Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Clinical and Translational Medicine

Fare kullanarak Trakeal Konstrüksiyon in vitro ölçümleri ise

, ,

Department of Physiology, UT Health Science Center, San Antonio

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE Clinical and Translational Medicine. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 54.234.126.92, User IP: 54.234.126.92, User IP Hex: 921337436

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Fare kullanarak Trakeal Konstrüksiyon in vitro ölçümleri ise

Semenov, I., Herlihy, J. T., Brenner, R. In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice. J. Vis. Exp. (64), e3703, doi:10.3791/3703 (2012).

Abstract: Fare kullanarak Trakeal Konstrüksiyon in vitro ölçümleri ise

Transgenik ve knockout farelerde havayolu 1,2 fizyolojisi ve patofizyolojisi soruşturma için güçlü araçlar olmuştur. Izole trakea preparatlarında in vitro tensometry olarak havayolu düz kas (ASM) genetiği değiştirilmiş farelerde kontraktil yanıt yararlı bir test olduğu kanıtlanmıştır. In vitro trakea preparatlarında Bu nispeten basit, sağlam bir yanıt sağlamak ve fonksiyonel kolinerjik sinir uçlarını ve kas yanıtları, hatta uzun inkubasyon sonrasında korurlar.

Trakeal tensometry da düz kas kasılması etkileyen ikincil haberci sinyal yolunun çeşitli çalışmak için işlevsel bir test sağlar. Trakeada daralma başta ASM (Şekil 1) üzerine asetilkolin serbest olduğunu parasempatik kolinerjik sinirler aracılığıyla olur. Büyük ASM asetilkolin reseptörlerini sırasıyla G i / o ve Gq reseptörler vardır muskarinik M2 ve M3 olan 3,6,7 gelen artış IP3 üretim ve IP3 aracılı kalsiyum salınımını aktive Gq için kaplin tarafından daralma çağrıştırıyor. M2 / G i / o sinyalizasyon cAMP düzeyleri 5,8,9,10 bir azalmaya yol adenilat siklaz inhibisyonu ile kasılmaları kazandırdığı düşünülmektedir. Bu yollar, hava yolu düz kas 11 sözde "farmakoekonomi daralma kaplin" oluşturmaktadır. Buna ek olarak, M2 reseptörleri ile kolinerjik sinyalleşme (ve M3 sinyal ile modüle) sırasıyla L-tipi, Gerilime-bağlı kalsiyum kanalları (Şekil 1) ve bu nedenle "eksitasyon-kasılması kuplaj" olarak adlandırılan kalsiyum girişini (aktive olan ASM depolarize yolları içerir ) 4,7. Havayollarındaki konstriksiyon kontrol sinyal yolları hakkında daha detaylı değerlendirme 4,12 bulunabilir. Yukarıdaki yolları fare ve diğer türler arasındaki korunacak görünür. Ancak, fare tracheas diğer türlerden farklı in Biraz sinyal yolları. En önemli histamin ve adenozin 13,14 ile kasılma cevapları, insan ve diğer türler 5,15 hem tanınmış ASM modülatörleri onların eksikliğidir.

Burada fare trakeal halkalar izolasyonu için protokoller ve kontraktil çıkışı in vitro ölçüm sunuyoruz. Dahil donanım konfigürasyonu açıklamaları vardır, trakea halkası izolasyonu ve kasılma ölçümleri. Örnekler voltaj bağımlı kalsiyum girişini etkinleştirmek için, yüksek potasyum sinirlerin uyarımı ve doğrudan ASM kas depolarizasyon kullanarak dolaylı kasılmaları çağrıştıran için verilmiştir (1. Yüksek K +, Şekil 1). Buna ek olarak, yöntemleri elektrik alanı stimülasyonu (2. EFS, Şekil 1) eksojen nörotransmiter kullanılarak ASM kas, ya doğrudan uyarılması banyosunda (3. Eksojen Ach, Şekil 1) ile tek başına uygulandığında sinirlerin uyarılara için sunulmuştur. Bu dsyaxibility ve hazırlama kolaylığı izole trakea halkası modeli havayolu düz kas kasılmasına yer çağlayanlar sinyal bir dizi için sağlam ve fonksiyonel testi vermektedir.

