Detectie van Toxin Translocatie in de Host cytosol van Surface Plasmon Resonance

1. Voorbereiding van de digitonine

1. Voeg 500 ul van 100% ethanol tot een microcentrifugebuis en plaats deze in een warmte blok ingesteld op 80 ° C gedurende 10 minuten.
2. Los 2,5 mg digitonine in 250 pi van de verhitte ethanol tot een 1% oplossing van digitonine voorraad te produceren.
3. Voor het genereren van een werkende oplossing van 0,04% digitonine, voeg 40 ul van de digitonine stamoplossing tot 960 ul van HCN-buffer (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM _CaCl2, 10 mM N-ethylmaleimide, en een proteaseremmer cocktail).

2. Cel dronkenschap en permeabilisatie

Onze translocatie test kan worden toegepast op een reeks van toxines en cellijnen. Hieronder geven we een gedetailleerd protocol voor de detectie van cholera toxine (CT). Een overzicht van de procedure is gegeven in figuur 1.

1. HeLa-cellen worden gezaaid in 6-wells platen met 1 ml DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum en antibiotica-schimmelwerendte bereiken 1x10 ⁶ cellen / well na een nacht incubatie bij 37 ° C. Voor het genereren van voldoende cytosolische toxine voor reproduceerbare detectie, zijn drievoud putten vereist voor elke conditie.
2. Na een nacht incubatie, vervang dan het kweekmedium met 1 ml DMEM met 100 ng / mL ganglioside GM1. Dit verhoogt het aantal bindingsplaatsen voor CT, omdat de GM1 receptor van CT zal intercaleren in de plasmamembraan van de cellen blootgesteld aan een oplossing van GM1.
3. Na een 1 uur incubatie bij 37 ° C, verwijder de GM1-bevattend medium en tweemaal was de cellen met DMEM. Plaats vervolgens de cellen bij 4 ° C gedurende 30 minuten in 1 ml DMEM met 1 ug / ml CT.
4. Verwijder de toxine-bevattend medium, twee keer de cellen met DMEM wassen, en de cellen in 1 ml DMEM incuberen bij 37 ° C voor de gewenste tijdsinterval (s).
5. Aan het einde van elke periode chase, was de cellen met PBS en incubeer elk goed met 250 pl van 0,5 mM EDTA in PBS. Laat de cellen zitten voor 10 minuten bij kamertemperatuur en verwijder ze uit de 6-wells plaat van krachtige trituratie met een P1000 Pipetman. Na een goed van de cellen is verzameld, combineren met de tweede en vervolgens derde goed van dezelfde aandoening. Cel schrapers kan ook worden gebruikt om de cellen te verzamelen.
6. Plaats het gecombineerde celsuspensie van de drie gelijke putten (750 pi totaal volume) in een enkele microcentrifugebuis, en draai het in een tabletop microcentrifuge gedurende 5 min bij 5000 x g. Celpellets van ongeveer gelijke grootte moet worden verkregen voor alle omstandigheden.
7. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 100 ui van de 0,04% van de werkende oplossing digitonine. Plaats de celsuspensie op ijs gedurende 10 minuten.
8. Spin de digitonine-gepermeabiliseerde cellen op 16.000 xg gedurende 10 min in een tafelblad microcentrifuge. Breng de cytosol bevattende supernatant fractie een nieuwe microcentrifugebuis, en behouden de organel-bevattende pellet fractie.

1. Cytosol-bevattende supernatant fracties worden verdund in HCN buffer tot een uiteindelijk volume van 1 ml. Monstervolumes van ten minste 1 mL nodig zijn om ervoor te zorgen de lucht is verwijderd uit de 500 uL monster lus vóór de injectie.
2. Organel-bevattende pellet fracties zijn geresuspendeerd in 1 ml van HCN een buffer met 1% Triton X-100. Toevoeging van reinigingsmiddel is nodig om de membraan-omsloten pool van toxine vrij te geven.
3. Toxine normen bij concentraties van 100, 10, 1 en 0,1 ng / mL worden bereid in HCN buffer.
4. Parallelle sets van cytosolische en organel fracties zijn voorbereid op een controle-experiment aan de trouw van de fractionering procedure te bevestigen. Breuken ontstaan, zoals beschreven in hoofdstuk 2 worden opnieuw gesuspendeerd in 20 ul 4x sample buffer (cytosolische fractie) of 120 ul 1x sample buffer (organel fractie). Equivalente volumes van elke fractie worden opgelost door natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gelelektroforese en probed by Western blot-analyse om het partitioneren van een cytosolisch eiwit in het supernatant fractie en een oplosbaar, woonachtig ER eiwit in de pellet-fractie ^16-19 te tonen.

