Induktion eines Myokardinfarktes in Adult Zebrafisch Mit Cryoinjury

Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury. J. Vis. Exp. (62), e3666, doi:10.3791/3666 (2012).

Das Säugetier-Herzens in der Lage ist signifikante Regeneration nach einer akuten Verletzung wie Myokardinfarkt ^1. Im Gegensatz dazu behalten urodele Amphibien und Knochenfische eine bemerkenswerte Fähigkeit zur kardialen Regeneration mit wenig oder ohne Narbenbildung während des gesamten Lebens ^2,3. Es ist nicht bekannt, warum nur einige Nicht-Säugetier-Wirbeltiere können eine komplette Orgel aus dem Rest Gewebe ^4,5 neu zu erstellen. Um die molekularen und zellulären Unterschiede zwischen regenerativen Reaktionen in verschiedenen Spezies zu verstehen, müssen wir ähnliche Ansätze zur Induktion von akuten Verletzungen verwenden.

Bei Säugetieren ist das am häufigsten verwendete Modell zur Herzwiederherstellung Studie akute Ischämie nach einer Ligatur der Koronararterie oder Zerstörung von Gewebe nach cryoinjury ^6,7. Die kardialen Regeneration im Zebrafisch Molche und wurde überwiegend nach einer Teilresektion des ventrikulären Apex ^2,3 untersucht. In jüngster Zeit haben mehrere Gruppen establIshed die cryoinjury Technik bei erwachsenen Zebrafisch ^10.08. Diese Methode hat ein großes Potenzial, weil es eine vergleichende Diskussion der Ergebnisse aus den Säugetier-und Nicht-Säugetier-Spezies erhalten werden können.

Hier präsentieren wir eine Methode, um eine reproduzierbare scheibenförmigen Infarkt des Zebrafisch Ventrikels durch cryoinjury induzieren. Diese Verletzung Modell basiert auf schnelle Gefrier-Tau-Gewebe, das in massiver Zelltod von etwa 20% der Kardiomyozyten der Ventrikelwand Ergebnissen. Zuerst wurde ein kleiner Einschnitt in die Brust mit Iridektomie Scheren, um die Herzen zu übersetzen. Die Ventrikelwand wurde direkt durch die Anwendung für 23-25 ​​Sekunden ein Edelstahl Kryosonde in flüssigem Stickstoff eingefroren vorgekühlt. Um das Einfrieren des Herzens, der Fisch Wasser bei Raumtemperatur zu stoppen war an der Spitze der Kryosonde gesunken. Das Verfahren wird auch von den Tieren vertragen, mit einer Überlebensrate von 95%.

Um den Regenerationsprozess zu charakterisieren, wurden die Herzengesammelt und an verschiedenen Tagen nach cryoinjury befestigt. Anschließend wurden die Proben für Kryoschneiden eingebettet. Die Folien mit Schnitte wurden für die histologische Analyse verarbeitet werden, in-situ-Hybridisierung und Immunfluoreszenz. Das Unternehmen erweitert unser Verständnis der Faktoren, die für die regenerative Plastizität im Zebrafisch benötigt werden, und liefern neue Einblicke in die Maschinerie der kardialen Regeneration. Ein konzeptionelles Verständnis der molekularen und Herz Regeneration im Zebrafisch wird Auswirkungen sowohl der Entwicklungsbiologie und der regenerativen Medizin.

1. Ausstattung Set-up

1. Das wichtigste Instrument zur cryoinjury durchzuführen ist die Kryosonde, die Stift-ähnliches Instrument, das aus rostfreiem Stahl (Abbildung 1A) hergestellt wird. Der zylindrische Griff 40 mm lang und hat einen Durchmesser von 8 mm. Die Spitze des Applikators ist 6 mm lang und 0,8 mm Durchmesser. Die Verbindung zwischen der Spitze und dem Griff konisch ist 4 mm lang. Darüber hinaus wird der Griff der Kryosonde mit einem Kunststoffrohr und das Klebeband zu Erfrierungen der Finger zu vermeiden, während das Werkzeug während des Verfahrens isoliert werden.
2. Andere Materialien, die für die Kryochirurgie benötigt werden, sind ein Stereomikroskop, scharfen Pinzetten, Mikro Sezieren Frühjahr Schere und ein Kunststoff-Transferpipette. Darüber hinaus bereiten einen Becher für die Fische betäuben und einen Plastiklöffel für die Übertragung der Fische.
3. Während der Operation werden die Fische auf einem feuchten Schwamm mit seiner Bauchseite nach oben (Abbildung 1B) platziert. Um das Tier in einer stabilen Verfahren halten, eineentsprechende Nut sollte manuell im Schwamm geschnitten werden.
4. Bereiten Sie einen Tank mit Wasser System, um die Fische nach der Operation zu übertragen.
5. Richten Sie eine Doppel-Timer zuerst mit einem 10 Sekunden-Countdown und dann automatisch eine 24 Sekunden-Countdown.

