Oprettelse Forbigående Cell membranporer Brug en Standard Inkjet printer

Owczarczak, A. B., Shuford, S. O., Wood, S. T., Deitch, S., Dean, D. Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer. J. Vis. Exp. (61), e3681, doi:10.3791/3681 (2012).

Bioprinting har en bred vifte af applikationer og betydning, herunder tissue engineering, direkte celleanvendelsesprogrammer behandlingsformer, og biosensor microfabrication. ^1-10 nylig har termisk inkjet print også blevet anvendt til gen-transfektion. ^8,9 Den termiske inkjet print proces viste sig at midlertidigt afbryde cellemembraner uden at påvirke cellernes levedygtighed. De transiente porer i membranen kan anvendes til at indføre molekyler, som ellers ville være for store til at passere gennem membranen ind i cellecytoplasmaet. ^8,9,11

Ansøgningen bliver vist her, er brugen af ​​termisk inkjet print til inkorporering af fluorescensmærkede G-actin monomerer i celler. Fordelen ved at anvende termisk ink-jet trykning at injicere molekyler i celler er at teknikken er relativt godartede til cellerne. ^{8, 12} Cellelevedygtighed efter trykning er blevet vist at svare til standarden celle plaTing metoder ^1,8. Desuden kan inkjet-trykningsprocessen tusindvis af celler i minutter, som er meget hurtigere end manuel mikroinjektion. Porerne skabt ved trykning er blevet vist at lukke inden cirka to timer. Der er imidlertid en grænse for porestørrelsen oprettede (ca. 10 nm) med denne trykteknik, som begrænser en teknik til indsprøjtning celler med små proteiner og / eller partikler. ^8,9,11

En standard HP DeskJet 500 printer blev modificeret for at muliggøre celle udskrivning. ^{3, 5, 8} Dækningen af printeren blev fjernet, og papirindføringsområdet mekanismen var blevet overhalet indenom ved hjælp af en mekanisk arm. En etape blev oprettet for at muliggøre placering af objektglas og dækglas direkte under printhovedet. Blækpatroner blev åbnet, blæk blev fjernet, og de blev renset før anvendelse med celler. Trykkeriet mønster blev oprettet ved hjælp af standard tegneprogrammet, som derefter kontrolleres printeren via en simpel print kommando. 3T3 fibroblaster blev dyrket til konfluens, trypsiniseret, og derefter resuspenderet i phosphatbufret saltvand med opløselige fluorescensmærkede G-actin-monomerer. Cellesuspensionen blev pipetteret i blækpatronen og linier af celler blev trykt på mikroskop-dækglas. De levende celler blev afbildet under anvendelse af fluorescens-mikroskopi og actin viste sig gennem cytoplasmaet. Inkorporering af fluorescerende actin i cellen mulighed for billeddannelse af kortvarige cytoskeletale dynamik og er nyttig til en lang række applikationer. ^13-15

1. Konvertering HP DeskJet 500

Det skal bemærkes, at denne teknik bør arbejde med mange kommercielt inkjet printere. Men ældre printere tendens til at fungere bedre, da de bruger blækpatroner med større diameter dyser, som ikke tilstoppe så let. Dertil kommer, at ældre printere til at bruge mekaniske fremføringsproblemer sensorer, der er nemmere at omgå. Printere med optiske sensorer kan blive lokket, men med en lille strimmel papir på langt kanten af ​​printeren under hver cyklus, men er en smule sværere end det mekaniske system til "trick". De nuværende kommercielt tilgængelige printere, der fungerer bedst have lav opløsning (DPI).

Højere opløsning printere har tendens til at tilstoppe lettere. Opløsningen af ​​HP Deskjet 500 er 300 DPI. Der er mange kommercielt tilgængelige printere (HP Deskjet serie og andre), som har en opløsning på 600 DPI. Denne type printer kan bruges med kun en lille stigning i dysentilstopning spørgsmål, som kan afhjælpes ved hjælp af omhyggelig rengøring (afsnit 3).