Protocol: Fare kullanarak Trakeal Konstrüksiyon in vitro ölçümleri ise

1. Ekipman

Bir daralma ölçüm cihazı temel bileşenler) Şekil 2A şematik olarak gösterilmiştir.

  1. Bir doku banyo. Doku banyo sıcak sıcaklığında oksijenli fizyolojik çözümü tutar. Farelerin trakea halkaları için bir ısınma çözümü, bir fritli cam balonu oksijen girişi (% 95 /% 5 O 2 / CO 2 karışımı) ve giriş ve değiştirmek için çıkış portu dolaştırmak için bir su ceketi içeren 10 ml organ banyosu kullanın çözümler. A rezervuar PSS çözeltisi% 95 arasında sabit bir köpürme 37 ° C'de su banyosunda (gösterilmemiştir). In /% 5 O 2 / CO 2 karışımı ile saklanır Çözüm borsaları, PSS çözümü nispeten hızlı çözüm döviz izin rezervuar yaklaşık 100 ml başına dakikada doku banyo girişi (alt noktası) pompalanır. Çözüm çıkış doku yarasa sabit hacim (~ 10 ml) sağlayan bir taşma noktası (üst noktası) aracılığıylaçözüm değişimi sırasında h. Biz (37 ° C korumak için) organ banyosuna ceket ile sıcak su pompalamak için bir Haake ısıtma sirkülatör kullanın. Doku banyoları tedarikçileri bir dizi elde edilen ve araştırmacının deney ihtiyaçlarına uygun boyutları ve stilleri çeşitli gelir edilebilir.
  2. Bir kuvvet dönüştürücü. Izometrik gerilim ölçmek için, trakeanın tüp iki paslanmaz çelik çubuklar (Şekil 2A) L-biçimli uçları üzerinde dişli. Bakım biyolojik madde ile uyumlu bir paslanmaz çelik türünü kullanmak alınmalıdır. Üst çubuk izometrik kuvvet dönüştürücü bir kelepçe ile bağlanır. Alt rot sabit bir konumda tutar trakea, ve pasif gerginlik ve / veya kas uzunluğunun ayarlanması için bir mikrometre üzerine monte edilmiştir. Trakeanın daralma preamplifier bir gerilim sinyaline dönüştürülür kuvvet dönüştürücü, üzerindeki gerginlik yaratır. Alt çubuğun ayrıca iki dikdörtgen platin levhalar (4 apart mm) t katmak için yapılandırılabilir şapka kanadını trakea (Şekil 2B). Platin plaklar trakea boyunca bir elektrik alan iletim sağlayan bir Ot S88 stimülatörü için kablolu vardır. Açık telleri ve lehim banyo solüsyonu içine metallerin liç önlemek için, Sylgard (Sylgard 184 Silikon Elastomer, Dow Corning Corp, Midland) ile kaplanmıştır.
  3. A / D dönüştürücüsü, bilgisayar ve toplama yazılımı. Sinyalleri preamplifikatörler bir MacLab 8 A / D sisteme kaydedilmektedir. Bu, mevcut ADInstrument Powerlab donanım eski bir sürümü. Biz deney boyunca gerilimin sürekli kayıt sağlayan programı tablosu (ADInstruments) kullanın. Trakea kas gerginliği nesil oldukça yavaştır ve bu yüzden saniyede 100 puan kazanımları yeterli bulacaksınız. Tansiyon ölçümü, her deneyden önce bilinen ağırlıkları (5 gram) kullanılarak kalibre edilir. Benzer sistemler diğer venders (örneğin, BIOPAC, GW Instruments) edinilebilir.
başlık "> 2. Trakea İzolasyon

