الأول على الشريحة 1، والقسم الثاني على الشريحة 2، والثالث على الشريحة 3، وما إلى ذلك مرة واحدة كنت قد وضعت في القسم السادس على الشريحة 6، مع إعادة تشغيل الشريحة (1) وتستمر حتى يتم قطع الجهاز كله. جمع صفين من حوالي 8 أقسام على الشريحة (الشكل 3).
5. السماح للشرائح جاف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تخزينها لمدة تصل إلى 1 سنة في صناديق مغلقة بإحكام عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.

6. ممثل النتائج

ويرد إصابة القلب ممثل بعد هذا البروتوكول في قلوب كل تشريح في 4 DPCI (cryoinjury آخر أيام؛ الشكل 2D-F). إلى الخامسكنا isualize النسيج عضلة القلب في الجسم الحي، والأسماك المعدلة وراثيا، ومعربا عن EGFP DsRed2 النووية تحت سيطرة المروج cmlc-2 القلب محددة ^11،12. ترسيم غياب EGFP وDsRed2 إشارات فلوري منطقة احتشاء قرصية الشكل على طول الجدار البطيني قمية الاطراف.

لإجراء التحاليل الخلوية والجزيئية للأنسجة، وكانت قلوب ثابتة ومقطوع مع ناظم البرد. ويرد ممثل الشريحة مع سلسلة متتالية من أقسام القلب مستعرضة في الشكل 3.

ويمكن تحليل المقاطع مع أساليب مختلفة (الشكل 4). لتحديد مدى التجديد قلب مقابل تندب، أجرينا التحليل النسيجي باستخدام حمض فوكسين أورانج-G (AFOG) تلطيخ، التي تصف بشكل مختلف أنسجة القلب وتليفي ^9. وقد تحققت التحليلات التعبير الجيني وفقا لفي إجراء التهجين في الموقع 9. مزيج من تلطيخ الاجراءات المتنوعة يؤدي إلى التعرف على الآليات الجزيئية والخلوية العاملة في القلب تجديد cryoinjury التالية.

الشكل 1. التسبب cryoinjury من البطين في الزرد الكبار. (أ) صورة للمسبار بالبرد. (ب) يتم وضع الزرد الكبار في شق من الاسفنج مع الجانب بطني حتى. (قوات التحالف) شق الصدر للوصول إلى القلب. (ج) يتم إجراء قطع صغير من خلال الجلد والعضلات بين الزعانف الصدرية 2 (خط أحمر). (د) إدراج مقص في شق إلى قطع الجلد بعد السهم الأحمر. (E) تحت الجلد، يتم فتح بلطف طبقة رقيقة من اللحمة فضي (محاطة أزرق خط متقطع) للوصول إلى القلب. (F) وينتشر مع شقملقط والبطين الضرب (السهم الأخضر) هو في متناول cryoinjury. (G) يتم إدخال مسبار بالبرد بلطف والبرد في صدره للمس قلب. (HJ) جمع القلب. (H) يتم إجراء شق عميق وطويل من خلال الأقواس خيشومي من الصدر للوصول إلى تجويف التامور. هياكل القلب هما مرئي: بصلة شريانية (أبيض السهم) والبطين (السهم الأخضر). (ط) الشريانية بصلة يتم عقد مع ملقط وانسحبت من تجويف الجسم. (J) واستئصاله وقلب كامل من الجسم.

الشكل 2. سيطرة الممثل وقلوب cryoinjured تشريح من الزرد المعدلة وراثيا معربا عن بالغ EGFP وDsRed2 النووية في العضلية. (AC) لم يصب في القلب. (A) وإضاءة حقل مظلم يظهر البطين (V)، بصلة شريانية (با والأبيض) والصمامات و(VA)، حيث تم ربط الأذين إلى البطين. (B و C) وصور نيون ر انه سليم EGFP عرض البطين وDsRed2 التعبير في العضلية. (مدافع) القلب في 4 cryoinjury آخر أيام (4 DPCI) (D) وإضاءة حقل مظلم يكشف عن احتشاء القرص على شكل (أصفر خط متقطع). (EF) لم يتم الكشف عن علامات Cardiomyocyte EGFP وDsRed2 في المنطقة احتشاء، مما يدل على عضلة القلب التالفة (محاطة خط متقطع).

