Induktion av hjärtinfarkt hos vuxna Zebrafish Använda Cryoinjury

Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury. J. Vis. Exp. (62), e3666, doi:10.3791/3666 (2012).

Däggdjurs hjärtat är i stånd att signifikant regeneration efter en akut skada såsom myokardinfarkt ^1. Däremot urodele amfibier och teleost fisk bibehåller en anmärkningsvärd förmåga att hj regenerering med liten eller ingen ärrbildning under hela livet ^2,3. Det är inte känt varför bara vissa icke-däggdjur ryggradsdjur kan återskapa en hel orgel från kvarleva vävnader ^4,5. För att förstå de molekylära och cellulära skillnader mellan regenerativa svar i olika arter, måste vi använda liknande metoder för att framkalla akuta skador.

Hos däggdjur har den mest använda modellen för att studera hjärt reparation varit akut ischemi efter ligering av kranskärl eller vävnadsdestruktion efter cryoinjury ^6,7. Hjärt förnyelse i vattensalamandrar och zebrafisk har främst studerats efter en partiell resektion av den ventrikulära apex ^2,3. Nyligen har flera grupper har Etablblomstrande tillvaro den cryoinjury tekniken i vuxna zebrafisk ^8-10. Denna metod har en stor potential, eftersom den tillåter en jämförande diskussion av resultaten erhållna från de däggdjurs-och icke-däggdjurs-arter.

Här presenterar vi en metod för att inducera ett reproducerbart skivformad infarkt av zebrafisk ventrikeln genom cryoinjury. Denna skada Modellen är baserad på snabb frysning-tining vävnad, vilket resulterar i massiv celldöd av ca 20% av kardiomyocyter i den ventrikulära väggen. Först ett litet snitt görs genom bröstet med iridektomi sax för att komma åt hjärtat. Den ventrikulära väggen var direkt frystes genom att ansöka om 23-25 ​​sekunder av rostfritt stål Cryoprobe förkyld i flytande kväve. Att stoppa frysning av hjärtat, fisk i vatten vid rumstemperatur droppades på spetsen av Cryoprobe. Förfarandet är väl tolereras av djuren, med en överlevnadsfrekvens på 95%.

För att karakterisera den regenerativa processen var hjärtansamlas in och fixeras vid olika dagar efter cryoinjury. Därefter provet inbäddade i kryosektionering. De glider med sektioner bearbetades för histologisk analys, in situ hybridisering och immunfluorescens. Detta åtagande ökar vår förståelse av de faktorer som krävs för regenerativ plasticitet i zebrafisk, och ger nya insikter i maskineriet av hjärt förnyelse. En begreppslig och molekylär förståelse av hjärtat förnyelse i zebrafisk påverkar såväl utvecklingsbiologi och regenerativ medicin.

1. Utrustning Set-up

1. Den huvudsakliga verktyg som används för att utföra cryoinjury är Cryoprobe den pennliknande instrumentet som är av rostfritt stål (fig. 1A). Den cylindriska skaftet är 40 mm lång och har en diameter av 8 mm. Spetsen av applikatorn är 6 mm långa och 0,8 mm i diameter. Förbindelsen mellan spetsen och handtaget är konisk 4 mm långa. Dessutom bör handtaget av Cryoprobe isoleras med ett plaströr och tejp för att undvika förfrysning av fingrarna medan man håller verktyget under förfarandet.
2. Andra material som behövs för cryosurgery är ett stereomikroskop, skarpa pincett, mikro dissekera sax våren och en plast överföringspipett. Dessutom förbereder en bägare för söva fisken och en plastsked för överföring av fisk.
3. Under operationen, är fisken placeras på en fuktig svamp med dess ventrala sidan upp (figur 1B). För att hålla djuret i ett stabilt förfarande, ettlämpliga spåret skall skäras manuellt i svampen.
4. Framställa en tank med systemvattnet att överföra fisk efter det kirurgiska ingreppet.
5. Inrätta en dubbel timer först med en 10 sekunders nedräkning och sedan automatiskt en 24 sekunders nedräkning.