  1. Doku daha önce izole kuvvet dönüştürücü bilinen ağırlıkları ile kalibre edilir, ve organ banyosunda (bakınız Tablo I) normal PSS ile doldurulur. Hava giriş O 2 / CO 2 hafif bir akış elde etmek için ayarlanır.
  2. İki ay veya daha eski farelerin Tracheas optimal. Genç hayvanları kullanılan fakat bu elde tracheas büyük beceri çünkü kendi küçük boyutu kuvvet dönüştürücü teller monte gerektirir olabilir. Diseksiyon önce, fareler derinden izofluran ile sedatize edilir. Forseps ile bir ayak-tutam, bir yanıt ortaya çıkarmak için mümkün olduğunda sedasyon uygun seviyeye ulaşılır. Fare hemen dör edilir Önemli bir not:. Biz Avertin (Tribromoethanol), yaygın olarak farelerde kullanılan sakinleştirici bir hava yolu düz kas gevşetici üzerinde güçlü etkileri vardır ve bu nedenle trakea daralma çalışmaları için kullanılmaması gerektiğini gözlemledim.
  3. Cilt (ve kürk) toraks gelen boğaz kaldırılır. Ribs sternumun tabanından, yanal (her iki tarafta) kalbin üst kesilir. Sternum ve kaburga sonra kalp / akciğer, timus, trakea (ventral) ve özefagus (- ve nefes borusu ile dorsal bağlı) ortaya çıkarmak için boğazına öne çekilir.
  4. Trakea bronş çatallanma altında ve yutak yukarıda keserek eksize edilir. Trakea bir buz gibi soğuk oksijenli (95/5) PSS çözeltisi (Tablo I de verilen bileşimi) içine yerleştirilir.
  5. Trakea çevreleyen dokuların temiz disseke edilir. Temizlik sırasında trakea yutak veya çatallanma altında tutulabilir. Ancak, dikkatli doğrudan trakea kendisine forseps uygulamamaya dikkat edilmelidir. Güzel makas çevre dokulara kesmek için kullanılabilir, ancak kesim her zaman zarar vermemek için trakea paralel yapılmalıdır. Trakea hazırlık Sylgard kaplı tabağa çatallanma altında ve yutak yukarıda tutturulmuş ise prosedürü bu bölümü (Sylgard 184 Silikon kolaylaştırılırElastomer, Dow Corning Corp, Midland).
  6. Çevre doku çıkarıldıktan sonra, trakea yutak altında ve bronşiyal bifurkasyon üzerinde kesilir ve hafifçe kuvvet dönüştürücü kablo üzerine monte.
  7. Trakea iki L-şekilli metal dişleri (Şekil 2A) içinde akıtılan edilir. Bir ucu izometrik gerilim sürekli kayıt için bir kuvvet-yerdeğiştirme transdüktör bağlanmıştır. Başka bir ucu bir mikrometre bağlanmıştır. Doku banyo sonra trakea PSS batırılır böylece ortaya çıkar. Trakea montajı trakea PSS dışında tutulur süreyi en aza indirmek için mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. Uygulama ile, trakea montaj bir dakika içinde yapılır ama biz genellikle canlılık kaybını önlemek için kat daha uzun süre 3 dakikadan daha kaçınmak olabilir.
  8. Mikrometre yavaş ~ 10 mN (~ 1 gram-kuvveti) pasif bir gerilim elde etmek için ayarlanır. Optimal istirahat gerginliği ampirik olarak belirlendi ve ~ 5 arasında bir pasif gerginliği bulduk - 1Yüksek potasyum stimülasyon eşdeğer, maksimal yanıt 0 mN sonuçları. Bu durum, bu aralık içinde bir pasif 16,17,18 gerginliği kullanan diğer bir dizi çalışma ile tutarlıdır. İlk 5-10 dakika içinde, trakea pasif gerilimin biraz azalması (stres gevşeme fenomeni) ve mikrometre dengeleme sırasında ~ 10 mN için pasif gerginliği ayarlamak için kullanılır eğilimindedir. Trakea deneysel zorlukları önce en az 1 saat dengelenmeye izin verilir.

3. Yüksek Potasyum Stimülasyon

Aşağıdaki dengelenme, trakea yüksek potasyum PSS solüsyonu (67 mM KCl, Tablo I) ile iki kez meydan. Kasılması genellikle organ banyosu tamamen trakea dinlenmek için normal bir PSS ile birkaç kez yıkanır kararlı durum hangi zaman ulaşmak için 5-10 dakika gerekir. Potasyum kasılması, ikinci bir kez tekrarlanır ve tekrarlanabilir kasılmaları kadar üçüncü bir kez (gerekirse) elde edilir.

