The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Schmidt, E. R. E., Morello, F., Pasterkamp, R. J. Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays. J. Vis. Exp. (61), e3691, doi:10.3791/3691 (2012).
Midbrain dopamine (mdDA) औसत दर्जे का अग्रमस्तिष्क बंडल telencephalon में striatum एक सहित कई क्षेत्रों की ओर न्यूरॉन्स परियोजना के माध्यम से. आपस में, striatum में मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स कि striatonigral मार्ग (सीधा) को जन्म दे substantia nigra अंदर आना 2. इन इलाकों के अक्षतंतु विकास अक्षतंतु विकास और neurites द्वारा या लक्ष्य (मध्यवर्ती) 3,4 क्षेत्रों के द्वारा जारी कर रहे हैं अणुओं है कि सहित मार्गदर्शन संकेत के एक बहुतायत के मिश्रित कार्रवाई पर निर्भर है. ये घुलनशील कारकों संवर्धन mdDA और / या कोलेजन मैट्रिक्स है जो बाह्य वातावरण की नकल उतार axons के लिए एक तीन आयामी प्रदान करता है सब्सट्रेट में striatal explants द्वारा इन विट्रो में अध्ययन किया जा सकता है. इसके अलावा, कोलेजन मैट्रिक्स अन्य explants या आसपास 5 संदर्भ और 6 (उदाहरण देखें) में रखा कोशिकाओं द्वारा जारी प्रोटीन की अपेक्षाकृत स्थिर ढ़ाल के गठन के लिए अनुमति देता है. यहाँ हम पुर के लिए तरीके का वर्णनचूहे की पूंछ कोलेजन, डोपामिनर्जिक और striatal explants के के microdissection कोलेजन जैल और बाद immunohistochemical और मात्रात्मक विश्लेषण में, उनकी संस्कृति की ification. सबसे पहले, E14.5 माउस भ्रूण के दिमाग अलग और डोपामिनर्जिक हैं और striatal explants microdissected हैं. इन explants तो (सह) coverslips पर कोलेजन जैल में इन विट्रो में 48 से 72 घंटे के लिए सुसंस्कृत. इसके बाद, अक्षतंतु संबंधी अनुमानों neuronal मार्कर (जैसे tyrosine hydroxylase, DARPP32, या βIII ट्यूबिलिन) और अक्षतंतु विकास और आकर्षक या प्रतिकारक अक्षतंतु प्रतिक्रियाओं की मात्रा निर्धारित कर रहे हैं का उपयोग कर कल्पना की जाती है. इस neuronal तैयारी के लिए mesostriatal और striatonigral अक्षतंतु विकास और विकास के दौरान मार्गदर्शन के सेलुलर और आणविक तंत्र की इन विट्रो अध्ययन में एक उपयोगी उपकरण है. इस परख का उपयोग करना, यह भी डोपामिनर्जिक और striatal axons के लिए अन्य (मध्यवर्ती) लक्ष्य का आकलन करने के लिए संभव है या विशिष्ट आणविक संकेत परीक्षण.
1. चूहा पूँछ कोलेजन की तैयारी
चूहे की पूंछ के विच्छेदन (टिशू कल्चर हुड में):
(70% इथेनॉल में उपकरण रखने के लिए जब उन्हें प्रयोग नहीं है और यह सुनिश्चित करें कि सभी समाधान उपकरण, कांच के बने पदार्थ और इस प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया बाँझ हैं)
2. डोपामिनर्जिक 7,8 midbrain के विच्छेदन
सभी बाद विच्छेदन कदम बर्फ पर l15 मध्यम में प्रदर्शन कर रहे हैं.
3. Striatum के विच्छेदन
सभी विच्छेदन कदम बर्फ पर l15 मध्यम में प्रदर्शन कर रहे हैं.