4. SPR preparaat

1. De Reichert SR7000 SPR Refractometer wordt gebruikt voor het SPR experimenten.
2. Stel een vergulde glazen dia met een zelf-geassembleerde monolaag in de SPR instrument. Het activeren van de sensor glijbaan, perfuseren een 1:1 (v: v) oplossing van 0,4 M EDC en 0,1 M NHS over de glijbaan voor 10 min bij een stroomsnelheid van 41 pL / min. Alle volgende perfusies zal gebruik maken van hetzelfde debiet.
3. Voor het verwijderen van het EDC: NHS activering buffer, was de plaat gedurende 5 min met PBS met 0,05% Tween 20 (PBST). De plaat bevat nu reactieve amide tethers te wijten aan ontzegeld, door de EDC: NHS-oplossing.
4. Perfuseren een anti-CTA antilichaam op de geactiveerde sensor dia een verdunning van 1:20.000 in 20 mM natriumacetaat (pH 5,5) gedurende 15 minuten. Een eerste daling van de refractieve index eenheid (RIU) zal als gevolg van de pH-verandering te zien. Dit zal worden gevolgd door een toename van de RIU als het antilichaam wordt opgevangen door de amide-reactieve aanbinden op de sensor dia.
5. Verwijder de niet-gebonden antilichaam van de sensor dia met een 5 minuten PBST wassen. De RIU signaal geproduceerd door de gevangen antilichaam zal plateau en stabiliseren, waardoor een nieuwe baseline signaal.
6. Perfuseren 1 M ethanolamine (pH 8,5) over de sensor glijbaan voor 5 minuten. Deze caps en inactiveert alle ongebonden aanbinden links op de sensor dia.

5. SPR analyse van de monsters

1. Om een ​​basislijn te lezen, perfuseren PBST over de antilichaam-gecoate sensor gedurende 5 minuten.
2. Perfuseren een experimentele monster of de standaard toxine over de sensor voor 300 sec. Verwijder de ligand uit de buffer en perfuseren PBST over de sensor voor een andere 200 sec.
3. Na elke perfusie, is gebonden toxine verwijderd van de sensor door een 100 sec wassen met PBST bij pH 5,0. Deze zoekopdracht zal het signaalnaar de oorspronkelijke basislijn te lezen, waardoor een andere steekproef te worden verwerkt op dezelfde sensor.
4. Voor het laden van een nieuw monster, druk een kleine hoeveelheid lucht door het monster lus om eventuele resten van vocht te verdrijven uit het voorafgaande monster. Met behulp van de procedure beschreven in 5.2-5.4, hebben we aanloop naar de 12 monsters op een dia, zonder substantieel verlies van de basislijn signaal.
5. Data-analyse is uitgevoerd met de Scrubber 2-software, en de Igor software wordt gebruikt voor figuur voorbereiding.

6. Representatieve resultaten

Pertussis-toxine (PT) is een AB-toxine die uit het celoppervlak wordt verplaatst naar de ER voor zijn A-keten (PTS1) komt in de cytosol ^{3, 12.} Zoals weergegeven in figuur 2, zou onze SPR-based translocatie test te detecteren PTS1 in het cytosol van dronken CHO-cellen. Er geen signaal werd gegenereerd uit de cytosol van unintoxicated cellen, die bevestigd dat de anti-PTS1 antilichaam niet cross-reageren met een component van de gastheer cytosol. Decytosolische fractie van cellen die dronken in de aanwezigheid van Brefeldine A (BFA) evenmin een positief signaal te produceren. BfA voorkomt toxine transport naar de ER translocatie plaats ^{6-8, 12, 20-25} en, dus, Een ketting levering aan de cytosol. Aan het einde van elke run, is gebonden toxine ontdaan van de sensor dia. Dit liet meerdere monsters worden gescreend op een enkele sensor glijbaan en daarmee zorgde voor een directe vergelijking tussen de resultaten verkregen met verschillende experimentele omstandigheden.

