神経芽細胞アッセイ：フローサイトメトリーを用いて神経幹細胞の子孫を差別から神経前駆細胞の生成と濃縮のためのアッセイ

1。基本は、細胞培養に進む前に設定

1. NeuroCult NSC基礎培地とNeuroCult NSC増殖サプリメントは、完全なNSC培地を作るために、それぞれ、9:1の割合で混合されています。
2. 37°Cの水浴は、培地を温めるために使用されます。
3. 熱不活性化ウシ胎児血清（FCS）の適切な量を解凍しています。
4. 上皮成長因子（10μg/ mlのEGF）、リン酸塩の基本的な線維芽細胞成長因子（β-FGF 10μg/ mlの時）、0.2％ヘパリン溶液を含む株式成長因子ソリューションの適切な量の食塩水（PBS）緩衝解凍されています。
5. 組織培養フラスコ（T25、T75または＆T175）は、NSCの拡張や差別化のために必要とされている。
6. 組織培養は、96および24ウェルプレートに扱われ、カバーガラスは、選別された細胞をプレーティングするために必要とされている。

2。 NSCの分離、および拡張（継代）

1. 神経幹細胞および前駆細胞は、マウスBから分離され、展開されます。別々のプロトコル^1、2、3に記載のように雨。
2. ニューロスフェア（プライマリまたは継代神経）は、継代培養（直径150から200μm）のための準備が整ったら、球を含有する培地は、適切なサイズの滅菌組織培養チューブに移し、5分間800回転（110 g）で遠心分離し室温で。
3. 上清培地を除去し、球は予め温めておいた0.05％トリプシン-EDTA 1 mlに再懸濁されています。
4. 2〜3分間、37℃水浴中でインキュベートした後、大豆トリプシンインヒビター等量のトリプシンの活性を停止するには、細胞懸濁液に添加されています。
5. トリプシンは完全に不活化されていることを確認するために、細胞懸濁液を穏やかにピペッティングされており、ダウン3-5回。
6. 5分間800回転（110 g）で遠心分離後、上清を除去し、細胞は完全なNSC培地1mlに再懸濁されています。
7. 細胞懸濁液10μlのはtrypa90μlのと混合されるn個のセル数を実行する青。
   注：その他の適切な細胞希釈液を使用することもできます。
   
8. その後、細胞を継代培養^1、2、または下記のように差別化のために使用されています。

3。神経幹細胞や前駆細胞の分化、 神経芽細胞アッセイ（NBA）

1. 解離神経から得られた細胞を20 ng / mlのEGF、10 ng / mlのbFGFを、0.2％ヘパリンを1μl/ mlとし、5％を添加した完全なNSC培地中で2〜3×10 ⁵細胞/ mlの濃度でメッキされています熱は適切なサイズの組織培養フラスコ中でFCSを不活性化。 5 mlの培地は、T25、T175フラスコ用T75、40 mlの20ミリリットルのために使用されます。
   注 ：FCSは、細胞がしっかりと基板に接続するようになりますとNBA培養用コーティングフラスコの必要はありません。
   
2. カルトUREフラスコは、その後3〜4日、5％CO ₂で37℃の加湿インキュベーター中でインキュベートされています。 NSCの子孫が基板に付着した細胞の単層として増殖する時に、この期間は、 増殖段階と呼ばれています。
3. 文化は90〜95％コンフルエントになると、各々のフラスコの培地は、どの成長因子なしで5％FCSを添加した完全なNSC培地に切り替えられます。
4. 培養フラスコを再び別の3〜4日、5％CO ₂で37℃の加湿インキュベーター中でインキュベートされています。神経前駆細胞が星状膠細胞単層の上に表示され、未熟な神経細胞のコロニーを作るために増殖する時にこの期間は、 分化段階と呼ばれています。分化段階の日4-5、文化は、フローサイトメトリー技術を用いた神経芽細胞の分離の準備ができています。