2. Den Cryoinjury Förfarande

1. Svalna Cryoprobe genom nedsänkning av spetsen 3-5 cm av flytande kväve under minst 3 minuter.
2. Bedöva en vuxen zebrafisk genom att immerging den i 0,02% trikain tills fisken slås på ryggen och dess gälar nästan slutar röra (cirka 90 sekunder).
3. Överför fisk med en plastsked i en fuktig svamp som har skurits för att hålla en fisk upp och ned (Figur 1B). Håll fisken stadigt med pincett som använder icke-dominanta handen. Visuellt hitta bakre mediala kanten av hjärtat och använda raka Iridektomi sax för att punktera huden. (Figur 1C).
4. Göra en liten (c: 2 mm) snitt ovanför hjärtat genom cutting rak anteriort genom huden, musklerna (Figur 1D). Klipp inte genom den beniga brankiala apparaten, eftersom detta kommer att döda djuret.
5. Försiktigt riva den silverfärgade epitelskikt av hypodermis (Figur 1E) med spetsen på saxen att ha en direkt tillgång till att slå ventrikeln. Sätt inte saxen djupare i kroppen hålighet, eftersom detta vilja punktera hjärtat. Den bultande hjärta bör vara väl synlig, och ingen omfattande blödning skulle inträffa under torakotomi (Figur 1F).
6. Starta den programmerade timer som har satts i 10 sekunder följt av 24 sekunder. Under 10 sekunder ta ut Cryoprobe från det flytande kvävet. Se till att det inte finns mer kväve på Cryoprobe genom att skaka den försiktigt. Sprid snittet i sidled med hjälp tång för att öppna bröstkorgen (figur 1F).
7. När timern ringer 10 sekunder, tryck omedelbart, men försiktigt kammaren med spetsen av PRe-kyld Cryoprobe (Figur 1G).
8. När timern ringer 24 sekunder, häll 2-3 ml av system vatten med hjälp av en plastpipett på bröstet för att frigöra Cryoprobe från vävnad, och överföra fisken i tanken med systemet vatten.
9. Fisken ska starta andningen efter några sekunder och då borde återupptas simning. Om det inte andas efter ca 45 sekunder, stimulera djuret genom att spruta vatten i gälarna med en plastpipett tills den börjar andas av sig själv. Enligt vår erfarenhet, 95% av fisken överleva operationen, och alla dödsfall sker på dagen för kirurgi. Det kommer inte att vara nödvändigt att sy snitt.

3. Heart Collection och fixering

1. Framställ 1 ml 2% formalin i ett mikrocentrifugrör för fixering av hjärtat, två pincett, mikro-dissekera sax och den fuktiga slitsade svamp.
2. Vid den valda dagen efter cryoinjury, euthanize fisken i 0,1% trikain under 5 minuter.
3. Placerafiskar ventral uppåt i en fuktig slitsad, svamp. Gör en stor (ca 4 mm) snitt ovanför hjärtat genom brankiala brosk med mikro dissekera saxen. Öppna allmänt snittet med pincett (Figur 1H).
4. Nypa av bulbus arteriosus, en vit struktur anterior till ventrikeln (figur 1 Hl), och avlägsna hjärtat från kaviteten genom att dra den. En hel dissekerades hjärtat visas i figur 1J och figur 2A.
5. Placera upp till 3 hjärtan in ett mikrocentrifugrör med 1 ml 2% formalinlösning. Vrid försiktigt röret flera gånger och hålla den över natten vid 4 ° C.

4. Hjärta Montering

1. Skölj hjärtan i PBS under 5 minuter. Överföra hjärtan i 10 ml 30% sackaros som skall kylas ner till 4 ° C, och blanda försiktigt. Provet bör inledningsvis flyter på ytan av sackaroslösning. Fortsätta inkubation under 1 timme och 20 minuter vid 4 ° C. Efterdenna tid kommer de hjärtan sjunka till botten av röret.
2. Framställa en låda med torr is. Ta en inbäddning formen, och häll en 5 mm skikt av OCT monteringsmedium vid botten av formen.
3. Med pincett placera hjärtat i OC T monteringsmedium i formen. Under stereomikroskop, justera orienteringen av provet för att uppnå den ventrikulära apex på botten av gjutformen, och den bulbus arteriosus mot toppen.
4. Placera formarna med prov på torr is. När monteringsmedium börjar frysa, fylla upp resten av formen med oktober medium och låt det frysa helt. Hålla formen under minst 1 h vid -80 ° C före snittning. Den frusna provet kan lagras under flera månader vid -80 ° C.