CT is een ander AB-type, ER-transloceren toxine ^4. In figuur 3A, was CTA1 gedetecteerd in de cytosolische fractie uit CT-behandelde HeLa-cellen. Dit benadrukt dat onze methodiek werkt met meerdere celtypen en kan worden toegepast op elke toxine waarvoor een anti-A-keten antilichaam beschikbaar is. Er wordt geen signaal was gedetecteerd wanneer de cytosolische fractie uit CT-behandelde cellen was perfusie over een SPR-sensor voorzien van een anti-CTB antilichaam (Fig. 3B), waaruit blijkt dat de CTA1subunit, maar niet de cel-bindende CTB pentameer komt in de cytosol. Figuur 3C toont het signaal van de organel fractie is off-schaal in vergelijking met de zwakkere signaal van de cytosolische fractie. Dit was consistent met het bekende inefficiëntie van CT transport naar de ER translocatie plaats ^{6, 7,} die op zijn beurt beperkt de hoeveelheid toxine die de cytosol kan bereiken. Bovendien is de organel fractie bevat CT holotoxin als ER-gelokaliseerde CTA1, waardoor het resulterende SPR signaal voor de organel fractie wordt opgeblazen door de extra massa van de holotoxin-geassocieerde CTB pentameer. Dus is het niet praktisch om te plotten gegevens van de organel en cytosolische fracties op dezelfde sensorgram.

Onze test kan toezien op de tijdsafhankelijke accumulatie van translocatie, cytosolisch toxine (afb. 4). Cellen werden blootgesteld aan CT bij 4 ° C, een temperatuur die het mogelijk maakt toxine binding aan het plasmamembraan maar voorkomt internalisatie van de cel-geassocieerde toxine. Na de removal van ongebonden toxine, werden de cellen verwarmd tot 37 ° C. Beide toxine transport naar de ER en een ketting translocatie naar het cytosol kan optreden bij deze temperatuur. Geen toxine werd ontdekt in de cytosol 15 minuten na het opwarmen tot 37 ° C. Dit weerspiegelde de vertraging die nodig is voor (i) holotoxin mensenhandel aan de ER, (ii) A / B-subunit dissociatie in het ER, en (iii) een keten export naar de cytosol. Een kleine pool van cytosolisch toxine werd ontdekt na 30 minuten bij 37 ° C, en geleidelijk grotere hoeveelheden cytosolisch toxine werd ontdekt na de 45 en 60 minuten te jagen intervallen. Nog hogere niveaus van cytosolisch toxine werd ontdekt na een 5 uur durende achtervolging interval van ^17, hetgeen aantoont dat een continue, langdurige levering van cel-geassocieerd toxine naar de host cytosol.

Onze test detecteert ook de remming van de toxine translocatie naar het cytoplasma (Fig. 5). Cellen behandeld met 10% dimethylsulfoxide (DMSO), een chemische stof chaperone dat de thermische Disord voorkomtEring van de geïsoleerde CTA1 subeenheid (T. Banerjee en K. Teter, ongepubliceerde waarnemingen), een laag niveau van cytosolisch CTA1 tentoongesteld in vergelijking met de onbehandelde controle cellen. Ontvouwing van het toxine A-keten is een voorwaarde voor translocatie naar de cytosol ^16-18, zodat de DMSO-geïnduceerde stabilisatie van CTA1 dienovereenkomstig zijn beweging verhinderd het ER naar het cytosol.

De vereniging snelheidsconstante (k _a) berekend op basis van SPR experimenten is recht evenredig met de concentratie van ligand in de perfusie buffer ^{14, 15, 26.} Zo is het mogelijk om de concentratie van de cytosolische toxine te bepalen uit een grafiek die plots de K-waarden voor _een toxine normen als een functie van toxine concentratie. Deze procedure werd gebruikt om de DMSO-geïnduceerde blok van toxine translocatie weergegeven in Figuur 5 te kwantificeren: de standaard curve gegenereerd op basis van bekende concentraties toxine werd gebruikt om een ​​cytosolische CTA1 CONCENTRAT berekenenion van 0,3 ng / ml voor onbehandelde cellen en 0,1 ng / ml voor DMSO-behandelde cellen (Fig. 6). De remming van CTA1 ontvouwen door DMSO aldus opgewekte een 3-voudige vermindering van de ER-to-cytosol translocatie van CTA1.