2. Die Vorgehensweise Cryoinjury

1. Abkühlen lassen Kryosonde durch Eintauchen der Spitze in 3-5 cm von flüssigem Stickstoff für mindestens 3 min.
2. Anesthetize einen erwachsenen Zebrafisch durch Eintauchen in 0,02% Tricain, bis der Fisch dreht sich auf den Rücken und seine Kiemen fast nicht mehr bewegen (ca. 90 Sekunden).
3. Übertragen Sie den Fisch mit einem Plastiklöffel an einem feuchten Schwamm, das ausgeschnitten wurde, einen Fisch auf den Kopf zu halten (Abbildung 1B). Halten Fisch stetig mit einer Pinzette mit nicht-dominanten Hand. Optisch suchen Sie den hinteren medialen Rand des Herzens und nutzen gerade Iridektomie Schere, um die Haut durchstechen. (1C).
4. Machen Sie eine kleine (ca. 2 mm) Einschnitt oberhalb des Herzens durch Cutting geradeaus nach vorne durch die Haut, Muskeln (1D). Nicht durch den knöchernen Kiemen-Apparat schneiden, da dies das Tier zu töten.
5. Sanft reißen die silbrig Epithelschicht der Unterhaut (1E) mit der Spitze der Schere, um einen direkten Zugang zu dem schlagenden Ventrikel haben. Setzen Sie die Schere tiefer in die Körperhöhle, da dies das Herz durchstechen. Das schlagende Herz sollte gut sichtbar sein, und keine umfangreichen Blutungen sollten während der Thorakotomie (1F) auftreten.
6. Starten Sie die programmierte Timer, der für 10 Sekunden von 24 Sekunden folgte eingestellt wurde. Während 10 Sekunden nehmen Sie die Kryosonde aus dem flüssigen Stickstoff. Stellen Sie sicher, dass es keine mehr Stickstoff auf der Kryosonde durch Schütteln Sie sie vorsichtig. Verbreiten Sie die Schnitt seitlich mit einer Pinzette, um die Brust (1F) zu öffnen.
7. Wenn der Timer klingelt 10 Sekunden, sofort, aber vorsichtig, berühren Sie die Ventrikel mit der Spitze des PRE-gekühlten Kryosonde (1G).
8. Wenn der Timer klingelt 24 Sekunden, gießen Sie 2-3 ml Wasser-System mit einem Kunststoff-Pipette auf die Brust, um die Kryosonde aus dem Gewebe zu lösen, und überweisen Sie den Fisch in den Tank mit Wasser System.
9. Die Fische sollten Atmung nach einigen Sekunden neu zu starten, und dann sollte es wieder schwimmen. Wenn es nicht nach rund 45 Sekunden nicht atmen, regen die Tiere durch spritzen Wasser in die Kiemen mit einer Kunststoff-Pipette, bis es von selbst atmen beginnt. Nach unserer Erfahrung überleben 95% der Fische Chirurgie, und alle Todesfälle ereignen sich am Tag der Operation. Es wird nicht notwendig sein, um Einschnitte zu vernähen.

3. Herz-Sammlung und Fixation

1. Bereiten Sie 1 mL 2% Formalin in einem Mikrozentrifugenröhrchen für die Festsetzung des Herzens, zwei Pinzetten, Mikro-Dissektion und die feuchten Schwamm geschlitzt.
2. Am Tag nach cryoinjury ausgewählt, einschläfern den Fisch in 0,1% Tricain für 5 Minuten.
3. Legen Sie dieFisch Bauchseite bis in eine feuchte, geschlitzte Schwamm. Machen Sie einen großen (ca. 4 mm) Einschnitt oberhalb des Herzens durch die Kiemen-Knorpel mit den Mikro-Dissektion. Öffnen Sie weit den Einschnitt mit einer Pinzette (Abbildung 1H).
4. Kneifen Sie von den Bulbus arteriosus, eine weiße Struktur ventral des Ventrikels (Abbildung 1 HALLO), und entfernen Sie das Herz aus dem Hohlraum, indem Sie es. Eine ganze seziert Herzen ist in 1J und 2A gezeigt.
5. Legen Sie bis zu 3 Herzen in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml 2% Formalin. Drehen Sie das Rohr mehrmals und halten Sie sie über Nacht bei 4 ° C.

