איתור של טרנסלוקציה רעלן לתוך Cytosol המארח ידי plasmon משטח תהודה

1. הכנת digitonin

1. הוספת 500 μL של אתנול 100% צינור microcentrifuge ולמקם אותו בתוך גוש חום נקבע על 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
2. ממיסים 2.5 מ"ג digitonin ב 250 μL של אתנול המחומם לייצר פתרון המניה 1% digitonin.
3. כדי ליצור פתרון העבודה של digitonin 0.04%, להוסיף 40 μL הפתרון מניות digitonin כדי μL 960 של HCN חיץ (50 mM Hepes pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 מ"מ CaCl _2, 10 mM N-ethylmaleimide, וכן מעכבי פרוטאז קוקטייל).

2. תא שיכרון ו permeabilization

Assay טרנסלוקציה שלנו יכול להיות מיושם על מגוון רחב של רעלנים שורות תאים. להלן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לצורך זיהוי של רעלן הכולרה (CT). סקירה של ההליך ניתן באיור 1.

1. תאים הלה הם זורעים ב 6 גם צלחות המכילות 1 מ"ל DMEM בתוספת 10% עוברית שור בסרום לאנטיביוטיקה antimycoticכדי להשיג את 1x10 ⁶ תאים / גם לאחר דגירה לילה בשעה 37 ° C. כדי לייצר רעלן cytosolic מספיק לגילוי לשחזור, בארות בשלושה עותקים נדרשים עבור כל תנאי.
2. לאחר דגירה של לילה, להחליף את התרבות בינוני עם 1 מ"ל DMEM המכיל 100 ng / mL של ganglioside GM1. זה מגדיל את מספר אתרי קישור ה-CT, כאשר הקולטן של GM1 CT יהיה intercalate לתוך קרום הפלזמה של תאים חשופים פתרון של GM1.
3. לאחר דגירה 1 שעה בשעה 37 ° C, להסיר את המדיום GM1 המכילים לשטוף את התאים פעמיים עם DMEM. ואז, במקום תאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב 1 מ"ל DMEM המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של ה-CT.
4. הסר את בינוני המכיל רעלן, לשטוף את התאים פעמיים עם DMEM ו דגירה התאים 1 מ"ל DMEM על 37 מעלות צלזיוס למשך פרק הזמן הרצוי (ים).
5. בסוף כל תקופה מרדף, לשטוף את התאים עם PBS ו דגירה כל טוב עם 250 μL של 0.5 mM EDTA ב PBS. בואו התאים לשבת 10 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להסיר אותם מהצלחת 6-היטב על ידי טחינה דקה נמרצת עם pipetman p1000. אחרי אחד טוב של תאים נאסף, לשלב את זה עם השני והשלישי אז גם מאותו מצב. מגרדים תאים יכול לשמש גם כדי לאסוף את התאים.
6. מניחים את ההשעיה תא משולב משלוש בארות לשכפל (750 הנפח הכולל μL) בצינור microcentrifuge אחת, לסובב אותו microcentrifuge השולחן במשך 5 דקות ב 5000 x ז כדורי נייד בגודל שווה בערך יש לקבל את כל התנאים.
7. בטל supernatant ו resuspend התא גלולה ב 100 μL של הפתרון עובד 0.04% digitonin. מניחים את ההשעיה התא על קרח דק 10.
8. ספין התאים digitonin permeabilized ב-XG 16,000 עבור 10 דקות ב microcentrifuge השולחן. העברת חלק cytosol המכילים supernatant לצינור microcentrifuge טריים, לשמור על חלק אברון המכיל גלולה.

1. Cytosol המכילים שברים supernatant הם מדולל במאגר HCN לנפח סופי של 1 מ"ל. כרכים מדגם של 1 מ"ל לפחות נחוצים כדי להבטיח אוויר מטוהר מן לולאה 500 המדגם μL לפני ההזרקה.
2. אברון המכיל שברים גלולה הם resuspended ב 1 מ"ל של חיץ HCN המכיל 1% טריטון X-100. תוספת של חומר ניקוי יש צורך לשחרר את הבריכה עטוף קרום של הרעלן.
3. סטנדרטים רעלן בריכוזים של 100, 10, 1, 0.1 ng / mL ערוכים חיץ HCN.
4. סטים מקבילים של שברים cytosolic ו אברון מוכנים לניסוי בקרה כדי לאשר את אמינות ההליך חלוקה. שברים שנוצרו כמתואר בסעיף 2 הם resuspended ב 20 μL של חיץ מדגם 4x (חלק cytosolic) או 120 μL של חיץ 1x המדגם (חלק אברון). כרכים שווה כל שבריר של נפתרות על ידי אלקטרופורזה dodecyl נתרן סולפט polyacrylamide ג'ל נחקר בy ניתוח המערבי כתם כדי להדגים את מחיצות של חלבון cytosolic בשבריר supernatant ו מסיסים, תושב חלבון ER בשבריר גלולה ^16-19.