5. Hjärtan Sektioneringspunkter

1. Upprätta en kryostat med en skärande storlek av 16 pm, en kammartemperatur av -24 ° C och temperaturen hos provet vid -22 ° C.
2. Placera det frusna blocket medprovet i kryostat och programmets inriktning innan du börjar såga parallellt med botten av blocket.
3. Förbered sex SuperFrost-plus bilder per ett block och räkneförmåga dem från 1 till 6. Starta skära tills vävnaden nås, och trimma blocket runt provet med ett rakblad.
4. För att få 6 replikat av ett hjärta, tar upp det första avsnittet på bild 1, den andra delen på bild 2, den tredje på bilden 3, etc. När du placerat den sjätte avsnittet om bilden 6 startar med bild 1 och fortsätt tills Hela organ skärs. Samla två rader av ca 8 avsnitt på bilden (Figur 3).
5. Låta skivorna torka under 1 timme vid rumstemperatur. Förvara dem i upp till 1 år i väl förslutna lådor vid -20 ° C.

6. Representativa resultat

Representant hjärt skada efter detta protokoll visas i dissekerade hela hjärtan vid 4 dpci (dagar efter cryoinjury, figur 2D-F). Till visualize hjärtmuskelvävnaden in vivo använde vi transgen fisk uttrycker EGFP och kärnenergi DsRed2 under kontroll av hjärt-specifik cmlc-2 promotorn ^11,12. Frånvaro av EGFP och DsRed2 fluorescenssignaler avgränsas en skivformad infarktområdet längs den apikala-laterala ventrikulära väggen.

Att utföra cellulära och molekylära analyser av vävnaden var hjärtan fast och sektionerades med en kryostat. En representativ bild med en serie av tvärgående hj sektioner visas i fig 3.

Sektionerna kan analyseras med olika metoder (figur 4). För att bestämma omfattningen av hjärtats förnyelse kontra ärrbildning, utförde vi histologisk analys med syrafuxin Orange-G (AFOG) färgning, vilket differentiellt märker hjärt-och fibrotiska vävnader ^9. Genuttrycket analyser uppnås enligt den in situ-hybridisering förfarande 9. En kombination av olika färgningsförfaranden leder till identifiering av molekylära och cellulära mekanismer som är involverade i hjärtats förnyelse följande cryoinjury.

Figur 1. Induktion cryoinjury av ventrikeln i den vuxna zebrafisk. (A) Ett fotografi av Cryoprobe. (B) En vuxen zebrafisk placeras i slitsen av svampen med dess ventrala sidan upp. (CF) Chest snitt för att nå hjärtat. (C) En liten snitt genom huden och musklerna görs mellan de två bröstfenor (röd linje). (D) Saxen är införda in i snittet för att skära huden efter röda pilen. (E) under huden, är det fina skiktet av silver-hypodermis (omgiven av blå streckad linje) försiktigt öppnas för att komma åt kärnan. (F) Snittet sprids medtång och slå kammare (grön pil) är tillgänglig för cryoinjury. (G) Den kalla Cryoprobe försiktigt in i bröstet att röra hjärtat. (HJ) Heart Collection. (H) En djup och långt snitt görs genom brankial valven i bröstet för att komma åt perikardialhålan. Två hjärta strukturer är synliga: bulbus arteriosus (vit pil) och kammaren (grön pil). (I) bulbus arteriosus är att hålla med pincett och drog ut från kroppen hålighet. (J) hela hjärtat skärs ut från den kropp.