4. Herz-Montage

1. Spülen Sie die Herzen in PBS für 5 Minuten. Übertragen Sie die Herzen in 10 ml 30% Saccharose, das sollte bei 4 ° C vorgekühlt werden, und vorsichtig mischen. Die Probe sollte zunächst an der Oberfläche der Saccharose-Lösung zu schweben. Weiter Inkubation für 1 Stunde 20 Minuten bei 4 ° C. Nachdieses Mal wird die Herzen der Boden des Röhrchens zu versenken.
2. Bereiten Sie eine Box mit Trockeneis. Nehmen Sie eine Einbettform, und gießen Sie einen 5 mm dicken Oktober Eindeckmedium am unteren Rand der Form.
3. Mit einer Pinzette Stellen Sie das Herz in die OC T Eindeckmedium in der Form. Unter dem Stereomikroskop Einstellung der Orientierung der Probe, um die ventrikulären Apex an der Unterseite der Form und den Bulbus arteriosus nach oben zu erreichen.
4. Legen Sie die Formen mit Probe auf Trockeneis. Wenn das Eindeckmedium zu frieren beginnt, füllen Sie den Rest der Form mit OCT-Medium und lassen Sie es vollständig einfrieren. Halten Sie die Form für mindestens 1 h bei -80 ° C vor dem Schneiden. Die gefrorene Probe kann für viele Monate bei -80 ° C gelagert werden

5. Herz-Schnitte

1. Einrichten eines Kryostaten mit einem Schneidwerkzeug eine Größe von 16 um eine Kammer Temperatur von -24 ° C und die Temperatur der Probe bei -22 ° C
2. Setzen Sie den gefrorenen Block mit derMuster in den Kryostaten und fixieren die Ausrichtung mit dem Schneiden beginnen parallel zu der Unterseite des Blocks.
3. Bereiten Sie sechs Superfrost-plus Objektträger pro Block ein und rechnen können sie 1 bis 6. Fang an zu schneiden, bis das Gewebe erreicht wird, und schneiden Sie den Block um die Probe mit einer Rasierklinge.
4. Um 6 zu erhalten repliziert eines Herzens, nimm den ersten Abschnitt auf Folie 1, der zweite Abschnitt auf Folie 2, der dritte auf Folie 3, usw. Sobald Sie legte den sechsten Abschnitt auf Folie 6, mit Folie 1 starten und weiterfahren bis die ganze Organ wird geschnitten. Sammeln Sie zwei Reihen von rund 8 Sektionen auf der Folie (Abbildung 3).
5. Lassen Sie die Folien trocken für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Bewahren Sie sie für bis zu 1 Jahr in gut verschlossenen Boxen bei -20 ° C

6. Repräsentative Ergebnisse

Vertreter Herzschädigung nach diesem Protokoll ist in seziert ganzem Herzen bei 4 DPCI gezeigt (Tage nach cryoinjury; Abbildung 2D-F). Zu visualize die Myokardgewebe in vivo, verwendeten wir transgene Fische EGFP und nukleare DsRed2 unter der Kontrolle von herz-spezifische GMLC-2-Promotor ^11,12. Das Fehlen von EGFP und DsRed2 Fluoreszenzsignale abgegrenzt einen scheibenförmigen Infarktzone entlang der apikal-lateralen Ventrikelwand.

Um zelluläre und molekulare Analysen des Gewebes führen, waren die Herzen fester und mit einem Kryostaten geschnitten. Ein Vertreter Rutsche mit einer konsekutiven Serie von transversalen Herz Abschnitten wird in Abbildung 3 dargestellt.

Die Abschnitte können mit verschiedenen Verfahren (4) analysiert werden. Um das Ausmaß der Herzregeneration gegenüber Narbenbildung bestimmen, führten wir histologische Analyse unter Verwendung Säurefuchsin Orange-G (AFOG)-Färbung, die unterschiedlich markiert Herz und fibrotischen Gewebe ^9. Die Genexpressionsanalysen wurden nach der in situ Hybridisierung Verfahren erreicht 9. Eine Kombination aus verschiedenen Färbeverfahren führt zur Identifizierung von molekularen und zellulären Mechanismen der kardialen Regeneration folgenden cryoinjury beteiligt.