Figuur 1. Protocol overzicht. (A) Cellen worden geïncubeerd met de AB toxine bij 4 ° C, een temperatuur die het mogelijk maakt toxine binding aan het celoppervlak, maar voorkomt toxine endocytose. De A-en B-subeenheden van het toxine worden vertegenwoordigd door rode en blauwe cirkels, respectievelijk. (B) geconsolideerd toxine is verwijderd uit het medium, en cellen worden verwarmd tot 37 ° C om endocytose en retrograde transport van de holotoxin promoveren naar de ER. Holotoxin dissociatie vindt plaats in de ER, die het mogelijk maakt de geïsoleerde Een ketting om de cytosol betreden door het passeren van een eiwit-geleidende kanaal (s) in het ER membraan. (C) Cellen worden behandeld met digitonine om selectief permeabilize het plasmamembraan. (D) Centrifugeren wordt gebruikt om partitie van de cellen in afzonderlijke cytosolische en organel fracties. Het cytosol is geperst uit de cel door middel van de digitonine gegenereerde poriën en is gelegen in het supernatant. Het intacte, membraangebonden organellen zijn te vinden in de pellet-fractie. (E) Om de translocatie pool van toxine A-keten in de ontvangende cytosol te detecteren, is het supernatant fractie geperfuseerde meer dan een SPR-sensor voorzien van een anti-A-keten antilichaam.

Figuur 2. Detectie van PTS1 translocatie in de gastheer cytosol. CHO cellen werden puls-gelabeld bij 4 ° C gedurende 30 min met 1 ug / ml van PT. De cellen werden vervolgens achtervolgd gedurende 3 uur bij 37 ° C in toxine-vrij medium bevat geen toevoegingen (onder invloed) of 5 microgram BfA / ml (+ BfA dronken). Permeabilisatie van de plasma membraan met digitonine werd gebruikt om de partitie celextracten in aparte organel en cytosolisch fractions. Een SPR sensor voorzien van een anti-PTS1 antilichaam werd gebruikt om de cytosolische pool van PTS1 van onbehandelde of BfA-behandelde cellen te detecteren. PTS1 normen werden geperfuseerd over de sensor als positieve controles, terwijl de cytosolische fractie van unintoxicated cellen werd doorbloed over de sensor dia als een negatieve controle. Aan het einde van elke run, was gebonden monster ontdaan van de sensor dia.

Figuur 3. Detectie van CTA1 translocatie in de gastheer cytosol. HeLa-cellen puls-gelabeld bij 4 ° C met 1 ug / ml CT werden verjaagd gedurende 2 uur bij 37 ° C in toxine-vrij medium die geen toevoegingen (onder invloed) of 5 microgram BfA / ml (+ BfA dronken). Permeabilisatie van de plasma membraan met digitonine werd gebruikt om de partitie celextracten in aparte organel en cytosolische fracties. (A) De cytosolische fracties werden geperfuseerd meer dan een SPR-sensor voorzien van een anti-CTA antilichaam. Bekendhoeveelheden van de CTA werden gebruikt als positieve controles, terwijl het cytosol van unintoxicated cellen werd gebruikt als een negatieve controle. (B) De cytosolische fractie van cellen die dronken in de afwezigheid van BfA was geperfuseerd over een SPR-sensor voorzien van een anti-CTB antilichaam. Een gezuiverde CTB pentameer was doorbloed over de dia als een positieve controle. (C) De organel fractie werd opgelost met 1% Triton X-100 voor perfusie via een sensor SPR gecoat met een anti-CTA antilichaam. Voor vergelijkingsdoeleinden zijn de cytosolische fractie (1 ml uiteindelijk volume) uit dezelfde cel-extract en een CTA standaard ook doorbloed over de sensor. Voor alle panelen, was gebonden monster ontdaan van de sensor aan het einde van elke run.

Figuur 4. Kinetiek van CTA1 binnenkomst in het cytosol. HeLa-cellen puls-gelabeld bij 4 ° C met 1 ug / ml CT waren verjaagd voor 15, 30, 45, of 60 minuten bij 37 ° C in toxine-vrij medium. Voor het detecteren van de translocatie pool van toxine, zijn cytosolische fracties uit digitonine-gepermeabiliseerde cellen doorbloed meer dan een SPR-sensor voorzien van een anti-CTA antilichaam. CTA normen werden geperfuseerd over de sensor ook. Aan het einde van elke run, was gebonden monster ontdaan van de sensor dia.

Figuur 5. Remming van CTA1 translocatie door DMSO. HeLa-cellen puls-gelabeld bij 4 ° C met 1 ug / ml CT werden verjaagd gedurende 2 uur bij 37 ° C in toxine-vrij medium die geen toevoegingen (onder invloed) of 10% DMSO (+ DMSO dronken). Voor het detecteren van de translocatie pool van toxine, zijn cytosolische fracties uit digitonine-gepermeabiliseerde cellen doorbloed meer dan een SPR-sensor voorzien van een anti-CTA antilichaam. CTA normen (100, 10, 1 en 0,1 ng / ml) werden geperfuseerd over de sensor als positieve controles, alleen de 1 en 0,1 ng / mL normen worden voor het schalen doeleinden. Het cytosol van unintoxicated-cellen werd gebruikt als een negatieve controle. Aan het einde van elke run, was gebonden monster ontdaan van de sensor dia.