Figur 2. Representant kontroll och cryoinjured hjärtan dissekerade från vuxen transgen zebrafisk uttrycker EGFP och kärnkraft DsRed2 i kardiomyocyter. (AC) oskadade hjärtat. (A) mörkfältsbelysning visar ventrikeln (V), bulbus arteriosus (Ba, vit) och ventilerna (Va), där förmaket var kopplad till ventrikeln. (B och C) Fluorescerande bilder av t Han intakt kammare display EGFP och DsRed2 uttryck i kardiomyocyter. (DF) hjärta vid 4 dagar efter cryoinjury (4 dpci) (D) mörkfältsbelysning avslöjar en skivformad infarkt (gul streckad linje). (EF) kardiomyocetisk markörer EGFP och DsRed2 inte detekteras i infarkt området, vilket indikerar den skadade hjärtmuskeln (omgiven av streckad linje).

Figur 3. Snittning av hjärtat. (A) Hela hjärta med ritningen av tvärgående delar med början från botten av hjärtat (1 och 2, i rött) mot toppen av hjärtat (3 och 4 i grönt). (B) Fotografi av en bild med flera på varandra följande tvärgående sektioner färgade med AFOG (syrafuxin Orange-G). De första sektionerna (1 och 2, röda kvadrater) innehåller det ventrikulära apex och de sista delarna av hjärtat (3 och 4, gröna kvadrater) innefattar bulbus arteriosus.

iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg "/>
Figur 4. Exempel på analysen utföras på hjärtat sektioner vid 7 dagar efter cryoinjury. (A) AFOG (syrafuxin Orange-G) färgning etiketter friska muskelceller i orange, ärrvävnad som innehåller kollagen i blått och fibrin i rött. (B) In situ-hybridisering av ventrikulär myosin tung kedja (vmhc)-mRNA visualiserar intakt myokardiet (blå färgning). Den skadade vävnaden är i avsaknad av hj gentranskriptet (röd streckad linje). (C) Immunoassaying i Tropomyosin (grön) etiketter intakta hjärtmuskelceller och inte skadad vävnad (inringade med den streckade linjen). DAPI (blått) färgar kärnor av alla celler. (D) Genetiskt märkta hjärtmuskelceller express DsRed2 (röd) i deras kärnor. DAPI (blå) etiketter alla kärnor. Infarktområdet innehåller inte DsRed2-positiva celler (vita streckad linje).

Cryoinjury definieras som den styrda skada av vävnad genom exakt applicering av extrem kyla ^14. Direkt termisk chock förstör cellerna genom protein förstörelse och genom intracellulär vätska iskristallbildning som bryter sönder plasmamembranet. Följaktligen är de skadade cellerna dör i processerna för apoptos och nekros ^14. Båda dessa mekanismer för celldöd har visat sig bidra till vävnadsförlust efter hjärtinfarkt ^15. Således representerar cryoinjury en lämplig modell för att inducera en hjärtinfarkt. Flera studier har rapporterat detta väl visat metoden i olika däggdjur, inklusive möss, råttor, kaniner och grisar ^6,7. Anpassningen av cryoinjury protokollet i zebrafisk möjliggör en mer jämförande diskussion om infarkt svar mellan olika arter.

Två andra grupper utvecklas självständigt cryoinjury förfarandet för vuxna zebrafisk hjärtat. De stora skillnaderna är surGery metoder, vilken typ av verktyg och tillämpas frysning tid. I studien av Gonzalez-Rosa et al. Var hjärtsäck öppnas genom att riva sönder vävnaden i stället för att skära. De använde 0,3 glödtråden mm koppar kopplad till en polyamid rör förväg kyls i flytande kväve för att frysa hjärtat för några sekunder tills upptining kunde observeras ^10. I studien av Schnabel et al. En konisk bit torris 20 mm längd med en spets på 2 mm i diameter användes för att röra hjärtat i 10 sekunder ^8. De två grupperna som erhålls ventrikulär skada genom död hjärtmuskeln. Fördelen med vår metod är en mer reproducerbar deposition av kollagen-rik ärr, som bättre efterliknar de tidiga svaren infarkt healing som observerats i däggdjur system.