Trakea hazırlık elektrik alan stimülasyonu (EFS) izin veren iki dikdörtgen platin levhalar (elektrotları) arasında yer alır. EFS kasılma cevapları frekans ve gerilim bir fonksiyonudur. Aynı zamanda bu elektrot alanı ve aralarındaki mesafe gibi fiziksel parametreler tarafından etkilenir. Stimülatör gücü özellikleri de yüksek gerilim ve akım çıkışları da stimülatör maksimum ulaşabileceğiniz gibi yanıtları etkiler. Herhangi bir EFS sistemin özellikleri uyaran süreleri, frekansları, gerilimler ve darbe süreleri farklı olarak kas kasılmaları incelenerek tespit edilmelidir. Bizim deney düzeneği için, ~ 4 mm ile ayrılmış elektrotlar ve 44 V (0.5 ms baklagiller) ve 30 Hz uyarımı genliği tekrarlanabilir yakın maksimum kasılma cevapları elde etmek için en uygun bulduk.

5.. Daralma EvKolinerjik Stimülasyon tarafından oked

Eksojen olarak uygulanan bileşikler trakea yanıt kümülatif doz moda ilacın birden eklemelerle, ilgi ilacın tek bir dozunun ek ile değerlendirilir veya edilir. Trakea, bizim laboratuar rutin asetilkolin aksine, karbakol asetilkolinesteraz tarafından bozulmuş değildir, çünkü kolinerjik reseptörleri aktive karbakol kullanılır. Makul bir doz-yanıt aralığı 10 -8 10 -5 M karbakol etmektir. Log takılması bir Hill-tipi denklemi [karbakol]-kontraktil yanıt eğrisi kolinerjik 19 trakeal daralma hassasiyet ölçüsüdür EC 50 (yarı maksimal etkin konsantrasyon) bir tahmin sağlar. Bu karbakol'ün belirli bir dozda kümülatif doz yanıt eğrisinin bir parçası olarak değil, tek bir doz olarak biraz daha fazla cevap verecektir dikkati çekiyor.

6. Temsilcisi Sonuçlar Potasyum, yüksek bir kontraktil tepkisi bir örneği Şekil 3A 'de gösterilmiştir. Daralma yaklaşık 10 dakika içinde maksimuma ulaşır, ancak daha sonra küçük bir düşüş gösterebilir. Yüksek potasyum erken yıkanma sırasında, kas çözüm hatlarında ısıtmasız PSS çözümün küçük hacimli geçici hazırlık perfuses sıra sıcaklık düşüşü nedeniyle daralma geçici bir artış gösterebilir. Bu ısıtmalı PSS rezervuar ve doku banyo bağlayan boru minimum ölü hacme sahip en aza indirilebilir, hem de nispeten hızlı bir şekilde çözüm alışverişi yaparak (genellikle biz ml / dk 100 çözümler pompa) olabilir. Her hazırlık kas kütlesi veya diseksiyon sırasında oluşan hasar farklılıklar nedeniyle kontraktil yanıt olarak bazı farklılıklar olacaktır. Şekil 3B yüksek potasyum ve karbakol ile meydan farklı kas kütlesi iki tracheas gösterir. Kolinerjik-uyarılmış kasılmaları farklı olmasına rağmen,y normalleşme sonra yüksek potasyum solüsyonu (Şekil 3C) ile yanıt benzer.

Şekil 4, tek doz (A) ve kümülatif bir artış (B) kullanılarak bir karbakol (kolinerjik) uyarılmış kasılması bir örneğini göstermektedir. Karbakol çözümler banyo doğrudan eklendi ve kabarmış gaz hızlı karıştırma yardımcı olur edilir. Tek doz (yani 1 uM, Şekil 4A) Buna ek fazlalaştı kümülatif doz-yanıt eğrisi (1 uM, Şekil 4B) sırasında eşdeğer konsantrasyon göre biraz daha büyük tepki var iyisidir. Şekil 4C kasılma gücünün bir komplo gösterir Şekil 4B verileri kullanarak karbakol konsantrasyonları bir fonksiyonu olarak. Karbakol'ün Etkileri 10 -5 M konsantrasyonda doyurabilecek. Kolinerjik agonistler kalsiyum salınımını mekanizmalar aracılığıyla kasılma başlatır rağmen, daralmanın önemli bir bileşeni de depolarizasyon aracılık ve birGerilime-bağlı kalsiyum kanalları 20 aktivasyonu.

