Den neuroblast Assay: Et assay for generering og berigelse af neuronale progenitorceller fra Differentiering neural stamcelle Afkom anvendelse af flowcytometri

1. Grundlæggende oprettes inden den går videre til Cell Culture

1. NeuroCult NSC Basal Medium og NeuroCult NSC Proliferationsrespons Supplementer er blandet i et 9:1 forhold henholdsvis at komplet NSC medium.
2. En 37 ° C vandbad anvendes til at opvarme mediet.
3. Passende mængde af varme-inaktiveret føtalt kalveserum (FCS) optøs.
4. Passende mængde lager vækstfaktor opløsninger, herunder epidermal vækstfaktor (EGF ved 10 ug / ml), basisk fibroblast vækstfaktor (b-FGF ved 10 ug / ml) og 0,2% heparin-opløsning i phosphatbufret saltvand (PBS) optøs.
5. Vævskulturkolber (T25, T75 eller & T175) er nødvendige for NSC ekspansion og differentiering.
6. Vævskultur behandlede 96 og 24 brønds plader og dækglas er behov for udpladning sorterede celler.

2. Isolation, og Expansion (Passage) af NSC

1. Neural stam-og progenitorceller isoleres og ekspanderes fra mus bregn, som beskrevet i særskilte protokoller ^{1, 2 3.}
2. Når neurosfærer (enten primære eller passeret neurosfærer) er klar til subkultur (150-200 um i diameter), mediet indeholdende kugler overført til en passende størrelse sterilt vævskultur rør og centrifugeret ved 800 rpm (110 g) i 5 minutter ved stuetemperatur.
3. Supernatanten fjernes mediet, og kuglerne resuspenderes i 1 ml forvarmet 0,05% trypsin-EDTA.
4. Efter inkubering i et 37 ° C vandbad i 2-3 minutter, er et lige volumen af ​​sojabønnetrypsininhibitor tilsat til cellesuspensionen for at standse trypsinaktivitet.
5. At sikre, at trypsin er fuldstændigt inaktiveret, er cellesuspensionen forsigtigt pipetteret op og ned 3-5 gange.
6. Efter centrifugering ved 800 rpm (110 g) i 5 minutter, supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 1 ml komplet NSC medium.
7. 10 gi af cellesuspensionen blandes med 90 ul trypan blå at udføre en celletælling.
   Bemærk: Andre egnede celler fortyndinger kan også anvendes.
   
8. Cellerne anvendes derefter til subkultur ^{1, 2} eller differentiering som beskrevet nedenfor.

3. Differentiering af neurale stam-og progenitorceller, The neuroblast assay (NBA)

1. Celler som følge af dissocierede neurosfærer udplades i en koncentration på 2-3 x 10 ⁵ celler / ml i komplet NSC medium suppleret med 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1 pi / ml 0,2% heparin og 5% varmeinaktiveret FCS i en passende størrelse vævsdyrkningskolbe. 5 ml medium anvendes til T25, 20 ml for T75 og 40 ml til T175 kolber.
   Bemærk: FCS vil bevirke, at cellerne fast fastgøre til substratet, og der er intet behov for overtrækning af kolberne til NBA kultur.
   
2. CultUre kolber inkuberes derefter i et 37 ° C befugtet inkubator med _5% CO2 i 3-4 dage. Denne periode kaldes proliferation fase, hvorunder NSC afkom fastgøre til substratet og proliferere som et monolag af celler.
3. Når kulturen bliver 90-95% konfluente, mediet fra hver kolbe kobles til den fuldstændige NSC medium suppleret med 5% FCS uden vækstfaktorer.
4. Dyrkningskolber inkuberes igen i en 37 ° C befugtet inkubator med _5% CO2 i yderligere 3-4 dage. Denne periode kaldes differentiering fase, hvorunder neuronale progenitorceller vist på toppen af en astrocytisk monolag og prolifererer til at kolonier af umodne neuronale celler. På dag 4-5 differentiering fase, er kulturen klar til isolering af neuroblast celler under anvendelse af flowcytometri-teknologi.