Figuur 6. Berekening van de cytosolische CTA1. K _een waarden voor de CTA normen uit figuur 5 werden uitgezet als functie van de toxine concentratie. De resulterende standaardcurve werd gebruikt om te bepalen, op basis van de k _een waarden van de experimentele monsters uit Figuur 5, de concentratie van cytosolisch CTA1 bij onbehandelde en DMSO-behandelde cellen. Toxine normen worden gepresenteerd als gevulde cirkels, de onbehandelde cytosol wordt gepresenteerd als een open plein, en de DMSO-behandelde cytosol wordt gepresenteerd als een open cirkel. De gemiddelden ± varieert van twee onafhankelijke experimenten worden getoond.

Vergelijking met bestaande methodologie

Onze SPR-gebaseerde translocatie assay is een snelle, gevoelige en kwantitatieve methode om de levering toxine te detecteren in de gastheer cytosol. De techniek vereist geen radiolabeling of andere wijzigingen van het toxine, en het kan worden toegepast op elk toxine waarvoor een anti-toxine A keten antilichaam beschikbaar is. Bestaande methoden voor het toxine passage monitor in het cytosol ook vertrouwen op een subcellulaire fractionatie protocol te partitioneren celextracten in aparte cytosol en membraan fracties ^{11, 23, 27, 28.} Deze methoden gebruiken Western blot of radiolabels aan de cytosolische pool van toxine te detecteren. De eerste benadering is semi-kwantitatief op zijn best en heeft last van relatief slechte gevoeligheid. Zelfs radiolabeling protocollen kan weken duren om een ​​resultaat te genereren, als gevolg van de lage niveaus van toxine die de cytosol te bereiken. Terwijl de kwantitatieve analyse met een radioactief gemerkt toxine kan bepalen het relatieve percentagevan cel-geassocieerde toxine die de cytosol binnenkomt, kan deze aanpak niet direct bepalen het exacte aantal cytosolische toxine moleculen. Vergelijking van de gevoeligheid van de SPR toxine detectie om de detectie van radioactief gif is dan ook problematisch, aangezien de hoeveelheid cytosolische toxine kan worden berekend door SPR, maar niet door radiolabeling.

Andere translocatie assays bypass de upstream toxine mensenhandel stappen en leveren de toxine A-keten direct naar de ER met behulp van plasmide-gebaseerd expressiesysteem systemen of in vitro transcriptie / translatie-systemen ^29-38. Voor beide methoden, een amino-terminale signaalsequentie richt zich op de A-keten voor co-translationele invoer in de ER lumen. Export van de gesynthetiseerde Een keten van het ER wordt vervolgens gedetecteerd door subcellulaire fractionering, differentiële centrifugatie, toxine activiteit in de cytosol, proteasomale afbraak van de translocatie toxine, en / of een cytosolische-specifieke toxine wijziging. Deelverzamelingen van deze benaderingen voorcus uitsluitend op de translocatie evenement, kan worden gebruikt voor in vitro reconstitutie experimenten, en produceren verhoogde niveaus van toxine voor detectie en co-immunoprecipitatie studies. Echter, de methodieken niet bepalen de kinetiek of efficiëntie van toxine levering van het celoppervlak naar de cytosol. Het is ook mogelijk dat de translocatie Een ketting niet betreden van de ER in dezelfde conformationele staat als de holotoxin geleverde A-keten. Andere aspecten van gastheer-toxine interacties ontbreken van deze procedures, zoals de A / B dissociatie evenement. Er zijn dus zowel de sterke en zwakke punten aan het toezicht translocatie met A ketens die direct worden gesynthetiseerd in het ER.