4。フローサイトメトリー用細胞の調製

Trypsinization

1. 分化段階の日4-5 NSCの子孫を差別の文化は文化からFCSを削除するには、PBSの適切な量（T25用2ミリリットル、T175フラスコ用T75 8 mlの4ミリリットル）で1回洗浄されています。
   注：FCSブロックトリプシン-EDTA活動。
   
2. その後、予め温めておいた0.05％トリプシン-EDTAのに十分な量（T25用2ミリリットル、T75とT175フラスコのために8ミリリットル4 ml）を細胞単層をカバーするために、各フラスコに加え、1〜2分間インキュベートする37℃の加湿インキュベーター。
3. フラスコは、培養上のトリプシン-EDTAの効果を評価するために顕微鏡下でチェックされます。次いでフラスコを片手で保持し、フラスコの底から細胞を取り除くために、もう一方の手でしっかりと打たれています。
4. 大豆トリプシンインヒビター等量のトリプシン活性をクエンチするためにフラスコに添加される。細胞懸濁液を穏やかにトリプシン不活化を確実にするために、均一な単一のセルを達成するために上下にピペッティングしているサスペンション。
   注：別の方法として、5％FCSを添加した培地は、トリプシン活性をクエンチするために使用することができる。
   
5. 非解離塊を削除するには、細胞懸濁液を40μmのサイズのメッシュフィルターを通過させる。
6. 細胞懸濁液は、その後5分間800回転（110グラム）で遠心分離し、上清を除去し、細胞は完全なNSC媒体の適切なボリュームに再懸濁されています。
7. 細胞懸濁液の最終容量は、細胞密度は2-3X10 ⁶ -cells/mlを超えないように調整されます。高細胞密度は、フローサイトメトリーマシンのストリームの閉塞を引き起こす可能性があります。
8. あなただけの物理的性質に基づいて神経細胞を分離したい場合には、今はパート4で説明したようにソートFACSに進むことができます。
9. ソートする前に、ヨウ化プロピジウム（PI、シグマ、PBSで500μg/ mlの）は、死細胞を除外するために細胞懸濁液の1μl/ mlの濃度で添加されています。

ライブセルリットル免疫標識

その後NBA培養物から採取し、単一のセルがPSA-NCAMのために染色することができ、神経細胞の高純度を達成するため（初期の未熟な神経前駆細胞のマーカー）とする神経細胞の集団から陽性細胞は、FACSのマシンを使用して単離することができる。

1. 細胞計数を行った後、NBAの文化からの単一細胞懸濁液は、4つのグループに分かれています。
   • 細胞単独群は、パラメータとゲート（0.5-1×10 ⁶細胞）を調整するためのコントロールとして機能します。
   • 細胞に加え、PIは、パラメータとゲート（0.5から10×10 ⁶細胞）を調整するためのコントロールとして機能します。このグループからPI陰性細胞は、細胞の物理的特性に基づいてソートすることができます。
   • また、パラメータとゲート（1-2×10 ⁶細胞）を調整するためのコントロールとして二次単独（アイソタイプ対照）群。
   • 達成するためにPSA-NCAMのために染色された免疫標識グループ（8-10×10 ⁶細胞）未熟な神経細胞のさらなる精製。ソート時に死んだ細胞を除外するには、PIは、同様にこのグループに追加されます。
2. 免疫標識を開始するには、細胞を5分間800回転（110 g）で遠心分離されています。上清を除去し、細胞は完全なNSCの培地100μlに再懸濁しています。
3. フィコエリスリン（PE）標識抗PSA-NCAM抗体は、PSA-NCAMのために染色される細胞懸濁液に10μL/ 5から10×10 ⁶細胞の割合で添加されています。同じように、PE結合マウスIgG1アイソタイプコントロール抗体はアイソタイプコントロール細胞懸濁液に添加されています。使用する抗体の濃度に関する抗体仕様書の指示に従ってください。細胞懸濁液を穏やかに混合し、暗所で10〜15分間室温でインキュベートされています。
4. 細胞懸濁液（PSA-NCAMとアイソタイプコントロールチューブ）は、5分間800回転（110 g）で遠心し、上清を除去し、細胞が再suspeにあります完全なNSC培地1 mlにnded。
5. サンプルから過剰な非有界抗体を除去するには、ステップ4は、2〜3回繰り返されます。
6. 媒体の適切なボリュームの再懸濁する細胞の後、ヨウ化プロピジウム（PI、シグマ、PBSで500μg/ mlの）は、細胞懸濁液（細胞を加えたPI、アイソタイプコントロールおよび1μlの/ mlの濃度で添加されるPSA-フローサイトメトリーによって分析したときにNCAM染色サンプル）は、死細胞を除外することができます。
7. 完全培地1 mlを含む15 mlの滅菌ファルコンチューブは、さまざまな細胞集団から選別された細胞を収集するために用意されています。