1. Fjern det øverste plast tilfældet med printeren ved at frigøre flere plastklemmer fra bunden bunden af ​​printeren, og langsomt løfte låget.
2. Skru knap / display lys panel fra toppen af ​​printeren, så den er forbundet til printerens motherboard.
3. Rens printeren indvendigt, især de områder, hvor blækpatronen hviler og hvor udskrivningen sker.
4. Find de kabler, der leverer strøm til de fremføringsproblemer mekanismer, og tag dem fra bundkortet.
   1. I HP Deskjet 500, er disse findes lige under papirbakken mod venstre foran.
5. Lokalisere papir detektion mekanisme. Bypass-mekanismen ved at anbringe en snor eller wire loop til at fungere som en manuel pull håndtag.
   1. I HP DeskJet 500, er papiret opdagelse mekanisme, en grå plast håndtag fundet over og bag print / papir foder mekanisme.
6. Skabe en fase foran papirets fødemekanismen (hvor papiret ville blive tilført fra og deponeret) for at bringe de ønskede trykning objektglassene til et niveau lige under patronen printhovedet.
   1. Til vores eksperimenter blev skummet forsendelse holderen i 15 ml centrifugerør anvendes sammen med flere mikroskopobjektglas svejsede på plads i trykning-regionen for at bringe det endelige niveau af objektglassene til den ønskede højde.
7. At opretholde aseptisk teknik, kan printeren være anbragt inde i en standard biologisk fare kabinet eller bordpladen med laminært flow.
8. Det er vigtigt at bemærke, at ændring af et kommercielt tilgængeligt ink-jet printer normalt vil medføre, at printeren producentens garanti.

2. Konvertering Stock HP blækpatroner (HP 26 sort blækpatron)

1. Tag patronen ud af emballagen, så den beskyttende tape dækker printeren kontakter og printhoved til tiden.
2. Stabilisere kroppenaf patronen (sorte del) enten med en klemme eller skruestik (simpelthen fast greb i patronen med hånden sædvanligvis fungerede så godt), mens den grønne øverste tydelig nogen hindring.
3. Hjælp af en tang eller en skruenøgle, fat den grønne top af patronen og drej frem og tilbage flere gange, indtil den bryder fri.
   1. Dette bør ikke tage meget kraft, men toppen er ikke længere nødvendigt, så det er okay, hvis det bryder, når du fjerner det.
4. Ved hjælp af skruetrækkere, lirke det klare plastik stykket nu udsat.
   1. Igen bør det ikke tage meget kraft, men det vil ikke være nødvendigt, så det er okay, hvis det bryder under fjernelse.
5. Tømme enhver resterende fra reservoiret.
6. Fjern plastik beskyttende tape dækker printeren kontakter og printhoved.
7. Skyl grundigt reservoirer med vand.
   1. Anvende en pipette eller en sprøjte til at skubbe vand gennem kanalerne.
   2. Vand vil sandsynligvis sive fra printhovedet underdenne proces, hvilket er acceptabelt, og ikke forårsager nogen skade på funktionaliteten af ​​patronen.
8. Når vandet er klart, lad patronen tørre.

3. Rengøring Blækpatron

1. For at opretholde et rent printmiljø, skal blækpatronen skal rengøres før og efter brug.
   1. Dette hjælper også med at undgå krystallisation af salte og andre biologisk materiale i patronen, som kan forårsage tilstopning.
2. Fuldt nedsænkes patronen i et bægerglas fyldt med deioniseret vand og sonikeres i 15 minutter før og efter trykning.
3. Efter sonikering, fjerne patronen fra vandet, og ryst overskydende vand.
4. Spray 70% ethanol i patronen for at skabe et mere aseptisk miljø.
   1. Sørg for, at ethanol er tørret, før du tilføjer bioink printløsning.