4. विधानसभा कोलेजन मैट्रिक्स Assays
कोलेजन की तैयारी (बर्फ पर सभी कदम, विंदुक युक्तियाँ ठंडा का उपयोग करें)
कोलेजन जेल में सेटअप सह संस्कृति
5. Immunohistochemistry और मात्रा द्वारा विश्लेषण
विशेष तकनीक द्वारा ऊतकों में विशिष्ट एन्टिजनों का प्रदर्शन
पी / डी अनुपात की गणना की मात्रा का ठहराव
6. प्रतिनिधि छवियाँ
Axons की एक बड़ी संख्या डोपामिनर्जिक और striatal explants के के सफल संस्कृति के बाद उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग दृश्य या रूप में विरोधी βIII ट्यूबिलिन immunocytochemistry के द्वारा visualized हैं (नहीं दिखाया गया है). इन axons की एक सबसेट डोपामिनर्जिक या होगा कल्पना का उपयोग immunocytochemistry (चित्रा 3) के रूप में triatal axons. Quadrants में explants विभाजन के रूप में वर्णित किया और पी / डी अनुपात का निर्धारण करने के द्वारा, एक ख्यात अक्षतंतु आकर्षक या प्रतिकारक प्रभाव (3E चित्रा) की मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.
चित्रा 1 चूहे की पूंछ tendons से कोलेजन की तैयारी illustrating के तस्वीरें. एक अलग चूहे की पूंछ खींच), tendons को उजागर करता है. बी) tendons रस्सी की तरह बंडलों के रूप में दिखाई दे रहे हैं. सी), tendons करने के लिए अपने चमकदार सफेद रूप से नसों से भेद करने के लिए आसान कर रहे हैं. डी) एसिटिक एसिड में tendons भंग करने के बाद, डायलिसिस टयूबिंग समाधान के लिए स्थानांतरित कर रहा है. भंग कोलेजन ठंडा रखने के लिए, ट्यूब बर्फ पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी पर रखा जाता है.
ई. 2 "" = "/" files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg />
चित्रा 2 योजनाबद्ध प्रक्रिया के विभिन्न चरणों का संकेत है. उचित मस्तिष्क क्षेत्रों को विच्छेदित और explants उत्पन्न कटौती. एक एकल मध्यमस्तिष्क और striatal explant कोलेजन मैट्रिक्स में करीब निकटता में तैनात हैं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 48-72 घंटे के लिए विकसित करने के लिए छोड़ दिया Axons प्रतिदीप्ति immunohistochemistry द्वारा visualized हैं और एक पी / डी अनुपात chemotropic प्रतिक्रियाओं यों गणना की है.
चित्रा 3 प्रतिनिधि कोलेजन मैट्रिक्स संस्कृति में अक्षतंतु विकास दिखा परिणाम. ए) midbrain explant विरोधी tyrosine hydroxylase प्रतिरक्षी खुलासा अक्षतंतु परिणाम के साथ दाग. बिंदीदार रेखा आसन्न explant इंगित करता है. बी) एक व्यक्ति दिखा के neurites और विकास शंकु (तीर) का इज़ाफ़ा. सी) striatal explant विरोधी DARPP32 के साथ दाग. डी) सी बढ़ाई व्यक्ति neurites दिखा. ई) का उदाहरणपी / डी अनुपात मात्रा का ठहराव. Explants बराबर quadrants में विभाजित कर रहे हैं. समीपस्थ वृत्त का चतुर्थ भाग आसन्न explant का सामना करना पड़ रहा है, जबकि बाहर का वृत्त का चतुर्थ भाग से दूर का सामना करना पड़ रहा है. स्केल सलाखों के 100 माइक्रोन से संकेत मिलता है.
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कोलेजन मैट्रिक्स परख यहाँ वर्णित इस्तेमाल किया गया है और पिछले दशकों में कई अलग अलग प्रयोगशालाओं द्वारा सुधार अक्षतंतु मार्गदर्शन अणुओं और neuronal प्रणालियों की एक किस्म की जांच (जैसे 5-8 संदर्भ देखें). इन अध्ययनों से पता चला है कि इस परख अक्षतंतु मार्गदर्शन अलग लक्ष्य (मध्यवर्ती) ऊतकों द्वारा secreted अणुओं के प्रभाव और विनियमन के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है.