4. Cell Forberedelse til Flowcytometri

Trypsinisering

1. Dyrkning af differentierende NSC afkom på dag 4-5 differentiering fase vaskes en gang med en passende mængde PBS (2 ml til T25, 4 ml for T75 og 8 ml af T175 kolbe) for at fjerne FCS fra kulturen.
   Bemærk: FCS blokke Trypsin-EDTA aktivitet.
   
2. Derefter bliver en tilstrækkelig mængde forvarmet 0,05% trypsin-EDTA (2 ml til T25, 4 ml for T75 og 8 ml af T175 kolbe) blev tilsat til hver kolbe til dækning af cellemonolaget og inkuberet i 1-2 minutter i en 37 ° C befugtet inkubator.
3. Kolben kontrolleres under mikroskop for at evaluere virkningen af ​​trypsin-EDTA på kulturen. Kolben holdes derefter med den ene hånd og slog fast med den anden hånd for at løsne cellerne fra bunden af ​​kolben.
4. Lige volumen af ​​sojabønnetrypsin-inhibitor sættes til kolben for at standse trypsinaktivitet. Cellesuspensionen forsigtigt pipetteret op og ned for at sikre trypsin inaktivering og for at opnå en homogen enkelt cellesuspension.
   Bemærk: Alternativt kan mediet suppleret med 5% FCS anvendes til at standse trypsinaktivitet.
   
5. At fjerne ikke-dissocierede klumper er cellesuspensionen passeret gennem en 40 um-størrelse mesh filter.
6. Cellesuspensionen centrifugeres derefter ved 800 rpm (110g) i 5 minutter, supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i en passende volumen af ​​komplet NSC medium.
7. Det endelige volumen af cellesuspensionen justeres således, at celledensiteten ikke overstiger 2-3x10 ⁶ -cells/ml. Høj celledensitet kan forårsage strøm blokering i flowcytometri maskinen.
8. Hvis du ønsker at isolere nerveceller kun baseret på deres fysiske egenskaber, du nu kan gå videre til FACS-sortering som beskrevet i del 4.
9. Før sortering er propidiumiodid (PI, Sigma, 500 ug / ml i PBS) tilsat i en koncentration på 1 ul / ml cellesuspension for at udelukke døde celler.

Live-CELl immunolabeling

At opnå en højere renhed af neuronale celler, høstet enkelt celle fra NBA kulturen kan farves for PSA-NCAM (en markør for tidlig umodne neuronale progenitorceller), og derefter de positive celler fra neuronale population kan isoleres ved hjælp af FACS-maskine.

1. Efter udførelse af en celletælling, er enkelt cellesuspension fra NBA kulturen inddelt i fire grupper:
   • Celler alene gruppe, tjener som en kontrol for at justere parametre og porte (0,5-1 x 10 ⁶ celler).
   • Celler plus PI, fungerer som en kontrol til at justere parametre og porte (0,5-10 x 10 ⁶ celler). PI negative celler fra denne gruppe kan også være sorteres baseret på de celler fysiske egenskaber.
   • Sekundær alene (isotype kontrol) gruppen, der også tjener som en kontrol for at justere parametre og porte (1-2 x 10 ⁶ celler).
   • Immunolabeling gruppe (8-10 x 10 ⁶ celler), der er farvet for PSA-NCAM at opnåYderligere oprensning af umodne neuronale celler. For at udelukke døde celler ved sortering, er PI føjes til denne gruppe så godt.
2. At starte immunolabeling, celler centrifugeres ved 800 rpm (110 g) i 5 minutter. Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 100 pi af komplet NSC medium.
3. Phycoerythrin (PE)-konjugeret anti-PSA-NCAM antistof tilsættes i et forhold på 10 gl / 5 til 10 x 10 ⁶ celler til cellesuspensionen, der skal farves for PSA-NCAM. På samme måde er en PE-konjugeret mus IgG1-isotype kontrol-antistof tilsat til isotypekontrol cellesuspension. Følge instruktionerne på antistoffet specifikationen om koncentrationen af ​​antistoffet, der skal anvendes. Cellesuspensionen blandes derpå forsigtigt og inkuberet ved stuetemperatur i 10-15 minutter i mørke.
4. De cellesuspensioner (PSA-NCAM og isotype kontrol-rør) og derefter centrifugeret ved 800 rpm (110 g) i 5 minutter, supernatanten fjernet, og cellerne er re-suspended i 1 ml komplet NSC medium.
5. At fjerne overskydende ikke-afgrænsede antistoffer fra prøverne, trin 4 gentages 2-3 gange.
6. Efter re-suspension af celler i et passende volumen af ​​medium, propidiumiodid (PI, Sigma, 500 ug / ml i PBS) tilsættes i en koncentration på 1 ul / ml af cellesuspensioner (celler plus PI, isotype kontrol-og PSA- NCAM-farvede prøver) for at udelukke døde celler, når det analyseres ved flowcytometri.
7. 15 ml sterile Falcon-rør indeholdende 1 ml komplet medium er parat til at opsamle sorterede celler fra forskellige cellepopulationer.

5. Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) af umodne neuroner

1. Den FACS maskine er sat op baseret på dets brugermanual instruktion via flowcytometri anlægget ekspert tekniker.
2. Phosphatbufret saltvand (PBS) eller en anden passende opløsning depending af producentens anvisninger, kan anvendes som kappevæsken ved 28 psi gennem en 90 um dyse.
3. Differenstryk på systemet justeres således, at den form aftrækkeren hastighed ikke overskrider 2500 hændelser / sekund.
4. Cellesuspensionen fra cellerne alene gruppe køres gennem FACS-maskine.
5. Først cellerne (events) plottet er baseret på deres størrelse (Forward Scatter (FSC) lys) versus indre kompleksitet (Side Scatter (SSC), lys) at skelne mellem forskellige cellepopulationer. At gøre dette, bør spændingen parametre for FSC og SSC justeres således, at cellerne kan ses i flowcytometri plot.
6. At udelukke celleklumper og dobbeltdubletter, er cellerne først afbildet baseret på fremadrettet lysspredning område (FSC-A) i forhold til fremadrettet lysspredning impulsbredde (FSC-W) og en enkelt cellepopulation er gated som population 1 (P1). Derefter P1 cellerne afbildes baseret på sidespredning område (SSC-A) kontra sidespredning impulsbredde (FSC-W) og denne gang de enkelte celler GATED som population 2 (P2). Efter at have etableret disse to på hinanden følgende porte, klumper eller dubletter (høj FSC puls bredde og høj SSC impulsbredde) bliver udelukket.
7. At udelukke døde eller beskadigede celler, er de enkelte celler (P2) afbildet baseret på PI reaktivitet mod FSC-A og det indre levende cellepopulation er gated.
8. Enkelte levende celler er plottet baseret på FSC versus SSC at skelne mellem forskellige cellepopulationer baseret på cellestørrelse og intern nøjagtighed. På dette stadium to cellepopulationer er gated som FSC ^lav SSC ^lav (P3) og FSC ^høj SSC ^høj (P4) cellepopulationer.
9. For at sortere PSA-NCAM immuno-reaktive umodne nerveceller fra FSC ^lave SSC ^{lav befolkningstæthed,} første FSC ^lave SSC ^{lav befolkningstæthed} fra kontrol (celler plus PI og isotypekontrol) grupper plottes baseret på PE immunreaktivitet versus FSC-A, og den negative Cellerne er gated (P5), og derefter positive celler fra PSA-NCAMbejdset gruppe er gated som befolkningen 6 (P6).
10. Efter justering alle de nødvendige porte, der er celler interesser sorteret i 15 ml sterile vævskultursystemer rør, der indeholder 1 ml NSC medium.
11. Sorterede celler centrifugeres derefter ved 1200 rpm (240 g) i 5 minutter.
12. Supernatanten bortkastes, og pelleten resuspenderes i et passende volumen af ​​medium (afhængigt af pellet størrelse) og en celletælling udføres.
13. Cellerne udplades derefter i poly-L-ornithin belagte 96-brønds plader ved en densitet på 20-30 x 10 ³ celler / brønd i 200 til 250 pi af komplet NSC-medium med 5% FCS og 20 ng / ml human rekombinant BMP4 ⁵ .