4. SPR הכנת שקופית

1. SR7000 רייכרט SPR Refractometer משמש ניסויים SPR.
2. סט שקופיות זכוכית מצופה זהב עם monolayer עצמית התאספו במכשיר SPR. כדי להפעיל את השקופית חיישן, perfuse (v: v) 01:01 פתרון של 0.4 M ו EDC 0.1 NHS M על המגלשה במשך 10 דקות בקצב זרימת μL 41 / min. כל perfusions הבאות ישתמשו את קצב הזרימה אותו.
3. כדי להסיר את EDC: מאגר NHS ההפעלה, לשטוף את הצלחת 5 דקות עם PBS המכיל 0.05% Tween 20 (PBST). צלחת כרגע מכיל רצועות אמיד תגובתי עקב פתחה את המיכסה על ידי EDC: פתרון NHS.
4. Perfuse נוגדן אנטי CTA מעל להחליק את חיישן מופעל על דילול של 1:20,000 ב 20 מ"מ נתרן אצטט (pH 5.5) במשך 15 דקות. ירידה ראשונית השבירה בדקס יחידה (Riu) יראו עקב שינוי ה-pH. זה יהיה ואחריו עלייה Riu כמו הנוגדן הוא נתפס על ידי אמיד-reactive רצועות בשקופית חיישן.
5. הסר נוגדן מאוגד משקופית החיישן עם לשטוף PBST 5 דקות. האות Riu המיוצר על ידי הנוגדן שנתפסו הרמה ולייצב, יהיה מתן אות ההתחלה החדשה.
6. Perfuse 1 M ethanolamine (pH 8.5) על המגלשה חיישן 5 דקות. זה כובעים inactivates כל רצועות מאוגד שמאל בשקופית חיישן.

5. SPR ניתוח של דגימות

1. כדי ליצור קריאת המחקר, PBST perfuse על חיישן נוגדן מצופה דקות 5.
2. Perfuse מדגם ניסיוני או תקן הרעלן על החיישן עבור 300 שניות. הסר את ליגנד מתוך המאגר ואת PBST perfuse מעל החיישן למשך 200 שניות.
3. בעקבות כל זלוף, רעלן מחויב יוסר החיישן על ידי לשטוף שנייה עם 100 PBST ב-pH 5.0. זה יחזיר את האותלקריאת המחקר הראשוני שלה, ובכך מאפשר דוגמה נוספת להיות מעובד על חיישן זהה.
4. לפני טעינת מדגם חדש, לדחוף כמות קטנה של אוויר דרך הלולאה מדגם לגרש כל נוזל שיורי מן המדגם מראש. באמצעות ההליך המתואר 5.2-5.4, יש לנו להפעיל עד 12 דגימות בשקופית אחד ללא איבוד משמעותי של אות הבסיס.
5. ניתוח הנתונים מבוצע עם התוכנה המטהר 2, ואת תוכנת איגור משמש להכנת דמות.

6. נציג תוצאות

רעלן שעלת (PT) הוא רעלן א.ב. שזז מתא השטח למיון לפני שרשרת (PTS1) שלה נכנס cytosol ^{3, 12.} כפי שניתן לראות בתרשים 2, assay SPR מבוססי שלנו יכולה לזהות טרנסלוקציה PTS1 ב cytosol של תאים CHO שיכורים. האות לא נוצר מתוך cytosol של תאים unintoxicated, אשר אישרו את הנוגדן אנטי PTS1 לא חוצה להגיב עם מרכיב של cytosol המארח.חלק מתאי cytosolic שיכורים בנוכחות brefeldin (BFA) גם הצליחו לייצר איתות חיובי. BFA מונע תחבורה רעלן לאתר טרנסלוקציה ER ^{6-8, 12, 20-25,} ולכן אספקת שרשרת cytosol. בסוף כל סיבוב, מחויב הוא רעלן הפשיטו משקופית החיישן. זה מספר דגימות מותר להיות מוקרן בשקופית חיישן יחיד ובכך סיפק השוואה ישירה בין התוצאות המתקבלות עם תנאי הניסוי השונים.