Toxine translocatie wordt vaak ontdekt door middel van vergiftiging assays. De cytotoxische of cytopathische effect gegenereerd door exogeen aangebracht toxine toont het toxine A-keten heeft zijn cytosolische doel. Uiteraard is dit een indirecte meting van de translocatie dat toxine een bewaaktctivity in het cytosol in plaats van de fysieke aanwezigheid van cytosolisch toxine. Zo kan de techniek niet kwantificeren van de niveaus van de cytosolische toxine, noch direct op te sporen veranderde verwerking van de translocatie toxine. Er zijn ook scenario's waarin een directe correlatie tussen cytosolische toxine niveaus en toxine-activiteit niet bestaan, zoals de eventuele noodzaak van een drempel concentratie van cytosolisch toxine om een ​​cellulaire respons of wanneer toxine-activiteit zorgt voor een verzadigd cellulaire respons op te wekken. Toch, intoxicatie testen kunnen een functionele correlatie te verstrekken aan assays die direct document de translocatie evenement. We hebben eerder gebruik gemaakt van deze strategie om een remming van de A-keten translocatie komt overeen met een inhibitie van de cellulaire vergiftiging ^17-19 te tonen.

Kortom, er zijn meerdere manieren om de levering toxine te detecteren aan de cytosol. Onze SPR-gebaseerde aanpak heeft het voordeel van het verstrekken van snelle, gevoelige en kwantitatieve resultaten. De data kan ook aangevuld worden met experimenten met een van de genoemde oudere strategieën om een ​​sterkere conclusie te genereren.

Toekomstige toepassingen

Ons label-free methode voor de detectie en kwantificatie van cytosolisch toxine biedt onderzoekers met de flexibiliteit om vele openstaande vragen over de celbiologie van de roes te pakken. Bijvoorbeeld, is het mogelijk om de efficiëntie van de A-keten de levering tot stand te brengen het cytosol door berekening van het percentage van oppervlakte-gebonden toxine die de cytosol bereikt. Het is ook mogelijk te kwantificeren het totale bedrag van de cytosolische toxine en, bij uitbreiding, het aantal cytosolische toxine moleculen per cel. Er wordt aangenomen dat een molecuul van cytosolische difterie toxine is voldoende om een compleet cytopathisch / cytotoxische effect ³⁹ te wekken, dit model kan nu worden getest met andere giftige stoffen met behulp van onze translocatie test en correlatieve intoxicatie assays. Zo, onze SPR-gebaseerde test shoULD in staat zijn om te bepalen hoeveel moleculen van cytosolisch toxine nodig zijn voor productieve intoxicatie. Onze techniek kan houden ook het voortbestaan ​​van cytosolische toxine. Aanzienlijke mate van afbraak van de translocatie A-keten zou beperken en mogelijk verminderen de cytosolische concentratie in de tijd, dat zou het effect van intoxicatie impliceert kon worden teruggedraaid als een ketting de toegang tot de cytosol was beperkt na de eerste toxine blootstelling. Bovendien kan het extracellulaire medium en membraan pellet van dronken cellen die worden gebruikt om de hoeveelheid uitgescheiden toxine of toxine die in de endomembraan systeem, respectievelijk track. Vergelijkende studies van extracellulaire, endomembraan-gelokaliseerde en cytosolische toxine kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe de celbiologie van intoxicatie varieert voor de verschillende ER-transloceren toxines. Onze test kan ook worden gebruikt om het toxine-specifieke cellulaire factoren die nodig zijn voor de translocatie evenement ¹⁹ ontleden. Het moet mogelijk zijn om onze werkwijze aan te passen om bij te houdende endosoom-to-cytosol translocatie van andere AB toxinen zoals anthrax dodelijke factor en difterie toxine. Ten slotte zou binnendringen van het virus in de gastheer cytosol mogelijk worden gecontroleerd met een vergelijkbare experimentele procedure.

Beperkingen

Voorwaarden die toxine mensenhandel remmen aan de ER zal toxine levering ook voorkomen dat de cytosol. Dit werd aangetoond door de afwezigheid van cytosolisch toxine in BfA-behandelde cellen (afb. 2, 3A). Zo komen er bijkomende controle-experimenten nodig bij gebruik van deze methode om potentiële blokken van toxine translocatie te onderzoeken. Voor sommige AB giftige stoffen, de vermindering van een disulfidebinding dat aanbinden de katalytische subeenheid om zijn holotoxin vindt plaats in de ER ^{6, 40-43.} De redox status van de A-keten kan dus worden gebruikt als een maatstaf voor de toxine het transport naar de ER ^{16, 18.} Recombinant gifstoffen die de consensus-sequentie voor N-gebonden glycosylering, een wijziging die is ingewijd in de ER, zijn ookgebruikt om toegang toxine te detecteren in de ER ^{12, 23, 44-46.} Ten slotte, zoals hierboven besproken, alternatieve protocollen met betrekking tot co-translationele insertie van het toxine A-keten in het ER lumen kan een remmend effect op de translocatie evenement te verifiëren. Bijvoorbeeld, onze SPR-based translocatie test toonde een functionele rol voor Hsp90 in CTA1 translocatie die werd bevestigd met een plasmide-gebaseerd systeem dat CTA1 uitgedrukt direct in het ER lumen ^19.