Bemærk: at coate 96 brønde, 100 ul af poly-L-ornithin arbejdsopløsning (1,5 ml poly-O og 8,5 ml sterilt PBS) tilsættes til hver brønd og pladen inkuberes i et 37 ° C inkubator i mindst ét time. Derefter Poly-O fjernet, og hver brønd vasket tre gange med sterilt PBS(Lade PBS forbliver i brønden i 10 min hver gang). Anvendelse 500 pi af poly-L-ornithin brugsopløsning / brønd hvis plader med 24 brønde anvendes.

14. Celler fikseres derefter på forskellige tidspunkter efter sortering med kold 4% paraformaldehyd og immunfarvet for passende neuronale og gliale cellemarkører at vurdere fænotypen af ​​sorterede celler fra forskellige cellepopulationer.

6. Repræsentative resultater

I neuroblast assay (NBA) differentiering kultur, vedhæfte udpladede celler til vævskultur substratet og vokse som et monolag. Afhængigt oprindelige celle udpladningsdensitet vil kulturen blive omdannet til en 90-95% konfluent kultur efter 3-4 dage. På dette stadium kan et monolag af hovedsagelig astrocytiske celler visualiseres under med små runde neuronale progenitorceller oven ^4,5 (fig. 1). Efter omskiftning af medium til en vækstfaktor medium, begynder neuronale progenitorcellerdividere hurtigt og generere klynger af umodne neuroblast celler på toppen af astrocytisk monolag i 4-5 dage (figur 2). Flowcytometrianalyse af dissocieret NBA kulturen på dag 4-5 differentiering fase viser to cellepopulationer, FSC ^lav SSC ^lave og FSC ^høj SSC ^høj baseret på cellestørrelse (FSC) og intern granulering (SSC) (figur 3). Immuno-fluorescerende analyse af de sorterede celler, viser, at de neuronale celler fortrinsvis findes i de FSC ^lave SSC ^ringe bestande (med mere end 75% af dem udtrykker β-III tubulin), mens sorterede celler fra FSC ^høje SSC ^stor befolkning er for det meste GFAP immunoreaktive astrocytter (figur 4). Yderligere oprensning af umodne neuronale celler op til næsten homogenitet (97%) kan opnås med positiv selektion af PSA-NCAM IR-celler fra FSC ^lave SSC ^lav population (figur3, 4). Berigede neuronale celler frembragt fra NSC isoleret fra E14 muse ganglioniske Eminencer opnå en GABAerge fænotype og udtrykker DARPP-32, en markør for medium piggede neuroner efter differentiering (figur 5).

Figur 1. Neuroblast assay kultur fra E14 mus neurale stamceller på dag 4 af proliferation fase. Dette monolagskultur består af flade astrocytiske celler (pilespidser) nedenunder og runde neuronale stamceller (pile) på toppen. Oprindelig forstørrelse; 20 x.

. Figur 2 neuroblast assay kultur fra E14 mus neurale stamceller på dag 4 af differentiering trin: A) fasekontrast, B) immunfluorescensfarvning. Bemærk klynge af umodne neuronale celler (pile A B) på toppen af astrocytisk monolaget (pilespidser i A, GFAP-farvning i B). Oprindelig forstørrelse; 20 x.

Figur 3 Repræsentative sortere plots: A). FSC versus SSC slags afbildning før udelukkelse af dubletter og døde celler. B, C). Sorter grunde til udelukkelse af dubletter baseret på FSC og SSC pulsbredde. D). Udelukkelse af døde og beskadigede celler baseret på propidiumiodid immunreaktivitet. E). FSC versus SSC afbildning efter udelukkelse af dubletter og døde celler, som viser de to populationer er mærket som FSC ^lav SSC ^lav og FSC ^høje SSC ^store populationer. F, G). Sorter plot at isolere PSA-NCAM IR umodne celler fra FSC ^lave SSC ^{lav befolkningstæthed.}

Figur 4. Repræsentative mikrografer fra celler sorteret fra forskellige befolkningsgrupper en dag efter galvanisering. A) FSC ^lav SSC ^lav befolkning (mere end 75% af disse celler er neuroner). B) FSC ^høj SSC ^stor befolkning (de fleste af disse celler er astrocytter ). C) PSA-NCAM ⁺ sorterede celler fra FSC ^lav SSC ^{lav befolkningstæthed} (næsten alle af de sorterede celler er neuroner). Oprindelig forstørrelse; 20 x.