5。未熟な神経細胞の蛍光活性化セルソーティング（FACS）

1. FACSマシンは、フローサイトメトリー施設の専門技術を介してそのマニュアルの指示に基づいて設定されています。
2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）または他の適切なソリューションディペンディンのバッファ製造元の指示にgは、90μmのノズルから28 PSIにシース液として使用することができます。
3. システム上の差圧は、ソートのトリガー率が2500イベント/秒を超えないよう調整されます。
4. 単独で細胞から細胞懸濁液グループは、FACSのマシンを介して実行されます。
5. まず、細胞（イベント）は、異なる細胞集団を区別するために、その大きさ（前方散乱光（FSC）の光）対内部の複雑さ（側方散乱（SSC）の光）に基づいてプロットされます。これを行うには、FSCとSSCの電圧パラメータは、細胞はフローサイトメトリープロットで見ることができるように調整する必要があります。
6. 細胞塊とダブレットを除外するには、細胞を、最初に前方散乱領域に基づいてプロットされる（FSC-）に対する前方散乱パルス幅（FSC-W）と、単一の細胞集団は、人口1（P1）としてゲートされます。次にP1細胞は側方散乱領域（SSC-A）対側方散乱光のパルス幅（FSC-W）と、単一の細胞がピストルであるこの時間に基づいてプロットされます人口2（P2）とED。これら二つの連続した​​ゲート、塊またはダブレット（高FSCパルス幅と高いSSCパルス幅）が除外されている確立した。
7. 死亡または損傷した細胞を除外するには、単一の細胞は、（P2）FSC-、単一生細胞集団にゲートが対PIの反応に基づいてプロットされます。
8. 単一生細胞は、細胞の大きさと内部の細かさに基づいて、異なる細胞集団を区別するためにFSC対SSCに基づいてプロットされます。この段階では、二つの細胞集団は、FSC ^の低い SSC ^低い （P3）とFSC ^高い SSC ^高い （P4）の細胞集団としてのゲートがあります。
9. （セルプラスPIおよびアイソタイプコントロール）コントロールからは、最初にFSC ^の低い SSC ^低い集団からFSC ^低い SSC ^低い人口がPSA-NCAM免疫反応性未熟な神経細胞をソートするためにグループはFSCと負対PEの免疫反応に基づいてプロットされます細胞は、（P5）ゲートであり、PSA-NCAMからその後陽性細胞染色されたグループは、人口6（P6）とゲートがあります。
10. 必要なすべてのゲートを調整した後、興味の細胞は、1ミリリットルNSC培地を含む15 mlの滅菌組織培養管に分類されます。
11. ソートされた細胞は、その後5分間1200rpmで（240 g）で遠心分離されています。
12. 上清を捨て、ペレットを培地の適切なボリュームに再懸濁している（ペレットサイズに依存）とセル数が実行されます。
13. その後、細胞を5％FCSおよび20 ng / mLのヒト組換えBMP4 ⁵で完全にNSC培地の200から250μlの20から30×10 ³細胞/ウェルの密度でポリ-L-オルニチン被覆96ウェルプレートに播種されている。