हालांकि, यह नोट किया जाना चाहिए कि कोलेजन मैट्रिक्स बाह्य वातावरण (ईसीएम) के लिए एक विकल्प है, लेकिन स्पष्ट रूप से कई सामान्य रूप से ईसीएम में मौजूद प्रोटीन का अभाव है. ईसीएम के घटक अक्षतंतु मार्गदर्शन के 10 अणुओं के प्रभाव को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है. फिर भी, कोलेजन मैट्रिक्स परख इन विट्रो में और अन्य ऊतक संस्कृति (जैसे organotypic टुकड़ा संस्कृतियों 11) दृष्टिकोण या अनुवांशिक इंजीनियर पशु मॉडल का विश्लेषण के साथ संयोजन में बुनियादी आणविक तंत्र की जांच के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. कई कारकों कोलेजन मैट्रिक्स परख की सफलता का निर्धारण करते हैं. सबसे पहले, explants की आकार इष्टतम अक्षतंतु विकास के लिए महत्वपूर्ण है. बड़े डोपामिनर्जिक और striatal explants अक्सर सीमित अक्षतंतु विकास को प्रदर्शित करते हैं, जबकि छोटे explants अनियमित और पूलिकाओं अथवा गुच्छों में उत्पन्न होने वाला परिणाम दिखाते हैं. इसके अलावा, व्यक्तिगत explants के बीच की दूरी बहुत प्रभाव एक secreted अणु आसन्न explants पर लागू कर सकते हैं को प्रभावित करती है. यदि explants भी दूर कर रहे हैं, प्रसारण अणुओं explants तक पहुँचने के लिए असफल हो जायेगी. इसके विपरीत, जब दूरी है बहुत छोटा axons आसन्न explants में बढ़ती है, यह मुश्किल गुणात्मक और मात्रात्मक अक्षतंतु विकास और मार्गदर्शन का आकलन करने के लिए बना सकते हैं. अंत में, चूहे की पूंछ कोलेजन की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है और सीधे axons और explants के अस्तित्व के परिणाम के साथ सहसंबद्ध है.
यहाँ वर्णित परख अलग अलग तरीके के लिए विशिष्ट अनुसंधान सवालों के पते में संशोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, के अलावामध्यम विकास के लिए एंटीबॉडी अवरुद्ध समारोह अणुओं (उम्मीदवार) के कार्यात्मक निषेध के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, explants सेल समुच्चय स्रावित विशिष्ट अक्षतंतु विकास और मार्गदर्शन कारकों के साथ जोड़ा जा सकता है. अंत में, explants को GFP संवाददाता चूहों में जो विशिष्ट neuronal आबादी और उनके axons में चिह्नित कर रहे हैं से प्राप्त किया जा सकता है. इस स्थापना का उपयोग कर, axons कोलेजन मैट्रिक्स परख के दौरान पीछा किया जा सकता है है.
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हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
कोलेजन मैट्रिक्स परख विकसित किया गया है और पिछले दो से तीन दशकों के दौरान कई विभिन्न अनुसंधान समूहों के काम में सुधार है. डोपामिनर्जिक और striatal explants के के लिए यहाँ वर्णित दृष्टिकोण बहुत इन अध्ययनों से लाभ. इसके अलावा, लेखक के लिए उसकी मदद के लिए striatal explant संस्कृतियों की स्थापना में Asheeta प्रसाद धन्यवाद करना चाहते हैं. प्रयोगशाला में काम मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम संगठन (कैरियर विकास पुरस्कार) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, नीदरलैंड स्वास्थ्य अनुसंधान और विकास संगठन (ZonMW - Vidi और ZonMW के टॉप), Europanian संघ (mdDA NeuroDev, FP7/2007-2011 के 222,999 अनुदान) (लिए RJP के लिए), और वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (TopTalent, ERES).
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA Laboratories | M11-004 | |
| Hepes | VWR international | 441476L | |
| β-Mercaptoethanol | Merck & Co., Inc. | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 61100-087 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