Şekil 5A EFS-uyarılmış kasılmaların bir örnek gösteriyor. Tracheas kasılmalar bir plato (inset a1 bakınız) ulaşana kadar 0.5 milisaniye süresi, 40 Volt pulslar kullanılarak uyarılır. Stimülasyon sıklığında bir artış artan bir kasılma cevapları (frekans cevabı eğrisi Şekil 5B çizilir) neden olur. Elektrik alan stimülasyonu presinaptik sinirleri aktive ederek ağırlıklı olarak kasılmalar uyandırmak için gösterilmiştir. Bu botulinum toksini, trakea 21 EFS-uyarılmış kasılmaların çoğunluğu bloke nörotransmitter sürüm bir engelleyici etkisi ile kanıtlanır. Ayrıca, tetrodotoxin, bloklar Na + kanalları da sinir aktivitesini inhibe ettiğini ve EFS için trakeanın yanıt ortadan kaldırdığı bir ajan.

Şekil 1
Şekil 1. T Diyagramıo bir izole trakea hazırlık sinyal yollarının büyük. Gösterilen bir trakeal düz kas hücresi innerve eden kolinerjik akson terminali. Önemli sinyal yolları IP3 reseptörleri (M3) ve cAMP azaltma (M2) yoluyla kalsiyum salınımına neden M3-ve M2-muskarinik asetilkolin reseptör aktivasyonu (mACHR) vardır. M2 reseptörleri (ve M3 reseptörleri bazı katkısı) de L-tipi voltaj bağımlı kalsiyum kanalları ve kalsiyum girişini aktive kolinerjik-uyarılmış depolarizasyon neden olur. Yaygın kontraktil ajanlar ve bunların efektörlerinin 1 vardır. yüksek potasyum (düz kas hücresi ve kolinerjik akson depolarize), 2. elektrik alan stimülasyonu (EFS, kolinerjik akson depolarizes) ve 3. Böyle asetilkolin veya karbakol gibi kolinerjik ilaçların eksojen uygulaması (doğrudan muskarinik reseptörleri aktive eder).

Şekil 2
Şekil 2. Trakeal kasılmaları ölçmek için kullanılan ekipman Diyagramı. A. kuvvet dönüştürücü, mikrometre ve doku banyo vida klemensleri üzerinden çubuklar destek üzerine monte edilir. Trakeal halka üst ve alt çubuklar üzerinde dişli. Diyagramda, organ banyosunda (kuvvet dönüştürücü üzerine trakea montaj sırasında, yani) hazırlanması altında konumlandırılmıştır. Daralma çalışmaları sırasında, organ banyosu hazırlanması yıkanmak için dikey olarak taşınır. Elektrik alan stimülasyonu alt çubuğun B. trakea tutma tel yanal monte edilmiş iki platin levha içerecek şekilde değiştirilir. Platin plakalar bir uyarıcı elektrik telleri ile birbirine bağlanmıştır.

Şekil 3
Şekil 3. Yüksek potasyum örnekleri (67 mM) trakeanın kasılma cevapları. (A), yüksek potasyum yinelenen, tekrarlanabilir tepkilerini gösterir. (B), iki farklı tracheas of karbakol için kontraktil tepkisi örnekleri. Normalize zaman (C) B tracheas cevapları benzeryüksek potasyum yanıt d.

Şekil 4
Şekil 4. Karbakol indüklenen kasılmaları örnekleri. (A), tek doz kullanılarak Karbakol indüklenen kasılmaları yıkanmaya izledi. A. trakea (C) B'den Tepe kasılmaları için (B) Örnek kümülatif doz-yanıt eğrisi karbakol konsantrasyonunun işlevi olarak çizilen.

Şekil 5,
Şekil 5. Elektrik alan stimülasyonu ile uyarılmış kasılmaları örnekleri. 0.5 ms darbe, 40 volt, ve çeşitli stimülasyon frekansları kullanarak trakea kasılması (A) Elektrik alan stimülasyonu olarak gösterilir. Ankastre 30 Hz'de zaman genişletilmiş kasılmasıdır. (B) A dan Tepe kasılmaları plotte vardırstimülasyonu frekansının bir fonksiyonu olarak d.