4. Gør Cell Suspension - "Bioblæk "

1. Kultur celler, indtil klar til passage.
   1. For 3T3-fibroblaster: frø celler med T-75 kolber ved ca 1.3x10 ⁴ celler / cm ² i Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS). Dyrkning af celler i to dage i en inkubator ved 37 ° C og _5% CO2.
2. Gør fluorescerende G-actin stamopløsning i en koncentration 50 ug / ml i phosphatbufferopløsning (PBS).
3. Passage-celler.
   1. For 3T3 fibroblaster: Fjern medier fra kolben og skylles to gange med PBS. Omfatte celler med 5 ml 0,25% trypsin + EDTA og inkuberes i 5 minutter.
   2. Tilsættes 5 ml frisk medium og pipetteres den cellesuspension i en 15 ml konisk centrifugerør og centrifugeres ved 1000 rpm i 5 min. Aspirer brugt medium.
4. Resuspender cellerne i PBS med fluorescerende g-actin stamopløsning at skabe bioink.
   1. Bioink bør have en slutkoncentration pÃ¥ G-actin pÃ¥ 10 ug / ml og en celle concentration af 1x10 ⁵ celler / ml. Denne koncentration er blevet optimeret til at begrænse mængden af celler pr drop og tilstopning af printerhovedet. ⁸
   2. Bemærk, at 250 pi bioink udskriver tre dækglas med mønsteret i figur 2 viste.

5. Bioprinting

1. Tænd og lad printeren varmer op.
2. Placer den ønskede udskrivning overflade (her, vi bruger 22 mm x 22 mm dækglas) på midten af ​​scenen forberedt i trin 1,6.
3. Opret en udskrivning mønster fil.
   1. Åbn Microsoft Word (eller enhver anden tegning software), og tegne det ønskede mønster.
   2. Vælg et ønsket print mønster for celle udskrivning i premade filen.
4. Indlæse fremstillede patronen med ønskede celle suspension.
   1. Pipetten suspension ind i de små cirkulære og i bunden af ​​patronen rum. Brug cirka 100-120 ml af opløsningen. Den trykte dråbestørrelse er ca 130picoliter ^8.
5. Udskriv filen med HP Deskjet 500 printer.
   1. For de bedste resultater, udskrive mindre mønstre flere gange (5), ved at ændre antallet af kopier ønskede i tekstbehandlingsprogrammet.
6. Printeren vil varme op igen, så patron vil flytte til "klar position".
7. Når patron bevæger sig ind i klar position (lidt til venstre for blæk dryp godt stykke under og bliver der), træk op på papiret fødemekanismen wire, og udskrivning skal begynde.
   1. For flere kopier af udskrivning, vil papiret fødemekanisme nødt til at blive frigivet efter hver cyklus eller udskrevet. Patronen vil derefter vende tilbage til "klar" position, og papiret fødemekanismen wire bør hæves igen.
8. Printeren udskriver på dækglasset placeret på midten af trykning scenen i trin 5,2 (se figur 2).

6. Repræsentative resultater </ P>

De repræsentative resultater af hele omdannelsen af ​​en standard, off-the-shelf HP Deskjet 500, vil standard HP 26 serien patroner oprette en printer med mulighed for udskrivning-løsninger til mange typer af analyser som anført før. Det færdige printer efter omdannelse er vist i figur 3, med et trykkeri trin at placere mikroskopet dækglasset på. Printeren kan være nyttige i analyser på mange områder, herunder men ikke begrænset til: encellede mekanik, vævsteknologi, gen-transfektion biosensor micropatterning og direkte celleterapier ^{1-10, 16-22.}

I dette eksempel blev en HP Deskjet 500 printer og HP 26 blækpatroner modificeret til bioprinting. Ved hjælp af denne printer opsætning med en bioink bestående af en fibroblast cellesuspension i en G-actin monomeropløsning blev cellerne trykt på mikroskop-dækglas. Figur 1 illustrerer repræsentative res ÜLTS af trykte fibroblastceller, som viser inkorporeret fluorescerende actinmonomerer. De resultater blev opnået i et kontrolleret aseptisk miljø, i hvilket cellerne er blevet trykt i tilpasses mønstre.