1. Induktion cryoinjury des Ventrikels im erwachsenen Zebrafisch. (A) Ein Foto von der Kryosonde. (B) Ein Erwachsener Zebrafisch ist in dem Schlitz des Schwamms mit seinem vorderen Seite nach oben angeordnet. (CF) Brusteinschnitt, um das Herz zugreifen. (C) ein kleiner Schnitt durch die Haut und Muskeln zwischen den beiden Brustflossen (rote Linie). (D) Die Schere ist in den Einschnitt eingeführt, um die Haut nach dem roten Pfeil geschnitten. (E) unter die Haut, wird die feine Schicht aus silbrig Unterhaut (umgeben von blau gestrichelte Linie) vorsichtig geöffnet, um das Herz zugreifen. (F) Der Schnitt wird mit der VerbreitungZangen und das pulsierende Herzkammer (grüner Pfeil) ist zugänglich für cryoinjury. (G) Das kalte Kryosonde wird sanft in die Brust, das Herz zu berühren eingefügt. (HJ) Herz-Sammlung. (H) einer tiefen und langen Schnitt wird durch die Kiemenbogen der Brust gemacht, um die Perikardhöhle zugreifen. Zwei Herzen Strukturen sind sichtbar: Bulbus arteriosus (weißer Pfeil) und Ventrikel (grüner Pfeil). (I) Der Bulbus arteriosus ist mit einer Zange halten und zog aus der Körperhöhle. (J) Die gesamte Herz aus des Körpers ausgeschnitten.

Abbildung 2. Vertreter-Steuerung und cryoinjured Herzen von erwachsenen transgenen Zebrafisch-EGFP und nukleare DsRed2 in Kardiomyozyten seziert. (AC) unverletzt Herz. (A) Die Dunkelfeld-Beleuchtung zeigt den Ventrikel (V), Bulbus arteriosus (Ba, weiß) und die Ventile (Va), wo das Atrium zum Ventrikel verbunden war. (B und C) Fluoreszenzbilder von t er intakt Ventrikel-Display und EGFP-Expression in Kardiomyozyten DsRed2. (DF) Herz an der 4 Tage nach cryoinjury (4 DPCI) (D) Die Dunkelfeldbeleuchtung zeigt einen scheibenförmigen Infarkt (gelb gestrichelte Linie). (EF) Cardiomyocyte Marker EGFP und DsRed2 sind nicht im Infarktbereich nachgewiesen, was auf die beschädigte Myokard (eingekreist durch die gestrichelte Linie).

3. Schneiden des Herzens. (A) insgesamt Herzen mit der Zeichnung von Querschnitten von unten des Herzens (1 und 2, rot) in Richtung der Oberseite des Herzens (3 und 4 in grün). (B) Fotografie von einem Objektträger mit der Reihe von aufeinanderfolgenden Querschnitten mit AFOG (Säurefuchsin Orange-G) gefärbt. Die ersten Abschnitte (1 und 2, rote Quadrate) enthalten die Herzspitze, und die letzten Abschnitte des Herzens (3 und 4, grüne Quadrate) umfassen Bulbus arteriosus.

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4. Beispiele der Analyse auf Herz Abschnitte 7 Tage nach cryoinjury durchgeführt. (A) AFOG (Säurefuchsin Orange-G) Färbung Etiketten gesunde Muskelzellen in orange, das Narbengewebe mit Kollagen und Fibrin in blau in rot. (B) In situ-Hybridisierung von ventrikulären Myosin schwere Kette (vmhc) mRNA visualisiert das intakte Myokard (Blau-Färbung). Das verletzte Gewebe ist frei von der kardialen Gentranskript (rot gestrichelte Linie). (C) Immunoassaying von Tropomyosin (grün) beschriftet intakten Herzmuskelzellen und nicht geschädigtem Gewebe (umkreist mit der gestrichelten Linie). DAPI (blau) färbt die Kerne aller Zellen. (D) genetisch markierten Herzmuskelzellen Express DsRed2 (rot) in den Kernen. DAPI (blau) markiert alle Kerne. Die Infarktzone enthält keine DsRed2-positiven Zellen (weiße gestrichelte Linie).

Cryoinjury wird als kontrollierte Beschädigung des Gewebes durch die präzise Anwendung extremer Kälte ¹⁴ definiert. Direkt thermischen Schock zerstört die Zellen durch Proteine ​​zu zerstören und intrazellulärer Flüssigkeit die Bildung von Eiskristallen, die die Plasmamembran zerreißt. Als Folge sterben die verletzten Zellen in den Verfahren der Apoptose und Nekrose ^14. Beide Zelltodmechanismen Es ist gezeigt worden, um Gewebe Verlust nach Myokardinfarkt ¹⁵ beitragen. Somit stellt cryoinjury ein geeignetes Modell zur Induktion einer Herzinfarkt. Mehrere Studien berichteten auch diese Methode erwies sich in verschiedenen Säugetieren, darunter Mäuse, Ratten, Kaninchen und Schweine ^6,7. Die Anpassung des cryoinjury Protokoll im Zebrafisch ermöglicht eine vergleichende Diskussion über den Infarkt Reaktion zwischen verschiedenen Spezies.