注：コート96ウェルに、ポリ-L-オルニチンのワーキング溶液（1.5ミリリットルポリ-O、滅菌PBS 8.5 ml）を各ウェルに添加し、プレートは、少なくとも一つのために、37℃インキュベーター中でインキュベートされた100μlの時間。その後、ポリ-Oが削除され、各ウェルを無菌PBSで3回洗浄し、（PBSで10分間ものたびに残るましょう）。 24ウェルプレートが使用されている場合、ポリ-L-オルニチンワーキングソリューション/ウェル500μlのを使用しています。

14. その後、細胞を冷4％パラホルムアルデヒドを使用してソートした後、異なる時点で固定されており、異なった細胞集団からソートされた細胞の表現型を評価するために適切な神経細胞とグリア細胞のマーカーに対して免疫染色されています。

6。代表的な結果

神経芽細胞アッセイ（NBA）の分化培養では、メッキの細胞は組織培養基板に接続し、単層として成長します。初期の細胞播種密度に応じて、文化は3-4日後に90から95パーセントコンフルエント文化に変わります。この段階では、主に星状細胞の単層は上部^4,5（ 図1）上に小さな丸い神経前駆細胞で可視化の下にすることができます。成長因子を含まない培地に培地を切り替えた後、神経前駆細胞が開始急速に分裂すると4-5日で星状膠細胞単層（ 図2）の上に未熟な神経芽細胞のクラスターを生成します。セルのサイズ（FSC）と内部の粒度（SSC）（ 図3）に基づいて、FSC ^の低い SSC ^低 FSC ^高い SSC ^高 ;分化段階の4-5日の解離NBA文化のフローサイトメトリー分析は、2つの主要な細胞集団を示しています。 FSC ^高い SSC ^高い人口からソートされた細胞はほとんどありながら、選別された細胞の免疫蛍光分析では、神経細胞は主にFSC ^の低い SSC ^低い集団（そのうちの75％以上がβ-IIIチューブリンを発現する）に位置していることを示してい免疫反応性アストロサイト（ 図4）GFAP。までほぼ均一（97％）に未熟な神経細胞のさらなる精製は、FSC ^の低い SSC ^低い人口（ 図からPSA-NCAM IR細胞のポジティブセレクションを達成することができる。3、4）。 E14マウス神経節隆起から分離されたNSCのから生成された豊かな神経細胞はGABA作動性表現型と分化（ 図5）に応じて明示的なDARPP-32、中型有棘ニューロンのマーカーを取得します。

増殖ステージの4日目E14マウス神経幹細胞からの図1神経芽細胞アッセイ文化。この単層培養では、上に神経前駆細胞（矢印）の下に、丸い平らな星状細胞（矢頭）で構成されています。オリジナルの倍率、20×。

）位相コントラスト、B）免疫蛍光染色。分化段階の4日目E14マウス神経幹細胞から図2神経芽細胞アッセイ文化。未熟な神経細胞のクラスターに注意してください（の矢印を（Bで、GFAP染色の矢頭）の上にBの>とβIIIチューブリン染色）。オリジナルの倍率、20×。

図3代表的なソートのプロット：）。ダブレットと死細胞を除外する前にFSC対SSCのソートプロットA、B、C）。 FSCとSSCのパルス幅に基づいて、ダブレットの除外のソートをプロットします。D）。ヨウ化プロピジウムの免疫反応に基づいて、死んだと損傷した細胞の排除。E）。 FSC対SSC FSC ^低い SSC ^低 FSC ^高い SSC ^の高い集団としてラベルが付いた2つの主要な集団を示すダブレットと死細胞を除外した後、プロット、F、G）。 FSC ^の低い SSC ^低い集団からPSA-NCAM IR未熟な細胞を単離するためにプロットを並べ替えることができます。