Mønsteret anvendt i dette eksempel blev skabt i Microsoft Word (figur 2). Dette mønster skabt en kontinuerlig linie af det trykte opløsningen over størstedelen af mikroskopobjektglasset. Figur 4 viser den lige linie, hvor bioink og cellerne indbyrdes deponeret. Det skal bemærkes, at umiddelbart efter trykning, er der en stigning i baggrundsfluorescens fordi bioink opløsning, hvori cellerne suspenderes indeholder frie overskydende fluorescerende actinmonomerer. Dette baggrundsfluorescens signifikant nedsætter efter tilsætning af vækstmedier på cellerne (figur 1), som vasker overskydende monomer fra substratet.

ad/3681/3681fig1.jpg "/>
Figur 1. Repræsentative billeder af 3T3 fibroblaster 3 timer efter trykning anvendelse af den modificerede inkjet printer. Det indre af cellerne udviser inkorporeret fluorescens mærkede actinmonomerer. Målestoksforhold udgør 50 pm.

Figur 2. Design bruges til at udskrive bioink.

Figur 3. Printer efter konvertering med Styrofoam scenen. Den orange ledning i midten omfartsveje til papirfremføring håndtaget sensor.

Figur 4. Repræsentativt billede af 3T3 fibroblaster trykt i en lokaliseret tryk zone. Mikroskopi billede taget 5 minutter efter udskrivning på 20x forstørrelse.

/ Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg "/>
Figur 5. Fluorescens billede (40x forstørrelse) taget 3 timer efter trykning viser en fibroblast med internaliserede fluorescerende actinmonomerer. Målestokken repræsenterer 50 um.

Figur 6. Fluorescensmikroskopi (20x forstørrelse) af en celle taget 15 minutter efter trykning. Billedet viser både g-actin (grøn) og kernen (blå). Fra venstre til højre: G-actin med Alexa Fluor 488, kerne med DAPI, og en overlejring af begge.

Figur 7. Fluorescensmikroskopi viser to fibroblaster i et liniemønster 3 timer efter trykning. Billedet på venstre viser fluorescensmærkede actinmonomerer inde celler. Billedet til højre er en overlejring af den fluorescerende kanal med baggrundsbilledet for at vise, at selv omkan der være nogen rester på objektglasset (nederste venstre hjørne), er det ikke fluorescerer. Målestoksforhold udgør 50 um, hvis størrelse ikke er angivet yderst til højre er en kontrolgruppe af ikke-trykte celler inkuberet i 3 timer med fluorescens mærkede monomerer. Denne kontrol er at vise, at monomererne kan ikke gennemtrænge cellemembranen uden membranpermeabilisering ved celle trykning.

Den proces for at omdanne en almindelig inkjet desktop printer til bioprinting er ikke specielt svært. Det mest udfordrende skridt er at bestemme hvordan man kan omgå den papirindføring mekanisme, der er afhængig af mærke og anvendte model af printer. Dette er imidlertid relativt enkel, når papiret foderet sensoren er mekanisk som beskrevet her. For modeller med optiske foder sensorer, kan andre teknikker skal anvendes til at narre printeren til at tro, det er ved hjælp af papir, for eksempel, kan man køre et lille stykke papir gennem printeren, mens den udskriver på objektglasset. Omgåelse af papirindføring mekanisme er sandsynligvis den sværeste skridt i anvendelsen af ​​disse procedurer til forskellige printermodeller.

Ved konstruktionen af ​​trin til at holde dækglassene til trykning, er det vigtigt at sikre korrekt opretning og højde. Scenen bør tillade dækglas placeres i midten af ​​trykområdet. Desuden bør det ples dækglasset i en passende højde for at give plads til printerpatronen at passere over det dias uden at forstyrre det. Den nøjagtige højde af trin vil afhænge af printermodellen.