Figur 5. Sorteret umodne neuroner differentiere sig til GABA-erge neuroner (A) og udtrykker DARPP-32 (B), en markør for medium tornede neuroner.

Evnen til at isolere defineret neurale cellepopulationer (dvs. neuroner, astrocytter og oligodendrocytter) kan løse nogle af de hindringer, der er forbundet med den kliniske anvendelse af neurale stamceller (NSC). For det første sætter os i stand til fuldt ud at karakterisere start befolkning donorceller. For det andet tillader os at anvende en bestemt celletype eller en kombination af forskellige celletyper med et specifikt forhold, afhængig af beskaffenheden eller stadiet af sygdommen. Endelig kan ved hjælp af højt beriget pre-opdelte neurale-stamceller dramatisk fald muligt ukontrolleret spredning og tumordannelse forbundet med at bruge heterogene neurale forstadier indeholder bona fide NSC ^6. Generelt differentiering af neurale stamceller resulterer i 5-10% neuronale celler og mere end 80% astrocytter. Brug af NBA metode til differentiering, vil procentdelen af ​​nerveceller øges op til 20-30%, men der er stadig masser af astrocytter og andre stamceller og progenitor celler i kultur, som måske ikke er ønskeligt, hvis man vil studere rene neuronale celler in vitro eller til at undersøge deres terapeutiske virkning i dyremodeller af neurologiske sygdomme. I denne protokol, tog vi fordel af iboende forskelle i de fysiske og fluorescerende egenskaber at differentiere NSC afkom til at rense umodne nerveceller ^5. Vores flowcytometri oprensningsmetodik forøger procentdelen af ​​neuronale celler fra 20-30% til 75-97% uden nogen påviselig astrocytter og un-differentierede bona fide neurale stamceller og progenitorceller.

Anvendelsen af ​​denne metode til menneskelige NSC kan have gavn neuronal celle substitutionsterapi i neurologisk sygdom. Denne metode kan også være nyttige til in vitro-undersøgelser, der skal højrenset neuronale progenitorceller, såsom lægemiddel-screening, neurotoxicology, udviklingsmæssige undersøgelser og elektrofysiologi.

At være i stand til konsekvent generate høj kvalitet umodne neuroner fra NSC genereret fra E14 mus ganglionære Eminencer, anbefaler vi:

1. Ikke at lade kuglerne bliver for stor. Store neurosfærer er associeret med celledød og mindre neurogene evner.
2. Ikke at Trypsinisér kuglerne i mere end 2-3 minutter. Forlader trypsin i mere end 3 minutter forårsager skade på celler og mindsker deres neurogen effektivitet.
3. Ikke at lade prolifererende enkeltlags bliver over-sammenflydende. Dette kan påvirke deres normale differentiering proces. Altid, skifte mediet, når kulturen når omkring 90% sammenflydning.
4. For at give kulturen et medium ændring på dagen før slags. Dette konditionerede medium kan opsamles på dag slags og anvendt til udpladning af celler. Dette medie indeholder en masse uidentificerede opløselige faktorer fra de astrocytiske celler, der vil hjælpe de sorterede umodne neuronale celler til at overleve og få en mere moden fænotype.
5. Som ulemper ved denne technology, der passerer cellesuspensionen om flowcytometri maskine kan være forbundet med nogle risici, herunder forskydningskraften, der kan beskadige cellerne og forårsager celledød ved sortere og også svampe eller bakteriel forurening. For at undgå beskadigelse af forskydningskraft, anbefales sortering cellen ved en passende hastighed, og ved hjælp af højre kappevæske (PBS anbefales) og rigtige størrelse dyser (90-100 um) til ikke at lade den slags aftrækkeren hastighed end 2500 hændelser / sekund. For at undgå forurening, så sørg for instrumentet er blevet rengjort ordentligt med desinficerende reagenser før sortere og også bruge antibiotika i din indsamle medium.