図4異なる集団めっき後の1日から選別された細胞からの代表的な顕微鏡写真）。FSC ^低い SSC ^低い人口（これらの細胞の75％以上が神経細胞である）。B）FSC ^高い SSC ^高い人口（これらの細胞の大部分はアストロサイトです。 ）FSC ^低い SSC ^低人口から。C）PSA-NCAM ⁺細胞をソート（ほぼすべてのソートされた細胞のニューロンがある）。オリジナルの倍率、20×。

図5。ソート未熟なニューロンはGABA作動性ニューロン（）と急行DARPP-32（B）、中型有棘ニューロンのマーカーへと分化する。

定義されている神経細胞集団を分離する能力（すなわち、ニューロン、アストロサイトとオリゴデンドロサイト）は、神経幹細胞の臨床応用（NSCの）に関連付けられている障害のいくつかを解決するかもしれません。まず最初に、それは完全にドナー細胞の出発人口を特徴付けるために私達が可能になります。第二に、私たちは病気の性質や段階に応じて、特定の比率で特定の細胞型または異なる細胞型の組み合わせを使用することができます。最後に、高濃縮前の分化神経細胞の前駆細胞を使用すると、飛躍的に制御されていない可能性の増殖と善意のNSC ^6を含む異種の神経前駆細胞の使用に関連した腫瘍形成を減少させることができます。一般的に神経幹細胞の分化は5〜10％の神経細胞と80％以上がアストロサイトになります。分化のNBAメソッドを使用して、神経細胞の割合は20から30パーセントまで増加しますが、まだアストロサイトの多くと他の幹とpがありますいずれかのin vitroで 、純粋な神経細胞を研究するために、または神経疾患の動物モデルでそれらの治療効果を勉強するつもりならば望ましくないかもしれない文化の中でrogenitor細胞。このプロトコルでは、我々は⁵未熟な神経細胞を精製するためにNSCの子孫を差別化の物理的および蛍光特性に本質的な違いを利用した。私たちのフローサイトメトリーの精製方法は、検出可能なアストロサイトと非分化した善意の神経幹細胞や前駆細胞を持たない20から30パーセント百分の75から97への神経細胞の割合を増加させる。

ヒトNSCにこの方法論の適用は、神経疾患における神経細胞補充療法を受けるかもしれません。また、このアプローチは非常にそのような薬剤のスクリーニング、神経毒性、発生毒性試験と電気生理学などの神経前駆細胞の精製が必要でin vitroでの研究に有用である可能性があります。

一貫してGEにできるようにするには、E14マウス神経節隆起から生成されたNSCのより高品質の未熟な神経細胞をnerate、私たちはお勧めします。

1. 球が大きすぎる成長させないように。大規模な神経は、より細胞死の少ない神経の能力に関連付けられています。
2. 以上の2〜3分間球をトリプシン処理することはありません。以上の3分間トリプシンのままにしておくと、細胞の損傷を引き起こし、それらの神経効率が低下します。
3. 増殖組織化単分子膜が過コンフルエントになるせない。これは彼らの正常な分化過程を妨げることがあります。文化が約90％コンフルエントに達したときは、常にメディアを切り替えます。
4. 文化のソート前日に培地交換を得ることができる。この馴化培地は、並べ替えの日に収集し、めっきセルに使用することができます。この培地は、ソート未熟な神経細胞が生き残るためには、より成熟した表現型を獲得するのに役立ちます星状細胞から正体不明の可溶性因子の多くを含んでいます。
5. このTの欠点としてechnology、フローサイトメトリーマシンがソートし、また、真菌または細菌汚染に細胞死を細胞に損傷を与え、発生する可能性がありせん断力を含むいくつかのリスクに関連付けることができても細胞懸濁液を渡します。力をせん断による損傷を避けるために、我々は適切な速度で細胞をソートし、ソートトリガ·レートは、2500イベント/秒を超えないように右側のシース液（PBSをお勧めします）と適切なサイズのノズル（90-100μm）を使用することをお勧めします。汚染を避けるために、楽器はソートする前に、消毒剤の試薬を用いて適切に洗浄されていることを確認し、またあなたの収集培地中の抗生物質を使用しています。