Det kritiska steget vid förfarandet cryoinjury i zebrafisk är att göra ett snitt genom huden och hjärtsäcken utan punktering av underliggande kärnan. En korrekt performed operation orsakar liten blödning. Riklig blödning indikerar en oavsiktlig punktering av kammaren med en sax. I sådana fall bör djuren tillbaka från experimentet. För att undvika punktering av hjärtat, bör den punkt sax vara att en liten vinkel mot huden.

En annan viktig aspekt för att skapa en reproducerbar skada är den exakta placeringen av den kalla Cryoprobe på kammaren för optimal exakta längden. För kort frystid kommer att resultera i inflammation med liten celldöd. Långvarig frysning, å andra sidan, kan orsaka omfattande skador på hjärtat, vilket kan leda till förbättrad mortalitet hos djuren. Vi bestämde att det optimala tiden för att hålla kammaren i fruset tillstånd ligger mellan 23-26 sekunder för en 2 cm lång vuxen zebrafisk, och det kan skilja sig beroende sätt på storleken av djuren.

Eftersom vår protokollet är mycket enkel och snabb, det finns inga experimentella gränstioner i utsätta tillräckligt antal djur för att erhålla lämpliga biologiska replikationer. Kryokirurgisk behandling är mycket väl tolereras av djuren. Insamling av hjärtan vid olika tidpunkter efter cryoinjury möjliggör detaljerad beskrivning av de efterföljande faser under den regenerativa processen. Den experimentella analys av cryoinjured hjärtan kan innefatta 1) visualisering av gentranskription genom hybridisering in situ, 2) detektering av protein fördelning genom immunfluorescerande färgning, 3) histologisk avbildning av olika strukturer. Förstå de viktigaste läkningsprocesser efter hjärtinfarkt i zebrafisk kommer att påverka området regenerativ biologi. Dessutom kan det vara fördelaktigt för att utforma nya terapeutiska metoder inom regenerativ medicin.

Experimentell forskning på djur har godkänts av det kantonala veterinära kontor Fribourg.

Vi tackar V. Zimmermann utmärkt tekniskt bistånd och för fisk vård. Detta arbete stöddes av den schweiziska National Science Foundation, licensnummer: 310000_120611.

1. Laflamme, M.A. & Murry, C.E. Heart regeneration. Nature. 473, 326-335 (2011).
2. Singh, B.N., Koyano-Nakagawa, N., Garry, J.P., & Weaver, C.V. Heart of newt: a recipe for regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 3, 397-409 (2010).
3. Poss, K.D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).
4. Ausoni, S. & Sartore, S. From fish to amphibians to mammals: in search of novel strategies to optimize cardiac regeneration. J. Cell Biol. 184, 357-364 (2009).
5. Borchardt, T. & Braun, T. Cardiovascular regeneration in non-mammalian model systems: what are the differences between newts and man? Thrombosis and haemostasis. 98, 311-318 (2007).
6. van den Bos, E.J., Mees, B.M., de Waard, M.C., de Crom, R., & Duncker, D.J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 289, H1291-1300 (2005).
7. van Amerongen, M.J., Harmsen, M.C., Petersen, A.H., Popa, E.R., & van Luyn, M.J. Cryoinjury: a model of myocardial regeneration. Cardiovasc. Pathol. 17, 23-31 (2008).
8. Schnabel, K., Wu, C.C., Kurth, T., & Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS ONE. 6 (2011).
9. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., & Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
10. González-Rosa, J.M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., & Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
11. Rottbauer, W., et al. Reptin and pontin antagonistically regulate heart growth in zebrafish embryos. Cell. 111, 661-672 (2002).
12. Burns, C.G., et al. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).
13. Chablais, F. & Jazwinska, A. IGF signaling between blastema and wound epidermis is required for fin regeneration. Development. 137, 871-879 (2010).
14. Baust, J.G. & Gage, A.A. The molecular basis of cryosurgery. BJU Int. 95, 1187-1191 (2005).
15. Whelan, R.S., Kaplinskiy, V., & Kitsis, R.N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annual review of physiology. 72, 19-44 (2010).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.