CT הוא עוד סוג AB, ER-translocating רעלן ^4. בשנת איור 3A, CTA1 זוהה השבר cytosolic מ CT שטופלו בתאים הלה. זה הדגיש כי המתודולוגיה שלנו עובדת עם סוגי תאים מרובים יכול להיות מיושם על כל רעלן עבורו אנטי נוגדנים שרשרת זמין. האות לא זוהה כאשר חלק מן ה-CT cytosolic שטופלו בתאים היה perfused על חיישן SPR מצופה נוגדן אנטי CTB (איור 3B), ובכך הוכחת כי CTA1למקטע אך לא את תא מחייב CTB pentamer נכנס cytosol. איור 3C מראה את האות השבר אברון כבוי בקנה מידה בהשוואה האות החלש מתוך השבר cytosolic. זה עולה בקנה אחד עם היעילות הידועה של CT התחבורה לאתר טרנסלוקציה ER ^{6, 7,} אשר בתורו מגביל את כמות הרעלן שיכולים להגיע cytosol. יתר על כן, חלק אברון מכיל holotoxin CT וכן ER-CTA1 מקומי, כך האות וכתוצאה מכך SPR לשבריר אברון הוא מנופח על ידי המסה נוספת של holotoxin הקשורים CTB pentamer. לפיכך, אין זה מעשי העלילה נתוני שברים אברון ו cytosolic על sensorgram זהה.

Assay שלנו יכולים לעקוב אחר הצטברות תלוי זמן של הרעלן, translocated cytosolic (איור 4). תאים שנחשפו CT ב 4 מעלות צלזיוס, טמפרטורה המאפשרת רעלן מחייב קרום הפלזמה אבל מונע הפנמה של הרעלן לתא הקשורים. לאחר רמוval של הרעלן מאוגד, התאים היו חימם עד 37 ° C. שתי תחבורה רעלן לחדר המיון ו טרנסלוקציה שרשרת cytosol יכול להתרחש בטמפרטורה זו. הרעלן לא זוהה ב 15 הדקות cytosol אחרי ההתחממות על 37 ° C. זה שיקף את זמן השהיה נדרש סחר (i) holotoxin לחדר המיון (ii) ניתוק / B למקטע בחדר המיון, וכן (iii) לייצא שרשרת cytosol. בריכת קטין של הרעלן cytosolic זוהה לאחר 30 דקות 37 ° C, וכמויות גדולות של הרעלן בהדרגה cytosolic התגלו לאחר 45 ו - 60 דקות intervals מרדף. רמות אפילו גדול יותר של הרעלן cytosolic התגלו לאחר הפסקה מרדף 5 שעה ^17, ובכך הוכחת מתמשך, לטווח ארוך משלוח של הרעלן לתא הקשורים ל cytosol המארח.

Assay שלנו יכול גם לזהות את עיכוב טרנסלוקציה רעלן את cytosol (איור 5). תאים שטופלו sulfoxide דימתיל 10% (DMSO), המלווה כימי המונע disord תרמיתering של למקטע CTA1 מבודדים (ט 'ו ק' Teter בנרג'י, תצפיות לא פורסם), הפגינו רמות נמוכות של CTA1 cytosolic בהשוואה לתאי קבוצת הביקורת. התגלגלות של הרעלן השרשרת היא תנאי הכרחי טרנסלוקציה את cytosol ^16-18, כך ייצוב DMSO-Induced של CTA1 בהתאם מנעו תנועה שלה ER כדי cytosol.

שיעור העמותה קבוע (k) מחושבת מניסויים SPR עומד ביחס ישר לריכוז של ליגנד במאגר זלוף ^{14, 15, 26.} לפיכך, ניתן לקבוע את ריכוז הרעלן cytosolic מן הגרף כי המגרשים k _ערכים סטנדרטים רעלן כפונקציה של ריכוז הרעלן. הליך זה נעשה שימוש כדי לכמת את גוש DMSO-Induced של טרנסלוקציה רעלן שהוצגו איור 5: עקומת סטנדרט שנוצר בריכוזים ידועים של הרעלן היה בשימוש כדי לחשב cytosolic CTA1 concentratיון של 0.3 ng / mL עבור בתאים שלא טופלו ו 0.1 ng / mL עבור DMSO שטופלו בתאים (איור 6). עיכוב של התגלגלות CTA1 ידי DMSO ובכך יצר הפחתה של פי 3 טרנסלוקציה ל-ER cytosol של CTA1.