De A-ketens van ER-transloceren giftige stoffen vertonen een sterke arginine-over-lysine aminozuur vooringenomenheid waarmee de translocatie toxine te ontwijken ubiquitine-afhankelijke proteasomale degradatie ^47-50. Echter, afbraak van de cytosolische toxine gebeurt nog steeds door een relatief langzame, ubiquitine-onafhankelijke proteasomale mechanisme ^{51, 52.} Voorwaarden die proteasomale activiteit te verhogen, kunnen dus scheef van de resultaten van onze test translocatie door het verminderen van het zwembad van de translocatie-toxine in de cytosolische fractie. Cellen blootgesteld aan een proteasoom remmer kan worden gebruikt om de controle voor deze mogelijkheid, een toename van de cytosolische toxine als gevolg van proteasomale remming zou wijzen op het toxine kan inderdaad het cytosol te bereiken, maar werd afgebroken voordat detectie.

Opgemerkt moet worden dat deze overwegingen van toepassing zijn op subsets van de genoemde alternatieve benaderingen en zijn niet uniek voor onze methode. Zoals eerder vermeld, de beste strategie voor het karakteriseren van de translocatie evenement is het gebruik van een combinatie van goed gecontroleerde technieken.

Kritische stappen en trouble-shooting

Chemische preparaten is een cruciale stap voor de test. Digitonine niet gemakkelijk op te lossen, en het moet vers worden bereid voor elk experiment. Ook moeten verse PBST gebruikt worden voor SPR-analyse. Het EDC: NHS activering buffer dient onmiddellijk te worden voorbereid voor het gebruik, het zal niet behouden-activiteit indien opgeslagen na het mengen van de twee oplossingen. However, afzonderlijke fracties van EDC en de NHS kan worden opgeslagen bij -80 ° C en een keer ontdooid vóór gebruik. Alle oplossingen, waaronder de monsters, zou moeten zijn ontgast vóór de injectie. Hierdoor wordt voorkomen dat er lucht-geïnduceerde pieken in het SPR signaal.

Het celtype te worden gebruikt voor deze test moet uitdrukken genoeg toxine-receptoren op een detecteerbare pool van toxine A-keten aan het cytosol te bereiken mogelijk te maken. In sommige gevallen, zoals de voorbehandeling van HeLa cellen met GM1 voor CT uitdaging, kunnen extra toxine-receptoren worden toegevoegd aan het oppervlak van target cellen. Het celtype moet ook gevoelig voor selectieve permeabilisatie van de plasma membraan met digitonine. Het protocol hierin beschreven is effectief bij HeLa en CHO-cellen, maar ook andere celtypes zal een optimalisatie stap met behulp van Western blot-analyse om de schone scheiding van organellen en cytosolisch fracties monitoren vereisen. We volgen regelmatig de verdelingen van eiwit-isomerase (een oplosbare proteïne ER) en Hsp90 (een cytosolische protein) voor dit doel ^{16 tot 19.} De exclusieve verdeling van eiwit-isomerase in de pellet-fractie ^16-19 zorgt er ook voor dat de organellen verzameld in het membraan pellet intact zijn. Dit is een cruciaal aspect van onze methode, als de onbedoelde breuk van intracellulaire organellen zou fout te introduceren in het systeem door het vrijgeven van endomembraan-beperkte toxine in de cytosolische fractie. SPR-gebaseerde experimenten kan ook worden gebruikt om aan te tonen dat de cytosolische pool van toxine het gevolg is van een translocatie gebeurtenis in plaats van de afbraak van intracellulaire organellen. Zo werd er geen gif aangetroffen in het cytoplasma van de BfA-behandelde cellen (afb. 2, 3A) of cellen blootgesteld aan gif voor slechts 15 minuten (afb. 4). Ook was de B-subunit van CT niet gedetecteerd in de cytosolische fractie na een twee uur toxine blootstelling (Fig. 3B). Had ons protocol resulteerde in de permeabilisatie van interne membranen, zouden we hebben ontdekt een cytosolische pool van toxine voor elk van de hiervoorgenoemde voorwaarden. Tot vaststelling van het juiste protocol voor reproduceerbare, selectieve permeabilisatie van het plasmamembraan is waarschijnlijk de snelheidsbeperkende stap voor de test implementatie vertegenwoordigen. Andere opties voor plasmamembraan permeabilisatie beschikbaar zijn, maar we vonden dat digitonine behandeling meer consistente resultaten dan andere methoden zoals behandeling met streptolysin O. voorzien