Normal PSS

Tuz Conc. (MM) Miktarı (gram / ​​2 L)
NaCl 119 13.91
KCl 4.7 0.7
KH 2 PO 4 1.18 0.32
MgSO 4 x 7H 2 O 1.17 0.58
NaHCO 3 18 3.02
EDTA 0.026 0.5 M, 0.1 mL
Glikoz 11 3.96
Sakaroz 12.5 8.56
CaCI2 2 10 mM, 400 ml

Yüksek K + PSS (NACl ve KCl ayarlamaları)

Tuz Conc. (MM) Miktarı (gram / ​​2 L)
NaCl 56.7 6.628
KCl 67 9.991

. PSS çözümleri için Tablo 1 Reçete Not:. Çözümler ultra saf su kalitesi ile, haftalık taze yapılır, ve büyüme kirlenmesini önlemek için 5 gün daha uzun süre buzdolabında saklanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: Fare kullanarak Trakeal Konstrüksiyon in vitro ölçümleri ise

Burada sunulan protokol yolu kas fonksiyonunu değerlendirmek için fizyolojik bir hazırlık sağlar. Biz genellikle aynı anda 3-4 organı banyo müstahzarları faaliyet Ancak, paketlenmiş sistemleri 8 preparatları (ADInstruments, Dünya Hassas Aletler ve Harvard Apparatus) kadar eş zamanlı ölçümler izin tedarikçileri bir dizi edinilebilir. Biz eşdeğer sonuçları ile kuvvet dönüştürücüler ve doku organ banyolarına bir dizi kullanmış olurlar. Ancak, elektrik alan stimülasyonu uyarıcı elektrotlar boyutu, elektrot plakalar arası uzaklık, ve elektrik alanı içinde hazırlık konumu arasında küçük farklılıklar dayalı bazı değişkenlik sağladığını bulabilirsiniz. Böylece, ekstra bakım mümkün olduğunca benzer bir şekilde alan elektrotlar yapmak için yapılmalıdır.

Izometrik kuvvet ölçümleri en önemli parametre biri kas kütlesini varyasyonlar telafi etmek için kasılmaları normalize konusu olduğu, veyafarklı hazırlıklarını arasındaki kas dokusunun sağlık. Bölümünde, farklılıklar aynı yaş ve aynı cinsten (dişi farelerde düşük trakea gerginlik üretmek için eğiliminde) hayvanları karşılaştırarak minimize edilebilir. Ayrıca, biz trakea ıslak veya kuru ağırlığı normalleşme fare trakeanın küçük boyutları nedeniyle muhtemelen yeterli hassasiyet, yoksun olduğunu bulduk. Daha ziyade, birden çok yüksek potasyum, kasılmaların kullanımı oldukça avantajlıdır. Yüksek potasyum kasılmaları iki amaca hizmet ediyor. Yüksek potasyum kasılma trakeal kas "uyandırmak" için görünür ve kasılmaları, deneysel zorlukları geçmeden önce tekrarlanabilir olmasını sağlar. Yüksek potasyum daralmanın da hazırlanmasında mevcut aktif kas kütlesi için doğru bir normalleşme görünmektedir. Böylece, deneysel gerilim ölçümleri genellikle yüksek potasyum kasılma normalize kuvvet olarak ifade edilir. Buna ek olarak, bir preparat kalitesi yüksek potasyum indüklenen anlaşma kullanılarak değerlendirilebiliriyon. 10 haftalık C57BL/6J erkek fareler 20 yüksek potasyum bağlı kasılma ± 3.8 mN (± standart sapma, n = 17 ortalama) var - Örneğin, biz 8 bulabilirsiniz. De bu aralığı (12 mN veya aşağıda iki standart sapma aşağıda) altında trakea hazırlık sözleşmeler, o zaman genellikle deney için kullanılan "hasarlı" ve olmayan olarak kabul edilir. Alternatif olarak, satüre kolinerjik maksimum gerilim gerilim normalizasyon kullanılabilir. Bu agonist duyarlılık değişiklikleri gözlemlemek için yararlıdır, ama bu etki maksimum kontraksiyon değişiklikleri kaçırabilirsiniz.