الشكل 3. باجتزاء من القلب. (أ) قلب الجامعة مع الرسم من المقاطع العرضية بدءا من الجزء السفلي من قلب (1 و 2، باللون الأحمر) نحو الجزء العلوي من القلب (3 و 4 في الخضراء). (ب) التصوير الفوتوغرافي من الانزلاق مع سلسلة من المقاطع العرضية على التوالي ملطخة AFOG (حمض فوكسين أورانج-G). المقاطع الأولى (1 و 2، المربعات الحمراء) على قمة البطين، والأجزاء الأخيرة من القلب (3 و 4، والساحات الخضراء) تشمل بصلة شريانية.

iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg "/>
الشكل 4. أمثلة على تحليل يقوم على أقسام القلب في 7 cryoinjury آخر أيام. (A) AFOG (حمض فوكسين أورانج-G) تلطيخ تسميات خلايا العضلات صحي في البرتقال، وندبا التي تحتوي على مادة الكولاجين في الزرقاء والحمراء في الليفين. (ب) في التهجين في الموقع من سلسلة الميوسين البطين الثقيلة (vmhc) مرنا يتصور عضلة القلب سليمة (أزرق تلطيخ). النسيج المصاب يخلو من نص الجينات القلب (خط أحمر متقطع). (ج) من Immunoassaying التروبوميوزين (الخضراء) تصف العضلية سليمة وليس الأنسجة التالفة (طوق مع خط متقطع). دابي (الأزرق) البقع نوى خلايا جميع. (D) العضلية وصفت وراثيا صريحة DsRed2 (الحمراء) في النواة. دابي (الأزرق) تصف كل نواة. المنطقة احتشاء لا يحتوي على DsRed2 إيجابية الخلايا (أبيض خط متقطع).

كما يتم تعريف Cryoinjury الضرر للرقابة من الأنسجة من تطبيق دقيق من ¹⁴ البرد القارس. الصدمة الحرارية مباشرة يدمر الخلايا عن طريق تدمير البروتين والسوائل داخل الخلايا بواسطة الجليد تشكيل الكريستال التي تتمزق غشاء البلازما. وبالتالي، فإن خلايا المصابين يموتون في عمليات موت الخلايا المبرمج ونخر ^14. وقد تبين أن كلا من هذه الآليات إلى موت الخلايا تساهم في فقدان الأنسجة بعد احتشاء عضلة القلب ^15. وبالتالي، cryoinjury يمثل نموذج مناسب من الأمر الذي أدى إلى احتشاء القلب. وذكرت العديد من الدراسات أثبتت هذه الطريقة بشكل جيد في مختلف الثدييات، بما في ذلك الفئران والارانب والفئران والخنازير ^6،7. والتكيف التابع لبروتوكول cryoinjury في الزرد تمكن مناقشة أكثر مقارنة عن استجابة احتشاء بين الأنواع المختلفة.

مجموعتين أخريين تطويرها بشكل مستقل الإجراء cryoinjury للقلب الزرد الكبار. الاختلافات الرئيسية هي سورطرق جيري، ونوع من الأدوات والوقت تجميد تطبيق. في هذه الدراسة من قبل وآخرون غونزاليس روزا.، افتتح تأمور بواسطة تمزيق النسيج بدلا من القطع. تستخدم خيوط النحاس 0،3 مم ربط أنبوب polyamid مسبقا تبرد في النتروجين السائل لتجميد قلب لبضع ثوان حتى يمكن ملاحظة ذوبان ^10. في الدراسة التي استخدمت شنابل وآخرون، وقطعة من الثلج الجاف مخروطي الشكل بطول 20 ملم مع طرف مدبب من 2 مليمتر في القطر لتلمس القلب لمدة 10 ثانية ^8. المجموعتين التي تم الحصول عليها من خلال الضرر البطيني موت عضلة القلب. في الاستفادة من طريقة لدينا هو ترسب أكثر استنساخه من ندبة-الكولاجين الغنية، والذي يحاكي أفضل للشفاء في وقت مبكر احتشاء الردود التي لوحظت في نظم الثدييات.

في خطوة حاسمة أثناء إجراء cryoinjury في الزرد يتم إجراء شق طريق الجلد وكيس التامور بدون ثقب في القلب الكامنة. وperforme بشكل صحيحد جراحة يسبب النزيف قليلا. نزيف غزير يدل على وجود ثقب غير مقصود من البطين مع مقص. في مثل هذه الحالات، ينبغي أن تراجع هذه الحيوانات من التجربة. من أجل تجنب ثقب في القلب، ينبغي أن تستهدف نقطة من مقص بزاوية حادة للجلد.

وهناك جانب آخر مهم لخلق اصابة استنساخه هو تحديد المواقع الدقيقة للمسبار بالبرد الباردة في البطين لمدة دقيقة الأمثل. ووقت التجميد قصيرة جدا تؤدي إلى التهاب مع موت الخلايا القليل. تجميد لفترة طويلة، من ناحية أخرى، قد تتسبب في أضرار واسعة النطاق للقلب، مما قد يؤدي إلى وفيات المعزز للحيوانات. عقدنا العزم على أن الوقت الأمثل لعقد البطين في نطاقات دولة المجمدة بين 23-26 ثانية لالزرد 2 سم الكبار طويلة، وانها قد تختلف بشكل تابع لحجم الحيوانات.

لأن لدينا بروتوكول بسيط جدا وسريع، ليست هناك حدود التجريبيةations في إخضاع عدد كاف من الحيوانات للحصول على مكررات البيولوجية كافية. هو جيد جدا لعلاج cryosurgical التسامح من قبل الحيوانات. جمع قلوب في نقاط زمنية مختلفة بعد cryoinjury يسمح توصيف مفصل للمراحل اللاحقة أثناء عملية التجدد. يجوز للتحليل التجريبي للقلوب cryoinjured تشمل 1) تصور من النسخ الجيني بواسطة التهجين في الموقع، 2) الكشف عن التوزيع بواسطة بروتين مناعي تلطيخ، 3) التصوير النسيجي للهياكل مختلفة. وفهم عمليات الشفاء مفتاح بعد احتشاء عضلة القلب في الزرد تؤثر في مجال البيولوجيا التجدد. وعلاوة على ذلك، قد يكون من المفيد لتصميم مناهج علاجية جديدة في الطب التجديدي.

تمت الموافقة على البحوث التجريبية على الحيوانات من قبل مكتب الطب البيطري الكانتونات فريبورغ.

نشكر خامسا زيمرمان للحصول على مساعدة فنية ممتازة ورعاية الأسماك. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية، منحة رقم: 310000_120611.

1. Laflamme, M.A. & Murry, C.E. Heart regeneration. Nature. 473, 326-335 (2011).
2. Singh, B.N., Koyano-Nakagawa, N., Garry, J.P., & Weaver, C.V. Heart of newt: a recipe for regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 3, 397-409 (2010).
3. Poss, K.D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).
4. Ausoni, S. & Sartore, S. From fish to amphibians to mammals: in search of novel strategies to optimize cardiac regeneration. J. Cell Biol. 184, 357-364 (2009).
5. Borchardt, T. & Braun, T. Cardiovascular regeneration in non-mammalian model systems: what are the differences between newts and man? Thrombosis and haemostasis. 98, 311-318 (2007).
6. van den Bos, E.J., Mees, B.M., de Waard, M.C., de Crom, R., & Duncker, D.J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 289, H1291-1300 (2005).
7. van Amerongen, M.J., Harmsen, M.C., Petersen, A.H., Popa, E.R., & van Luyn, M.J. Cryoinjury: a model of myocardial regeneration. Cardiovasc. Pathol. 17, 23-31 (2008).
8. Schnabel, K., Wu, C.C., Kurth, T., & Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS ONE. 6 (2011).
9. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., & Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
10. González-Rosa, J.M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., & Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
11. Rottbauer, W., et al. Reptin and pontin antagonistically regulate heart growth in zebrafish embryos. Cell. 111, 661-672 (2002).
12. Burns, C.G., et al. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).
13. Chablais, F. & Jazwinska, A. IGF signaling between blastema and wound epidermis is required for fin regeneration. Development. 137, 871-879 (2010).
14. Baust, J.G. & Gage, A.A. The molecular basis of cryosurgery. BJU Int. 95, 1187-1191 (2005).
15. Whelan, R.S., Kaplinskiy, V., & Kitsis, R.N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annual review of physiology. 72, 19-44 (2010).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.