De kwaliteit van het antilichaam zal ook bepalend voor de gevoeligheid van de test, die kan worden vastgesteld met seriële verdunningen van een toxine standaard. Bijvoorbeeld, kunnen we reproduceerbaar ontdekken zo weinig als 0,1 ng / ml van een van beide PTS1 of CTA standaard (afb. 2-6). De anti-A-keten antilichaam dient geen van de toxine B-subunit, en unintoxicated cellen moeten altijd worden gebruikt als een controle om ervoor te zorgen het antilichaam niet cross-reageren met eiwitten in de gastheercel. Voorlopige experimenten nodig om de voorwaarden te optimaliseren voor het strippen van gebonden toxine van het antilichaam, want dit kan verschillenvoor verschillende anti-toxine antilichamen.

Bij het bewaken van toxine translocatie onder veranderde cellulaire omstandigheden moet het toxine normen en cytosolische fractie van onbehandelde controle cellen worden aangevuld om de voorwaarden in de experimentele sample wedstrijd. Zo werden CTA normen en de onbehandelde cytosolische fractie uit Figuur 5 aangevuld met 1% DMSO aan de uiteindelijke concentratie van het geneesmiddel in de cytosolische fractie uit DMSO-behandelde cellen wedstrijd. Dit voorkomt mogelijke verschillen in de SPR signalen die kunnen voortvloeien uit verschillen in de chemische samenstelling van de ingezamelde fracties. Vergelijkingen tussen cytosolische en organel fracties zouden ook vereisen de toevoeging van 1% Triton X-100 aan de cytosolische fractie en normen, zoals dit reinigingsmiddel wordt gebruikt om het membraan omhuld toxine release van het organel fractie voor SPR detectie. Inleidende experimenten hebben aangetoond dat de aanwezigheid van cytosol niet de SPR reactie op de toxine normen te wijzigen,dus het is niet nodig om de toxine normen aanvullen met cytosol van unintoxicated cellen.

Antilichaam binding aan de sensor slide zal niet optreden als de EDC: NHS activering oplossing is oud of als de dia wordt ingevoegd in het instrument met de gouden kant naar beneden. Gelet op het productieproces, zal er een aantal plaat-to-plate variabiliteit die kan voorkomen dat een goede EDC: NHS activatie en dus antilichaam vast te leggen. Als antilichaam binding aan de dia slecht is, zoals aangegeven door een zwak hoge RIU, kan een tweede injectie borg meer van het antilichaam op de plaat. De RIU is een willekeurige eenheid die varieert van een experiment naar het andere, afhankelijk van hoeveel anti-toxine antilichaam is afgezet op de sensor. Toch zal de aan-en uitzetten tarieven blijven constant.

Het is beter om een ​​Refractometer gebruiken met dual channel perfusie kamers, als een kanaal kan worden gebruikt voor de experimentele monster en de andere kanaal kan worden gebruikt voor buffer ALOne om te corrigeren voor mogelijke baseline drift. Bij gebruik van een dubbele kamer instrument, ervoor zorgen dat de anti-toxine antilichaam alleen wordt toegevoegd aan een van de twee kanalen. Monsters zullen vervolgens worden uitgevoerd door beide kanalen. Met een enkel kanaal instrument, de vergoeding voor de basislijn drift gaat verzameling van de buffer alleen de gegevens van de antilichaam-gecoate slide voorafgaand aan de steekproef injectie.

Voor het begin van een SPR experiment, zorgen voor de sensor dia wordt strak in het instrument en alle aansluitingen zijn beveiligd. Lekkages als gevolg van deze problemen zullen genereren lucht pieken in de verzamelde gegevens. Lekken kunnen ook worden gedetecteerd door de afwezigheid van afvalstromen, die altijd aanwezig moeten zijn. Een voorbeeld van een volume groter dan het volume van de injectie-loop is nodig om de lucht pieken te vermijden maar ook - bijvoorbeeld, gebruiken we een mL monster volumes met een 500 pi injectie lus. Een ongepaste hoeveelheid van immersie olie op het prisma wordt voorkomen dat de stabilisatie van de baseline Signal. Andere kwesties met betrekking tot de werking van het SPR instrument komen aan bod in de gebruikershandleiding en technische bulletins geleverd door Reichert.