At sikre, at trykte celler ikke blive vasket væk, blev objektglassene anbragt i en inkubator umiddelbart efter trykning i cirka 30 minutter for at tillade cellebinding før yderligere cellevækstmedier blev tilsat. Fordi cellerne blev trykt i en opløsning, der indeholder store mængder af PBS cellerne ikke tørrer ud og forblev levedygtige. Cellerne blev afbildet under anvendelse fluorescensmikroskopi for at visualisere fordelingen af de mærkede g-actinmonomerer inde i cellen (fig. 1 og 5-7). Ved udskrivning med 3T3-fibroblaster, figur 5 viser et repræsentativt resultat med actin forårsager meget af cellen til at fluorescere, men fremvisning linier forøget lysstyrke. Inkorporeringen af ​​fluorescens mærket G-actin i cytoskelettet ernyttige til undersøgelse af cytoskeletale dynamik og cellulære mekanik. ^12-15 En begrænsning ved denne teknik er, at det kun er anvendelig til molekyler og proteiner, der har diametre mindre end cirka 10 nm.

At sikre, at celler faktisk blev der behandles af den konverterede printeren blev DAPI (1:5000 i PBS) tilsat til bioink i stedet for halvdelen af ​​volumenet af ren PBS. Den fluorescerende plet DAPI binder til aminosyre rige portioner DNA placeret i kernen. Derfor DAPI er et nyttigt pletten i fluorescens billeddannelse kerner af de trykte celler. Figur 6 viser et repræsentativt billede af en celle viser både Alexa Fluor 488 (actin) og DAPI (kerne) fluorescens med en overlejring billede af begge. Figur 7 viser også, hvordan Cellerne vil fluorescere, når G-actinmonomerer er blevet inkorporeret, mens ikke-biologisk materiale, som er blevet deponeret i prøven ikke vil fluorescere på grund af absence af g-actinmonomerer.

En vigtig overvejelse for bioprinting er de vandige medier, der anvendes til bioink. Det blev konstateret, at ved anvendelse af standard cellevækstmedier med serum givet inkonsistente resultater. Dette er sandsynligvis på grund af tilstopning af skrivehovedet dyser ved serumproteiner. Anvendelse af PBS forøgede ensartethed af trykte mønstre og antallet af celler deponeret. En ulempe ved anvendelse af PBS, er, at cellerne ikke skal efterlades i suspension i længere tid. Imidlertid fibroblaster i disse eksempler var i stand til at tolerere bioink betingelser i mindst en time uden ændring i cellelevedygtighed. Dette er i overensstemmelse med adskillige tidligere resultater, som rapporterer, at celler trykte via termiske inkjet mekanismer er blevet vist at have høj spiredygtighed hastigheder. ^2-8

Dette ændrede printer opsætning kan bruges til andre formÃ¥l end celle udskrivning. ^16-22 Matrix proteiner, sÃ¥som collagen eller fibronectin, kan let trykkes pÃ¥ substrater med denne teknik, som kan være nyttige til celle mønsterdannelse. For eksempel collagen type I printet ind liniemønstre vil resultere i linie collagensubstrater der kan anvendes til in vitro cellekultur undersøgelser. ^{17 Foruden} matrixproteiner og andre molekyler, herunder vækstfaktorer, kan pÃ¥lideligt lokaliseret pÃ¥ substrater for celle undersøgelser og potentielle terapeutiske anvendelser. ¹⁸

En væsentlig begrænsning af konstruktionen er beskrevet i de ovennævnte trin er, at denne printer ikke er i stand til at udskrive mere end én dimension. Dette begrænser mulighederne for at nyttiggøre i mønstrede applikationer såsom stillads udskrivning. For at muliggøre 3D trykning, en specialiseret trin skal anvendes. Scenen skal have enkeltprøver højdejusteringer af lag-på-lag aflejring af bioink.

Bioprinting har vist sig lovende som en effektiv og omkostningseffektiv metode til vævsmanipulering, Gentransfektion, micropatterning og microarray fabrikation ^{1-12, 16-22} De fremtidige anvendelser af denne type udstyr er talrige, herunder:. Oprettelse af kontrollerede og mønstrede cellulære mikromiljøer, inkorporering af makromolekyler i cellen cytoplasma, og deposition af celler på stilladser og strukturer, der ikke forekommer naturligt eller effektivt.

Vi har intet at afsløre.

Forfatterne vil gerne takke Dr. Thomas Boland for tanken om at bruge HP DeskJet printere til celle udskrivning. Finansieringen af ​​dette projekt fra NSF RII-EPS 0903795 og NIH K25 HL0922280.