Yöntem, bir kolinerjik veya elektrik stimülasyonu ile kullanarak ya da daralma etkinleştirmek için sunuldu. Doku banyosuna kolinerjik uygulama doğrudan düz kas harekete geçirir. Buna karşılık, orta EFS stimülasyon frekansı (en çok 25 Hz) kasılma çoğunluğu sinir aktivasyonu ve neurotransmi serbest bırakılması ile olurtter 22. Böylece araştırmacı EFS stimulasyonla presinaptik / sinir-aracılı kasılma etkileyen ilaçlar araştırmak için fırsat vardır. Son olarak, bu tür çalışmaların 24, aynı zamanda izole trakea hazırlanmasında kasılma etkilemek mast hücreleri 23 ve epitel hücreleri gibi diğer hücre tipleri göstermektedir. Böylece, in vitro fare trakea hazırlık hava yolu düz kas kasılmalarını etkileyen hücre tiplerinin bir dizi için sağlam bir fonksiyonel ölçüm sağlar.

Özet olarak, in vitro trakea hazırlık farenin solunum fonksiyonlarını etkileyen genetik değişimler analizinde özellikle yararlı olmuştur. Bazı örnekler iyon kanalları 17,20,25,26, metabotropik reseptörler 27,28,29,30 gen tırnakları analizini içerir ve aşağı kaskadlar 31 sinyalizasyon. In vitro ve 32 ek olarak, antijen meydan fare sık astım çalışmaları için kullanılırtrakea hazırlık astım aşağıdaki gelişimi ensues kontraktilite değişiklikler için yararlı bir test sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Fare kullanarak Trakeal Konstrüksiyon in vitro ölçümleri ise

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements: Fare kullanarak Trakeal Konstrüksiyon in vitro ölçümleri ise

Bu çalışma Önleme Yenilik Merkezi ve Havayolu Hastalıkları, NINDS hibe (NS052574), Tedavi gelen ve Astım Araştırma Sandler Programı bir hibe ile finanse edildi.

Materials: Fare kullanarak Trakeal Konstrüksiyon in vitro ölçümleri ise

Name Company Catalog Number Comments
Analogue-Digital Converter ADInstruments PowerLab 4/35
Carbachol (Carbamoylcholine Chloride) Sigma-Aldrich C4832 10-2 M in water (aliquots can be stored at -20°C)
Charting Software ADInstrtuments LabChart
Heating Circulator Haake Mixer Mill MM400
Isometric Force Transducer Kent Scientific TRN001
Stimulator Grass Technologies S88 Dual Output Square Pulse Stimulator
Tissue Bath WPI 47264