1. איור פרוטוקול סקירה. (א) תאים מודגרת עם הרעלן AB ב 4 מעלות צלזיוס, טמפרטורה המאפשרת רעלן מחייב פני התא, אך מונע אנדוציטוזה הרעלן. תת יחידות A ו-B של הרעלן מיוצגים על ידי עיגולים אדומים וכחולים, בהתאמה. (ב) רעלן מאוגד יוסר המדיום, ותאי הם חיממו על 37 מעלות צלזיוס על מנת לקדם את התחבורה ואת מדרדר אנדוציטוזה של holotoxin למיון. Holotoxin דיסוציאציה מתרחשת בחדר המיון, אשר מאפשר בשרשרת מבודדת להיכנס cytosol על ידי עובר דרך ערוץ חלבונים ביצוע (ים) בקרום ER. (ג) תאים מטופלים עם digitonin כדי סלקטיבי permeabilize פלזמהקרום. (ד) צנטריפוגה משמש לחלוקת תאים לתוך שברים cytosolic ו אברון נפרד. Cytosol הוא סחט של התא דרך digitonin שנוצר הנקבוביות והוא ממוקם supernatant. שלם, קרום הנכנס אברונים נמצאים השבר גלולה. (ה) כדי לזהות את הבריכה translocated שרשרת רעלן בתוך cytosol המארח, השבר הוא supernatant perfused על חיישן SPR מצופה נוגדן אנטי-A שרשרת.

באיור 2. איתור של טרנסלוקציה PTS1 לתוך cytosol המארח. בתאי CHO היו הדופק שכותרתו ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של PT. התאים היו רדפו אז עבור 37 שעות 3 מעלות צלזיוס רעלן ללא בינוני המכיל אין תוספות (שיכורים) או 5 מיקרוגרם BFA / mL (+ BFA שיכורים). Permeabilization של קרום הפלזמה עם digitonin שימש מחיצה בתוך התא תמציות אברון נפרד cytosolic fractiתוספות. חיישן SPR מצופה נוגדן אנטי PTS1 נעשה שימוש כדי לאתר את הבריכה cytosolic של PTS1 מ בתאים שלא טופלו או שטופלו BFA. PTS1 הסטנדרטים היו perfused מעל החיישן כפקדי חיובי, בעוד חלק מן התאים cytosolic unintoxicated היה perfused על המגלשה חיישן כביקורת שלילית. בסוף כל סיבוב, מדגם מחויב הופשט משקופית החיישן.

באיור 3. איתור של טרנסלוקציה CTA1 לתוך cytosol המארח. תאים הלה הדופק שכותרתו ב 4 ° C עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של CT נרדפו במשך שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס רעלן ללא בינוני המכיל אין תוספות (שיכורים) או 5 מיקרוגרם BFA / mL (+ BFA שיכורים). Permeabilization של קרום הפלזמה עם digitonin שימש מחיצה בתוך התא תמציות אברון נפרד שברים cytosolic. (א) שברים cytosolic היו perfused על חיישן SPR מצופה נוגדן אנטי CTA. ידועכמויות של CTA שימשו שולטת חיובי, בעוד cytosol מתאי unintoxicated שימשה כביקורת שלילית. (ב) חלק cytosolic מתאי שיכורים בהעדר BFA היה perfused על חיישן SPR מצופה נוגדן אנטי CTB. CTB מטוהרים pentamer היה perfused על המגלשה כביקורת חיובית. (ג) חלק אברון היה solubilized עם 1% טריטון X-100 לפני זלוף על חיישן SPR מצופה נוגדן אנטי CTA. לצורך ההשוואה, השבר cytosolic (1 מ"ל נפח סופי) מ לחלץ את אותו התא ורמת CTA היו perfused גם על החיישן. עבור כל לוחות, מדגם מחויב הופשט מחיישן בסוף כל סיבוב.

איור 4. קינטיקה של כניסה לתוך CTA1 cytosol. הלה תאים הדופק שכותרתו ב 4 ° C עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של CT נרדפו במשך 15, 30, 45 או 60 דקות ב 37 מעלות ללא הרעלן mediuמ ' כדי לזהות את הבריכה translocated של הרעלן, שברים cytosolic מ digitonin-permeabilized התאים היו perfused על חיישן SPR מצופה נוגדן אנטי CTA. סטנדרטים CTA היו perfused על החיישן גם. בסוף כל סיבוב, מדגם מחויב הופשט משקופית החיישן.

איור 5. עיכוב של טרנסלוקציה CTA1 ידי DMSO. תאים הלה הדופק שכותרתו ב 4 ° C עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של CT נרדפו במשך שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס רעלן ללא בינוני המכיל אין תוספות (שיכורים) או DMSO 10% (+ DMSO שיכורים). כדי לזהות את הבריכה translocated של הרעלן, שברים cytosolic מ digitonin-permeabilized התאים היו perfused על חיישן SPR מצופה נוגדן אנטי CTA. CTA סטנדרטים (100, 10, 1, ו - 0.1 נ"ג / מ"ל) היו perfused מעל החיישן כפקדי חיובי, רק 1 ו - 0.1 ng / mL סטנדרטים מוצגות למטרות דרוג. Cytosol מ unintoxicateתאים ד שימשה כביקורת שלילית. בסוף כל סיבוב, מדגם מחויב הופשט משקופית החיישן.

איור 6. חישוב CTA1 cytosolic. K ערכים עבור סטנדרטים CTA מ איור 5 היו זממו כפונקציה של ריכוז הרעלן. עקומת תקן וכתוצאה מכך נעשה שימוש כדי לקבוע, על סמך k _ערכים של דגימות מן הניסוי איור 5, ריכוז CTA1 cytosolic בתאים שלא טופלו ו DMSO שטופלו. סטנדרטים רעלן מוצגים כעיגולים מלא; cytosol מטופל מוצג מרובע פתוח, ואת cytosol DMSO שטופלו מוצג מעגל פתוח. ממוצעים ± טווחים של שני ניסויים בלתי תלויים מוצגים.

השוואה המתודולוגיה הקיימת

Assay SPR מבוססי שלנו טרנסלוקציה מייצג שיטה מהירה, רגיש, כמותי כדי לזהות משלוח רעלן לתוך cytosol המארח. הטכניקה אינה דורשת radiolabeling או שינויים אחרים הרעלן, וזה יכול להיות מיושם על כל רעלן עבורו אנטי רעלן נוגדנים שרשרת זמין. השיטות הקיימות כדי לפקח על המעבר רעלן לתוך cytosol גם לסמוך על פרוטוקול חלוקה subcellular לתא תמציות לתוך cytosol מחיצה נפרדת שברים קרום ^{11, 23, 27, 28.} שיטות אלה להשתמש כתם המערבי או radiolabels לזהות את הבריכה cytosolic של הרעלן. הגישה לשעבר וכמותיות במקרה הטוב, סובל רגישות נמוכה יחסית. גם פרוטוקולים radiolabeling יכול לקחת שבועות כדי ליצור תוצאה, בשל רמות נמוכות של רעלן אשר מגיעים cytosol. אמנם ניתוח כמותי עם רעלן radiolabeled יכול לקבוע את האחוז היחסישל הרעלן לתא הקשורים אשר נכנס cytosol, גישה זו אינה יכולה ישירות לקבוע את המספר המדויק של מולקולות הרעלן cytosolic. השוואת הרגישות של זיהוי הרעלן SPR כדי זיהוי של רעלן radiolabeled הוא בעייתי ולכן, כמו כמות הרעלן cytosolic יכול להיות מחושב על ידי SPR אך לא על ידי radiolabeling.

מבחני טרנסלוקציה אחרים לעקוף סחר הצעדים נגד הזרם רעלן ולספק את הרעלן שרשרת ישירות לחדר המיון או באמצעות פלסמיד מערכות מבוססות ביטוי או במבחנה תעתיק / מערכות תרגום ^29-38. בכל אחת מהשיטות רצף אמינו מסוף אות מטרות שרשרת ליבוא שיתוף translational לתוך לומן ER. ייצוא של שרשרת מסונתז מ ER הוא זוהה לאחר מכן על ידי חלוקה subcellular, צנטריפוגה ההפרש, פעילות הרעלן השפלה, cytosol proteasomal של הרעלן translocated, ו / או שינוי cytosolic רעלן ספציפי. קבוצות משנה של גישות אלוcus אך ורק על האירוע טרנסלוקציה, יכול לשמש בניסויים במבחנה הכינון מחדש, לייצר רמות גבוהות של רעלן לגילוי ושיתוף immunoprecipitation מחקרים. עם זאת, מתודולוגיות אינו יכול לקבוע את הקינטיקה או היעילות של משלוח רעלן מפני השטח של התא אל cytosol. ייתכן גם כי שרשרת translocated לא נכנס לחדר המיון במצב קונפורמציה זהה שרשרת holotoxin, נמסר. היבטים אחרים של המארח רעלן אינטראקציות חסרים נהלים אלה, כמו במקרה דיסוציאציה A / B. לפיכך, יש שתי החוזקות והחולשות כדי טרנסלוקציה ניטור עם שרשראות כי מסונתזים ישירות למיון.

טרנסלוקציה רעלן מזוהה לעתים קרובות באמצעות מבחני שכרות. ההשפעה ציטוטוקסיות או cytopathic שנוצר על ידי רעלן להחיל exogenously מדגים את רעלן שרשרת הגיע cytosolic היעד שלה. ברור, זה אמצעי עקיף של טרנסלוקציה המנטרת רעלןctivity ב cytosol ולא בנוכחות הפיזית של רעלן cytosolic. לכן, השיטה אינה יכולה לכמת את רמות הרעלן cytosolic ולא ישירות לאתר עיבוד שונה של הרעלן translocated. קיימים גם תרחישים בהם קשר ישיר בין רמות הרעלן cytosolic ופעילות הרעלן אינם קיימים, כגון הצורך אפשרי ריכוז סף של רעל cytosolic לעורר תגובה תאית או כאשר פעילות הרעלן מייצר תגובה הסלולר רווי. עם זאת, מבחני שכרות יכול לספק מתאם תפקודית אשר מבחני ישירות לתעד את האירוע טרנסלוקציה. יש לנו אסטרטגיה זו השתמשו בעבר כדי להדגים עיכוב של טרנסלוקציה שרשרת תואמת עיכוב של שיכרון הסלולר ^17-19.

לסיכום, ישנן מספר שיטות כדי לזהות משלוח הרעלן cytosol. גישה SPR מבוססי שלנו יש את היתרונות של מתן מהיר, התוצאות רגיש, כמותי. דאתא ניתן גם להשלים עם הניסויים באמצעות אחת האסטרטגיות מבוגרים הנ"ל כדי ליצור מסקנה חזקה.

יישומים עתידיים

שיטה ללא תווית שלנו לגילוי וכימות של הרעלן cytosolic מספק לחוקרים את הגמישות במטרה לענות על שאלות רבות בנוגע מצטיינים ביולוגיה של התא של שכרות. לדוגמה, אפשר לקבוע את היעילות של שרשרת האספקה ​​כדי cytosol על ידי חישוב אחוז רעלן פני כבול המגיעה cytosol. ניתן גם לכמת את הסכום הכולל של רעלן cytosolic, ובהרחבה, את מספר מולקולות הרעלן cytosolic לכל תא. הוא האמין כי מולקולה אחת של הרעלן דיפטריה cytosolic מספיקה כדי לעורר אפקט להשלים cytopathic / ציטוטוקסיות ^39; מודל זה ניתן כעת נבדק עם רעלים אחרים באמצעות assay טרנסלוקציה שלנו מבחני שכרות גומל. לפיכך, assay SPR מבוססי שלנו shoקהילת יוכלו לקבוע כיצד מולקולות רבות של הרעלן cytosolic נדרשים עבור שיכרון פרודוקטיבי. הטכניקה שלנו יכולה גם לעקוב אחר ההתמדה של רעלן cytosolic. השפלה ניכרים של שרשרת translocated תגביל ואולי להפחית cytosolic ריכוז לאורך זמן, אשר מרמזים השפעה של סמים יכול להיות הפוך אם גישה שרשרת cytosol היה מוגבל לאחר החשיפה הראשונית הרעלן. יתר על כן, המדיום תאיים ואת קרום גלולה מתאי שיכורים ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר כמות הרעל המופרש או רעלן המתגוררים במערכת endomembrane, בהתאמה. מחקרים השוואתיים של הרעלן, תאיים endomembrane-מקומי, ו cytosolic ניתן להשתמש כדי לבחון כיצד ביולוגיה של התא של שיכרון משתנה ER-translocating רעלים שונים. Assay שלנו יכול לשמש גם כדי לנתח את רעלן ספציפי גורמים הסלולר הנדרש עבור האירוע טרנסלוקציה ^19. זה צריך להיות אפשרי להתאים את המתודולוגיה שלנו כדי לעקוב אחרטרנסלוקציה endosome ל-cytosol של רעלים אחרים כגון AB גורם אנתרקס קטלנית הרעלן דיפטריה. לבסוף, כניסה לתוך נגיפי cytosol המארח יכול להיות במעקב עם הליך ניסויי דומה.

מגבלות

תנאי המעכבות סחר רעלן למיון יהיה גם למנוע מסירה הרעלן cytosol. זה הודגם על ידי בהעדר cytosolic רעלן בתוך התאים שטופלו ב-BFA (איורים 2, 3 א). לפיכך, ניסויים שליטה נוספת נדרשים בעת שימוש בשיטה זו כדי לבדוק בלוקים הפוטנציאל של טרנסלוקציה הרעלן. עבור כמה רעלים AB, הפחתה של קשר דיסולפיד כי רצועות למקטע קטליטי holotoxin שלה מתרחשת בחדר המיון ^{6, 40-43.} מצב חיזור של שרשרת יכולה בהתאם לשמש כאמצעי תחבורה רעלן לחדר המיון ^{16, 18.} רעלים רקומביננטי המכיל את רצף הקונצנזוס עבור glycosylation N-linked, שינוי זה שיזם בחדר המיון, היה גםלשמש כדי לזהות כניסה רעלן לתוך ER ^{12, 23, 44-46.} לבסוף, כפי שפורט לעיל, פרוטוקולים חלופיים הכוללים שיתוף translational הכניסה של הרעלן שרשרת לתוך לומן ER יכול לאמת השפעה מעכבת על האירוע טרנסלוקציה. לדוגמה, assay SPR מבוססי שלנו טרנסלוקציה הפגינו תפקיד פונקציונלי עבור Hsp90 ב טרנסלוקציה CTA1 כי אושרה פלסמיד עם מערכת מבוססת כי הביע CTA1 ישירות לומן ER ^19.

שרשראות של ER-translocating רעלים התערוכה הטיה חזקה ארגינין-over-ליזין חומצת אמינו המאפשר את הרעלן translocated להתחמק היוביקוויטין תלויי השפלה proteasomal ^47-50. עם זאת, הפירוק של הרעלן cytosolic עדיין מתרחשת על ידי מנגנון היוביקוויטין איטית יחסית עצמאית, proteasomal ^{51, 52.} תנאים המשפרים את פעילות proteasomal יכול להטות כך את תוצאות assay טרנסלוקציה שלנו על ידי הפחתת מאגר של רעלן translocated של פרה cytosolicction. תאים שנחשפו מעכבי פרוטאזום יכול לשמש כדי לשלוט על האפשרות הזאת: עלייה רעלן cytosolic הנובע עיכוב proteasomal יצביע הרעלן יכול בהחלט להגיע cytosol אבל היה מושפל לפני הגילוי.

יצוין, כי שיקולים אלה חלים על תת של גישות חלופיות הנ"ל אינם ייחודיים לשיטה שלנו. כפי שהוזכר קודם לכן, האסטרטגיה הטובה ביותר לאפיון האירוע טרנסלוקציה היא להשתמש בשילוב של טכניקות מבוקר היטב.

צעדים קריטיים בעיות הירי

הכנה כימית היא צעד קריטי עבור assay. Digitonin לא מתמוססים בקלות, והוא אמור להיות מוכן טרי עבור כל ניסוי. כמו כן, PBST טרי אמור לשמש לניתוח SPR. EDC: מאגר NHS ההפעלה צריך להיות מוכן מיד לפני השימוש, זה לא ישמרו על פעילות אם מאוחסן לאחר ערבוב שני פתרונות. However, aliquots נפרד EDC ו - NHS ניתן לאחסן ב -80 ° C ו מופשר פעם לפני השימוש. כל הפתרונות, כולל דוגמאות, יש דה בגז לפני ההזרקה. זה ימנע האוויר הנגרמת דוקרנים האות SPR.

סוג התא לשמש assay זה חייב לבטא קולטנים רעלן מספיק כדי לאפשר בריכה לזיהוי הרעלן שרשרת להגיע cytosol. במקרים מסוימים, כגון טיפול מראש של תאים הלה עם GM1 לפני אתגר CT, קולטנים רעלן נוסף ניתן להוסיף את פני השטח של התאים היעד. סוג התא חייב להיות גם רגישים permeabilization סלקטיבית של הממברנה פלזמה עם digitonin. פרוטוקול המתואר במסמך זה יעיל עם הלה ותאי CHO, אך סוגי תאים אחרים ידרוש צעד אופטימיזציה באמצעות ניתוח כתם המערבי לפקח על הפרדה נקייה של אברון לבין שברים cytosolic. אנו שגרתי בעקבות הפצות של isomerase דיסולפיד חלבון (חלבון מסיס ER) ו Hsp90 (א prote cytosolicב) עבור מטרה זו ^16-19. מחיצות הבלעדית של isomerase חלבון דיסולפיד לתוך השבר גלולה ^16-19 גם מבטיח כי האברונים שנאספו גלולה קרום שלמות. זהו היבט חשוב של השיטה שלנו, כמו הקרע לא מכוונת של אברונים תאיים יציג שגיאה לתוך המערכת על ידי שחרור endomembrane מוגבלת רעלן לתוך השבר cytosolic. SPR מבוססי ניסויים יכול לשמש גם כדי להוכיח את הבריכה cytosolic תוצאות רעלן מאירוע טרנסלוקציה ולא מתוך תמוגה של אברונים תאיים. לדוגמה, הרעלן לא זוהה cytosol של BFA שטופלו בתאים (איורים 2, 3 א) או בתאים שנחשפו רעלן רק 15 דקות (איור 4). כמו כן, למקטע B של ה-CT לא נתגלה השבר cytosolic לאחר חשיפה לרעלן שעתיים (איור 3B). האם פרוטוקול שלנו הביא permeabilization של ממברנות פנימיות, היינו זוהה בריכה cytosolic של רעלן עבור כל אחד שצויינוהתנאים שהוזכרו. קביעת פרוטוקול מתאים permeabilization, לשחזור סלקטיבית של הממברנה הפלסמה צפוי לייצג את שער הגבלת צעד ליישום assay. אפשרויות אחרות permeabilization הממברנה הפלסמטית זמינים, אך מצאנו כי הטיפול digitonin סיפקו תוצאות עקביות יותר מאשר שיטות אחרות כגון טיפול streptolysin O.

איכות הנוגדן יהיה גם לקבוע את הרגישות של assay, אשר ניתן להקים עם דילולים הסידורי של תקן רעלן. לדוגמה, אנו יכולים לזהות reproducibly קטנה כמו 0.1 נ"ג / מ"ל ​​של או PTS1 או CTA רגיל (איורים 2-6). אנטי נוגדנים שרשרת לא אמור לזהות את רעלן למקטע B, ותאי unintoxicated תמיד צריך לשמש מלאה כדי להבטיח הנוגדן אינו חוצה להגיב עם חלבונים בתוך התא המארח. ניסויים ראשוניים יצטרכו לייעל את התנאים הפשטת רעלן מחויב מן הנוגדן, כמו זה יכול להשתנותעבור נגד הרעלן נוגדנים שונים.

כאשר ניטור טרנסלוקציה רעלן בתנאים הסלולר שינו, תקני את הרעלן לבין חלק מן cytosolic לתאי קבוצת הביקורת צריכה להיות בתוספת להתאים את התנאים במדגם הניסיוני. לדוגמה, תקנים CTA ואת חלק cytosolic מטופל מ איור 5 נוספו עם DMSO 1% כדי להתאים את ריכוז התרופה הסופי השבר cytosolic מ DMSO שטופלו בתאים. זה מבטל הבדלים אפשריים האותות SPR שעשוי לנבוע הבדלים בהרכב הכימי של שברים שנאספו. השוואות בין cytosolic ושברים אברון היה גם דורשים תוספת של 1% טריטון X-100 לשבר סטנדרטים cytosolic, כמו חומר הניקוי הזה משמש כדי לשחרר את הרעלן קרום עטופה מן השבר אברון לגילוי SPR. ניסויים ראשוניים הראו נוכחות של cytosol לא משנה את התגובה SPR בסטנדרטים רעלן,כך אין צורך להשלים את הסטנדרטים רעלן עם cytosol מתאי unintoxicated.

נוגדן מחייב כדי להחליק את החיישן לא תתרחש אם EDC: פתרון NHS ההפעלה הישנה או אם השקופית מוכנס לתוך המכשיר עם הצד הזהב מטה. לאור תהליך הייצור, יהיו כמה השתנות צלחת אל צלחת אשר יכול למנוע EDC נאות: הפעלת שירותי הבריאות, ולכן ללכוד נוגדנים. אם נוגדן מחייב לשקופית הוא עני, כפי שצוין על ידי Riu גבוהות חלושות, הזריקה השנייה יכול להפקיד יותר של הנוגדן על הצלחת. Riu היא יחידה שרירותית משתנה מניסוי אחד למשנהו תלוי כמה נוגדנים נגד הרעלן מופקד על החיישן. עם זאת, שיעורי לסירוגין יישאר קבוע.

עדיף להשתמש Refractometer עם חדרי זלוף כפולה ערוץ, כמו ערוץ אחד יכול לשמש מדגם ניסיוני הערוץ השני יכול לשמש חיץ aloנה כדי לתקן עבור סחיפה בסיס אפשרי. בעת השימוש במכשיר תא כפול, להבטיח כי נוגדנים נגד הרעלן הוא הוסיף רק אחד משני הערוצים. דוגמאות יהיה לאחר מכן להתנהל בערוצים שניהם. עם מכשיר ערוץ אחד, את הפיצוי עבור להיסחף הבסיס כרוכה אוסף של נתונים חיץ לבד משקופית נוגדן מצופה לפני הזרקה מדגם.

לפני תחילת ניסוי SPR, להבטיח את השקופית חיישן מוגדר היטב במכשיר ואביזרים כל מאובטחים. הדלפות הנובע בנושאים אלה ייצרו קוצים האוויר הנתונים שנאספו. הדלפות גם יכול להיות מזוהים על ידי בהעדר זרימת הפסולת, אשר צריך תמיד להיות נוכח. נפח דגימה גדול יותר בנפח של הלולאה זריקה נחוצה כדי למנוע קוצים אוויר וכן - לדוגמה, אנו עושים שימוש במדגם כרכים 1 מ"ל עם לולאה 500 זריקת μL. כמות הולמת של שמן טבילה על הפריזמה ימנע ייצוב של signa הבסיסיב נושאים אחרים הקשורים למבצע של המכשיר SPR מופנים במדריך משתמשים ו לקטי טכני המסופקים על ידי רייכרט.