1. Calvert, P. Materials science. Printing cells. Science. 318 (5848), 208-209 (2007).
2. Mironov, V., Reis, & Derby, B. Review: Bioprinting: A beginning. Tissue Eng. 12 (4), 631-634 (2006).
3. Pepper, M.E., Parzel, C.A., Burg, T., Boland, T., Burg, K.J.L., & Groff, R.E. Design and Implementation of a two-dimensional inkjet bioprinter. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 3-6, 6001-6005 (2009).
4. Campbell, P. & Weiss, L. Tissue engineering with the aid of inkjet printers. Expert Opin. Biol. Th. 7 (8), 1123-1127 (2007).
5. Boland, T., Xu, T., Damon, B., & Cui, X. Application of inkjet printing to tissue engineering. Biotechnol. J. 1 (9), 910-917 (2006).
6. Mironov, V., Prestwich, G., & Forgacs, G. Bioprinting Living Structures. J. Mater. Chem. 17 (20), 2054-2060 (2007).
7. Xu, T., Rohozinski, J., Zhao, W., Moorefield, E.C., Atala, A., & Yoo, J.J. Inkjet-mediated gene transfection into living cells combined with targeted delivery. Tissue Eng. Part A. 15 (1), 95-101 (2009).
8. Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z., & Boland, T. Cell Damage Evaluation of Thermal Inkjet Printed Chinese Hamster Ovary Cells. Biotechnol. Bioeng. 106 (6), 963-969 (2010).
9. Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., & Bosserhoff, A.K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8 (2), 235-245 (2002).
10. Saunders, R. & Derby, B. Bioprinting, Inkjet Deposition. Encyclopedia of Industrial Biotechnology: Bioprocess, Bioseparation, and Cell Technology. John Wiley & Sons, 15 April 2010.
11. Prabha, S., Zhou, W., Panyam, J., & Labhasetwar, V. Size-dependency of nanoparticle mediated gene transfection: studies with fractioned nanoparticles. Int. J. Pharm. 244 (1-2), 105-115 (2002).
12. Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18 (47), 5717-5721 (2008).
13. Apodaca, G. Endocytic Traffic in Polarized Epithelial Cells: Role of Actin and microtubule Cytoskeleton. Traffic. 2 (3), 149-159 (2001).
14. Hotulainen, P., Llano, O., Smirnov, S., Tanhuanpää, K., Faix, G., Rivera, C., & Lappalainen, P. Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis. J. Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).
15. Allen, P.G. Actin filament uncapping localizes to ruffling lamellaw and rocketing vesicles. Nat Cell Biol. 5 (11), 972-979 (2003).
16. Cooper, G.M., Miller, E.D., Desesare, G.E., Usas, A., Lensie, E.L., Bykowski, M.R., Huard, J., Weiss, L.E., Losee, J.E., & Campbell, P.G. Inkjet-based biopatterning of bone morphogenetic protein-2 to spatially control calvarial bone formation. Tissue Eng. Part A. 16 (5), 1749-1759 (2010).
17. Deitch, S., Kunkle, C., Cui, X., Boland, T., & Dean, D., Collagen matrix alignment using inkjet printer technology, Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1094 (DD), 7-16 (2008).
18. Ilkhanizadeh, S., Teixeira, A., & Hermanson, O. Inkjet printing of macromolecules on hydrogels to steer neural stem cell differentiation. Biomaterials. 28 (27), 3936-3943 (2007).
19. Ringeisen, B.R., Orthon, C.M., Barron, J.A., Young, D., & Sparago, B.J. Jet-based methods to print living cells. Biotechnol. J. 1 (9), 930-948 (2006).
20. Cui, X. & Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30 (31), 6221-6227 (2009).
21. Langer, R. & Vacanti, J.P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
22. Okamoto, T., Suzuki, T., & Yamamoto, N. Microarray fabrication with covalent attatchment of DNA using Bubble Jet technology. Nature Biotechnol. 18 (4), 438-441 (2000).

6 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.