Zwei weitere Gruppen, die unabhängig die cryoinjury Verfahren für die erwachsenen Zebrafisch Herz entwickelt. Die Hauptunterschiede sind die surgery Verfahren, die Art der Instrumente und angewendet Gefrierzeit. In der Studie von González-Rosa et al. Wurde der Herzbeutel durch Zerreißen des Gewebes statt Schneiden eröffnet. Sie verwendeten 0,3 mm Kupfer Filament in Verbindung mit einem Polyamid Rohr in flüssigem Stickstoff, um das Herz für einige Sekunden, bis Auftauen könnte ¹⁰ beobachtet wird, einzufrieren vorgekühlt. In der Studie von Schnabel et al., Eine konische Stück Trockeneis von 20 mm Länge mit einer spitz zulaufenden Spitze von 2 mm im Durchmesser wurde verwendet, um das Herz für 10 Sekunden ⁸ zu berühren. Die beiden Gruppen erhalten ventrikulären Schäden durch den Tod des Herzmuskels. Der Vorteil unserer Methode ist eine besser reproduzierbare Ablagerung von Kollagen-reiche Narbe, die besser imitiert die frühen Infarkt heilende Reaktionen in Säugetier-Systemen beobachtet.

Die entscheidender Schritt bei der cryoinjury Verfahren Zebrafisch ist ein Einschnitt durch die Haut und den Herzbeutel ohne Durchstechen der zugrunde liegenden Herzens. Ein richtig performed Chirurgie verursacht wenig Blutungen. Profuse Blutung weist auf eine unbeabsichtigte Punktion des Ventrikels mit der Schere. In solchen Fällen sollten die Tiere aus dem Experiment zurückgezogen werden. Um zu vermeiden, Punktieren des Herzens, sollte der Punkt der Schere in einem flachen Winkel auf die Haut gerichtet sein.

Ein weiterer wichtiger Aspekt für die Erstellung einer reproduzierbare Verletzung ist die genaue Positionierung des kalten Kryosonde auf den Ventrikel für die optimale genaue Dauer. Zu kurz Einfrieren Zeit wird bei der Entzündung mit wenig Zelltod führen. Längere Einfrieren, auf der anderen Seite kann erheblichen Schaden anrichten des Herzens, die eine verstärkte Mortalität der Tiere führen kann. Wir stellten fest, dass der optimale Zeitpunkt, um das Ventrikel in den gefrorenen Zustand im Bereich zwischen 23 bis 26 Sekunden lang für eine 2 cm lang erwachsenen Zebrafisch, und es kann abhängig von der Größe unterscheiden der Tiere.

Weil unser Protokoll ist sehr einfach und schnell, gibt es keinen experimentellen Grenzeations in unterwerfen ausreichende Anzahl von Tieren, um eine angemessene biologische Replikationen zu erhalten. Das kryochirurgische Behandlung wird sehr gut von den Tieren gut vertragen. Sammlung der Herzen zu verschiedenen Zeitpunkten nach cryoinjury ermöglicht detaillierte Charakterisierung der nachfolgenden Phasen während des regenerativen Prozess. Die experimentelle Analyse der cryoinjured Herzen können gehören: 1) Darstellung der Gentranskription durch in situ Hybridisierung, 2) Detektion von Protein Verteilung durch Immunfluoreszenzfärbung, 3) histologischen Bildgebung mit unterschiedlichen Strukturen. Das Verständnis der Schlüssel Heilungsprozesse nach einem Herzinfarkt im Zebrafisch wird Auswirkungen auf den Bereich der Regenerativen Biologie. Darüber hinaus könnte es von Vorteil sein für die Gestaltung neuer therapeutischer Ansätze in der regenerativen Medizin.

Experimentelle Untersuchungen an Tieren wurde von der kantonalen Veterinäramt Freiburg genehmigt worden.

Wir danken V. Zimmermann für hervorragende technische Assistenz und Pflege für die Fische. 310000_120611: Diese Arbeit wurde von der Swiss National Science Foundation, Grant-Nummer unterstützt.

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