References: Fare kullanarak Trakeal Konstrüksiyon in vitro ölçümleri ise

  1. Lloyd, C.M. Building better mouse models of asthma. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).
  2. Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J.H., & Finotto, S. Transgenic models in allergic responses. Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).
  3. Eglen, R.M., Hegde, S.S., & Watson, N. Muscarinic receptor subtypes and smooth muscle function. Pharmacol Rev. 48, 531-565 (1996).
  4. Ehlert, F. J. Contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in gastrointestinal, airway and urinary bladder smooth muscle. Life Sci. 74, 355-366 (2003).
  5. Hall, I. P. Second messengers, ion channels and pharmacology of airway smooth muscle. Eur. Respir. J. 15, 1120-1127 (2000).
  6. Berridge, M.J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
  7. Ehlert, F.J. Pharmacological analysis of the contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in smooth muscle. Receptors Channels. 9, 261-277, [pii] WXGN8U2UVYPQCHN5 (2003).
  8. Sankary, R.M., Jones, C.A., Madison, J.M., & Brown, J.K. Muscarinic cholinergic inhibition of cyclic AMP accumulation in airway smooth muscle. Role of a pertussis toxin-sensitive protein. Am. Rev. Respir Dis. 138, 145-150 (1988).
  9. Widdop, S., Daykin, K., & Hall, I.P. Expression of muscarinic M2 receptors in cultured human airway smooth muscle cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9, 541-546 (1993).
  10. Karaki, H., et al. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle. Pharmacol. Rev. 49, 157-230 (1997).
  11. Somlyo, A.V. & Somlyo, A.P. Electromechanical and pharmacomechanical coupling in vascular smooth muscle. J. Pharmacol Exp. Ther. 159, 129-145 (1968).
  12. Fryer, A.D. & Jacoby, D.B. Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158, S154-160 (1998).
  13. Fernandez-Rodriguez, S., Broadley, K.J., Ford, W.R., & Kidd, E.J. Increased muscarinic receptor activity of airway smooth muscle isolated from a mouse model of allergic asthma. Pulm. Pharmacol. Ther. 23, 300-307 (2010).
  14. Garssen, J., Van Loveren, H., Van Der Vliet, H., & Nijkamp, F.P. An isometric method to study respiratory smooth muscle responses in mice. J. Pharmacol. Methods. 24, 209-217 (1990).
  15. Vass, G. & Horvath, I. Adenosine and adenosine receptors in the pathomechanism and treatment of respiratory diseases. Curr. Med. Chem. 15, 917-922 (2008).
  16. Borchers, M.T., et al. Methacholine-induced airway hyperresponsiveness is dependent on Galphaq signaling. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285, L114-120, doi:10.1152/ajplung.00322.2002 [pii] 00322.2002 (2003).
  17. Sausbier, M., et al. Reduced rather than enhanced cholinergic airway constriction in mice with ablation of the large conductance Ca2+-activated K+ channel. Faseb. J. 21, 812-822 (2007).
  18. Scheerens, H., et al. Long-term topical exposure to toluene diisocyanate in mice leads to antibody production and in vivo airway hyperresponsiveness three hours after intranasal challenge. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159, 1074-1080 (1999).
  19. Kenakin, T.P. A pharmacology primer : theory, applications, and methods. 3rd edn., Academic Press/Elsevier, (2009).
  20. Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J.T., & Brenner, R. BK Channel {beta}1 Subunits Regulate Airway Contraction Secondary to M2 Muscarinic Acetylcholine Receptor Mediated Depolarization. J. Physiol., 1803-1817 (2011).
  21. Moffatt, J.D., Cocks, T.M., & Page, C.P. Role of the epithelium and acetylcholine in mediating the contraction to 5-hydroxytryptamine in the mouse isolated trachea. Br. J. Pharmacol. 141, 1159-1166 (2004).
  22. Bachar, O., Adner, M., Uddman, R., & Cardell, L.O. Nerve growth factor enhances cholinergic innervation and contractile response to electric field stimulation in a murine in vitro model of chronic asthma. Clin. Exp. Allergy. 34, 1137-1145, doi:10.1111/j.1365-2222.2004.1868.x [pii] CEA1868 (2004).
  23. Weigand, L.A., Myers, A.C., Meeker, S., & Undem, B.J. Mast cell-cholinergic nerve interaction in mouse airways. J. Physiol. 587, 3355-3362, doi:10.1113/jphysiol.2009.173054 [pii] jphysiol.2009.173054 (2009).
  24. Kao, J., Fortner, C.N., Liu, L.H., Shull, G.E., & Paul, R.J. Ablation of the SERCA3 gene alters epithelium-dependent relaxation in mouse tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. 277, L264-270 (1999).
  25. Krane, C.M., et al. Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119, doi:10.1073/pnas.231273398 [pii] 231273398 (2001).
  26. Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J.T., & Brenner, R. BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle. Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-810 (2006).
  27. Fortner, C.N., Breyer, R.M. ,& Paul, R. J. EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P, ATP, and PGE2. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, L469-474 (2001).
  28. Hay, D.W., et al. Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice. Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915, doi:10.1038/sj.bjp.0703957 (2001).
  29. Stengel, P.W., Yamada, M., Wess, J., & Cohen, M.L. M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-1449, doi:10.1152/ajpregu.00486.2001 (2002).
  30. Trevisani, M., et al. Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder. Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300, doi:10.1038/sj.bjp.0702410 (1999).
  31. Mehats, C., et al. PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction. FASEB J. 17, 1831-1841, doi:10.1096/fj.03-0274com [pii] 17/13/1831 (2003).
  32. Kumar, R.K., Herbert, C., & Foster, P.S. The "classical" ovalbumin challenge model of asthma in mice. Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).

Ask the Author: Fare kullanarak Trakeal Konstrüksiyon in vitro ölçümleri ise

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter