Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

1. Basic Set Up Bevor mit Cell Culture

1. NeuroCult NSC Basal Medium und NeuroCult NSC Proliferation Zuschläge sind in einem Verhältnis 9:1 gemischt, jeweils um komplette NSC Medium zu machen.
2. A 37 ° C warmes Wasserbad verwendet wird zum Aufwärmen des Mediums.
3. Geeignete Menge von Wärme inaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) aufgetaut.
4. Geeignete Menge über diesen Wachstumsfaktor Lösungen, einschließlich epidermalen Wachstumsfaktor (EGF bei 10 ug / ml), basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (b-FGF bei 10 ug / ml) und 0,2% Heparin-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aufgetaut.
5. Zellkulturflaschen (T25, T75 oder T175 &) werden für NSC Expansion und Differenzierung notwendig.
6. Gewebekultur behandelt 96 und 24 Well-Platten und Deckgläser werden für die Beschichtung von sortierten Zellen benötigt werden.

2. Isolation und Expansion (Die Passage) von NSCs

1. Neuralen Stamm-und Vorläuferzellen werden isoliert und von der Maus b erweitertRegen wie in separaten Protokollen Nr. ^{1, 2 3} beschrieben.
2. Wenn die Neurosphären (primär oder passagierten Neurosphären) bereit für Subkultur (150-200 &mgr; m im Durchmesser) sind, ist das Medium, Sphären auf eine geeignete Größe sterile Gewebekultur-Röhrchen überführt und zentrifugiert bei 800 rpm (110 g) für 5 min bei Raumtemperatur.
3. Der Überstand Medium wird entfernt und die Kugeln in 1 ml der vorgewärmten 0,05% Trypsin-EDTA resuspendiert.
4. Nach der Inkubation bei 37 ° C Wasserbad für 2-3 min, wird ein gleiches Volumen an Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor zu der Zellsuspension zugegeben, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen.
5. Um sicherzustellen, dass die Trypsin wurde vollständig inaktiviert wird die Zellsuspension auf und ab pipettiert 3-5 mal.
6. Nach Zentrifugation bei 800 Upm (110 g) für 5 min wird der Überstand entfernt und die Zellen werden in 1 ml vollständigem NSC resuspendiert.
7. 10 &mgr; l der Zellsuspension mit 90 ul trypa gemischtn blue zur Durchführung einer Zellzahl.
   Hinweis: Andere geeignete Zelle Verdünnungen können ebenfalls verwendet werden.
   
8. Die Zellen werden dann für die Subkultur ^{1, 2} oder zur Differenzierung wie unten beschrieben verwendet.

3. Differenzierung neuraler Stamm-und Progenitorzellen, die Neuroblast Assay (NBA)

1. Zellen, die aus dissoziierten Neurospheres werden in einer Konzentration von 2-3 × 10 ⁵ Zellen / ml in der gesamten NSC-Medium mit 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1 l / ml von 0,2% und 5% Heparin ausplattiert Hitze inaktiviertes FCS in einer angemessenen Größe Zellkulturflasche. 5 ml Medium für T25, T75 für 20 ml und 40 ml für T175-Flaschen verwendet.
   Hinweis: FCS daß die Zellen fest mit dem Substrat zu befestigen und es gibt keine Notwendigkeit für die Beschichtung der Kolben für NBA Kultur.
   
2. KultAbbildung Kolben werden dann in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO ₂ für 3-4 Tage inkubiert. Dieser Zeitraum wird als Proliferation Phase werden NSC Nachkommen an dem Substrat und proliferieren als eine Monoschicht von Zellen.
3. Wenn die Kultur Konfluenz 90-95%, die mittlere jeder Flasche wird auf der gesamten NSC-Medium mit 5% FCS ohne Wachstumsfaktoren ergänzt eingeschaltet.
4. Kulturflaschen werden erneut in einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO ₂ für weitere 3-4 Tage inkubiert. Dieser Zeitraum wird der Grad der Differenzierung genannt, während der neuronalen Vorläuferzellen erscheinen oben auf einem astrozytären Monoschicht und sich vermehren, um Kolonien von unreifen Nervenzellen machen. Am Tag 4-5 der Differenzierung der Bühne, ist die Kultur bereit für die Isolierung der Neuroblast Zellen mittels Durchflusszytometrie-Technologie.

4. Zellpräparation für die Durchflusszytometrie

Trypsinisierung

1. Die Kultur der Differenzierung NSC Nachkommen am Tag 4-5 der Zelldifferenzierung wird einmal mit einer geeigneten Menge an PBS (2 ml für T25, T75 4 ml für und 8 ml für T175-Kolben) mit FCS aus der Kultur entfernt gewaschen.
   Hinweis: FCS Blöcke Trypsin-EDTA-Aktivität.
   
2. Dann wird eine ausreichende Menge an vorgewärmten 0,05% Trypsin-EDTA (2 ml für T25, T75 4 ml für und 8 ml für T175-Kolben) in jeden Kolben zugegeben, um die Zellmonoschicht bedecken und inkubiert für 1-2 min in 37 ° C befeuchteten Inkubator.
3. Der Kolben wird unter dem Mikroskop, um die Wirkung von Trypsin-EDTA auf die Kultur zu bewerten überprüft. Der Kolben wird dann mit einer Hand gehalten und schlug fest mit der anderen Hand, um die Zellen vom Boden der Flasche zu entfernen.
4. Gleiche Volumen von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor wird in den Kolben zu Trypsin-Aktivität zu löschen zugegeben. Die Zellsuspension wird sanft nach oben und nach unten zu Trypsin pipettiert Inaktivierung zu gewährleisten und um eine homogene einzelne Zelle erreichenSuspension.
   Hinweis: Alternativ-Medium mit 5% FCS verwendet werden, um Trypsinaktivität stillen werden.
   
5. Um nicht getrennten Klumpen zu entfernen, wird die Zellsuspension durch ein 40-Mesh-Größe um-Filter geleitet.
6. Die Zellsuspension wird dann bei 800 rpm (110g) für 5 min zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Zellen werden in einem geeigneten Volumen an vollständigem NSC resuspendiert.
7. Das Endvolumen der Zellsuspension wird so eingestellt, dass die Zelldichte nicht mehr als 2-3x10 ⁶ -cells/ml. Hoher Zelldichte könnte Strom Blockade in der Durchflusszytometrie Maschine verursachen.
8. Wenn Sie möchten, neuronalen Zellen nur auf ihre physikalischen Eigenschaften zu isolieren, jetzt können Sie auf FACS-Sortierung wie in Teil 4 beschrieben fortfahren.
9. Vor dem Sortieren wird Propidiumiodid (PI, Sigma, 500 ug / ml in PBS) in einer Konzentration von 1 ul / ml Zellsuspension, um tote Zellen auszuschließen aufgenommen.

Live-cell Immunomarkierung

Um eine höhere Reinheit des neuronalen Zellen, geerntet einzelnen Zelle aus der NBA Kultur kann für PSA-NCAM (ein Marker der frühen unreifen neuronalen Vorläuferzellen) und dann die positiven Zellen aus der neuronalen Population angefärbt werden erreichen können isoliert mit der FACS-Maschine werden.

1. Nach Durchführung einer Zellzählung, wird die einzige Zellsuspension aus der NBA-Kultur in vier Gruppen unterteilt:
   • Zellen allein Gruppe dient als Kontrolle, um Parameter und Tore (0,5 bis 1 x 10 ⁶ Zellen) einzustellen.
   • Zellen plus PI, dient als Kontrolle, um Parameter und Tore (0,5 bis 10 x 10 ⁶ Zellen) einzustellen. PI-negativen Zellen aus dieser Gruppe können auch bezogen auf die Zellen physikalischen Eigenschaften sortiert werden.
   • Sekundäre allein (Isotyp-Kontrolle), die Gruppe dient auch als Kontrolle, um Parameter und Tore (1-2 x 10 ⁶ Zellen) einzustellen.
   • Immunmarkierung Gruppe (8-10 x 10 ⁶ Zellen), die für PSA-NCAM gefärbt ist, um zu erreichenweitere Reinigung der unreifen neuronalen Zellen. Um tote Zellen auf Sortierung auszuschließen, wird PI zu dieser Gruppe hinzugefügt als auch.
2. Um Immunmarkierung zu starten, werden die Zellen bei 800 Upm (110 g) für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Zellen werden in 100 ul vollständige NSC resuspendiert.
3. Phycoerythrin (PE) konjugiertem Anti-PSA-NCAM Antikörper in einem Verhältnis von 10 ul / 5-10 × 10 ⁶ Zellen der Zellsuspension für PSA-NCAM gefärbt werden zugegeben. In gleicher Weise wird eine PE-konjugiertem Maus-IgG1-Isotyp-Kontroll-Antikörper der Isotyp-Kontrolle Zellsuspension zugegeben. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Antikörper Datenblatt über die Konzentration der Antikörper verwendet werden. Die Zellsuspension wird dann vorsichtig gemischt und bei Raumtemperatur inkubiert für 10-15 min im Dunkeln.
4. Die Zellsuspensionen (PSA-NCAM und Isotyp Kontrollröhrchen) werden dann bei 800 Upm (110 g) für 5 min zentrifugiert, der Überstand entfernt und die Zellen werden wieder & Fahrwerknded in 1 ml vollständigem Medium NSC.
5. Um überschüssige un-beschränkt Antikörper, die aus den Proben zu entfernen, wird der Schritt April 2-3 mal wiederholt.
6. Nach der erneuten Suspendieren der Zellen in einem geeigneten Volumen an Medium, Propidiumiodid (PI, Sigma, 500 ug / ml in PBS) bei einer Konzentration von 1 l / ml der Zellsuspension (Zellen plus PI, Isotyp-Kontrolle und das hinzugefügt PSA- NCAM-gefärbten Proben), um auszuschließen, wenn tote Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert.
7. 15 ml-Falcon-Röhrchen sterilen mit 1 ml vollständigem Medium bereit sind, sortierten Zellen aus verschiedenen Zellpopulationen zu sammeln.

5. Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) von unreifen Neuronen

1. Die FACS-Maschine wird auf der Grundlage seiner Anleitung Handbuch über die Durchflusszytometrie Anlage-Experte Techniker eingestellt.
2. Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) oder andere geeignete Lösungen depending auf die Anweisungen des Herstellers, könnte als Hüllfluid bei 28 PSI durch eine 90 um Düse verwendet werden.
3. Differenzdruck auf dem System ist so eingestellt, dass die Art Trigger nicht übersteigt 2500 Ereignisse / Sekunde.
4. Die Zellsuspension aus den Zellen allein Gruppe wird durch die FACS-Maschine laufen.
5. Zunächst werden die Zellen (Ereignisse) auf der Basis ihrer Größe (Forward Scatter (FSC) Licht) versus interne Komplexität (Side Scatter (SSC)-Licht) zu unterschiedlichen Zellpopulationen unterscheiden aufgetragen. Um dies zu tun, sollte die Spannung Parameter für FSC und SSC so eingestellt, dass die Zellen in der Durchflusszytometrie Diagramm kann gesehen werden.
6. Um Zellklumpen und Dubletten auszuschließen, werden die Zellen zunächst aufgetragen basierend auf Vorwärtsstreuung Bereich (FSC-A) gegenüber Vorwärtsstreuung Impulsbreite (FSC-W) und die Single-Zell-Population ist als gated Bevölkerung 1 (P1). Dann werden die P1-Zellen basieren auf Seite Streubereich (SSC-A) versus Seitwärtsstreuung Impulsbreite (FSC-W) und dieser Zeit werden die einzelnen Zellen sind gat aufgetragened Bevölkerung als 2 (P2). Nachdem festgestellt wurde, diese zwei aufeinanderfolgenden Toren, Klumpen oder Dubletts (FSC hohe Pulsbreite und hohe SSC Impulsbreite) werden ausgeschlossen.
7. Um tote oder beschädigte Zellen auszuschließen, werden die einzelnen Zellen (P2), basierend auf PI Reaktivität gegenüber FSC-A und dem einzigen Live-Zell-Population ist gated aufgetragen.
8. Einzel lebenden Zellen basieren auf FSC gegen SSC aufgetragen zu unterschiedlichen Zellpopulationen auf Zellgröße und Granularität der Basis interner unterscheiden. In diesem Stadium zwei Zellpopulationen torgesteuert FSC ^niedrigen SSC ^niedrig (P3) und FSC ^hohen SSC ^hoch (P4) Zellpopulationen.
9. So sortieren PSA-NCAM immunreaktiven unreifer neuronaler Zellen aus dem FSC ^niedrigen SSC ^{geringe Bevölkerungsdichte,} die erste FSC ^niedrigen SSC ^{geringe Bevölkerungsdichte} von Kontrolle (Zellen plus PI und Isotyp-Kontroll-) Gruppen wird auf Basis PE-Immunreaktivität gegen FSC-A aufgetragen und die negative Zellen sind gated (P5), und dann positiven Zellen von PSA-NCAMgebeizt Gruppe sind als gated Bevölkerung 6 (P6).
10. Nach der Einstellung alle benötigten Tore, werden die Zellen von Interessen in 15 ml sterile Zellkultur-Röhrchen mit 1 ml Medium NSC sortiert.
11. Die sortierten Zellen werden dann bei 1200 rpm (240 g) für 5 Minuten zentrifugiert.
12. Der Überstand wird verworfen und das Pellet wird in einem geeigneten Volumen des Mediums (in Abhängigkeit von der Pelletgröße) und einer Zellzahl resuspendiert durchgeführt wird.
13. Die Zellen werden dann in Poly-L-Ornithin beschichteten 96-Well-Platten bei einer Dichte von 20-30 x 10 ³ Zellen / Vertiefung in 200-250 ul vollständige NSC-Medium ausplattiert mit 5% FCS und 20 ng / ml menschlichen rekombinanten BMP4 ⁵ .

Hinweis: die Beschichtung 96 Vertiefungen, 100 ul von Poly-L-Ornithin-Arbeitslösung (1,5 ml Poly-O und 8,5 ml steriler PBS) in jede Vertiefung gegeben und die Platte wird bei 37 ° C-Inkubator für mindestens eine inkubiert Stunde. Dann wird das Poly-O entfernt und jede Vertiefung dreimal mit sterilem PBS gewaschen(Lassen Sie die PBS in der gut bleiben für jeweils 10 Minuten Zeit). Verwenden Sie 500 ul von Poly-L-Ornithin Arbeitslösung / gut, wenn 24-Well-Platten verwendet werden.

14. Die Zellen werden dann zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Art mit kaltem 4% Paraformaldehyd fixiert und immungefärbt geeignete neuronale und gliale Zellmarker, um den Phänotyp der sortierten Zellen aus verschiedenen Zellpopulationen zu bewerten.

6. Repräsentative Ergebnisse

Im Neuroblast Assay (NBA) Differenzierung Kultur, plattierten Zellen der Gewebekultur Substrat zu befestigen und zu wachsen als einer Monoschicht. Je nach anfänglichen Zelle Beschichtungs-Dichte, wird die Kultur in eine 90-95% konfluenten Kultur nach 3-4 Tagen zu machen. Zu diesem Zeitpunkt kann eine Monoschicht von hauptsächlich Astrozyten visualisiert unten mit kleinen runden neuronalen Vorläuferzellen auf ^4,5 (Abbildung 1). Nach dem Einschalten des Mediums an einen Wachstumsfaktor Medium, startet neuronalen VorläuferzellenTeilung rasch und erzeugen Cluster von unreifen Zellen Neuroblast auf der Oberseite des astrozytären Monoschicht in 4-5 Tagen (Abbildung 2). Durchflusszytometrie dissoziierter NBA Kultur an Tag 4-5 der Differenzierung der Bühne, zeigt im Wesentlichen zwei Zellpopulationen; FSC ^niedrigen SSC ^niedrigen und ^hohen FSC-SSC ^hoch auf Zellgröße (FSC) und interne Granularität (SSC) (Abbildung 3). Immuno-Fluoreszenz-Analyse der sortierten Zellen zeigt, dass die neuronalen Zellen vor allem in der FSC-SSC ^{niedrigen niedrigen} Populationen (mit mehr als 75% von ihnen zum Ausdruck β-Tubulin-III) befindet, während sortierten Zellen aus dem FSC-SSC ^{hoch hoch} Bevölkerung sind meist GFAP immunreaktiv Astrozyten (Abbildung 4). Die weitere Reinigung von unreifen neuronalen Zellen bis zur Homogenität (97%) könnte eine positive Selektion von PSA-NCAM IR-Zellen aus dem FSC ^niedrigen SSC ^{dünn besiedelte} (Abbildung erreicht werden3, 4). Angereichert neuronalen Zellen aus den NSCs von E14 Maus ganglionären Eminenzen isoliert generiert erwerben einen GABAergen Phänotyp und Express DARPP-32, einem Marker der mittleren stachelige Neuronen, auf Differenzierung (Abbildung 5).

Abbildung 1. Neuroblast Assay Kultur von E14 Maus neurale Stammzellen an Tag 4 der Proliferation der Bühne. Diese Monoschichtkultur besteht aus flachen Zellen Astrozyten (Pfeilspitzen) und darunter rund neuronalen Vorläuferzellen (Pfeile) an der Spitze. Original-Vergrößerung; 20 x.

. Abbildung 2 Neuroblast Assay Kultur von E14 Maus neurale Stammzellen an Tag 4 der Differenzierung der Bühne: A) Phasenkontrast, B) Immunfluoreszenzfärbung. Beachten Sie die Ansammlung von unreifen neuronalen Zellen (Pfeile in A B) auf der Oberseite des astrozytären Monoschicht (Pfeilspitzen in A-, GFAP-Färbung in B). Original-Vergrößerung; 20 x.

. Abbildung 3 Vertreter Sortieren Plots: A). FSC vs SSC Art Plot vor Ausschluss von Dubletten und tote Zellen. B, C). Sortieren Grundstücke für den Ausschluss von Dubletten auf FSC-und SSC-Pulsbreite. D basiert). Ausschluss von toten und geschädigten Zellen auf Propidiumiodid Immunreaktivität basiert. E). FSC vs SSC Plot nach Ausschluss von Dubletten und tote Zellen, welche die beiden wichtigsten Bevölkerungsgruppen wie dem FSC-SSC ^{niedrigen niedrigen} und den ^hohen SSC FSC ^hohe Populationen bezeichnet. F, G). Sortieren Plots zu PSA-NCAM IR unreife Zellen aus dem FSC-SSC ^{niedrige niedrige} Bevölkerung zu isolieren.

Abbildung 4. Vertreter Aufnahmen von Zellen aus verschiedenen Populationen einen Tag nach Plattieren sortiert. A) FSC-SSC ^{niedrige niedrige} Bevölkerung (mehr als 75% dieser Zellen sind Neuronen). B) FSC ^hohe SSC ^hohen Bevölkerung (die meisten dieser Zellen sind Astrozyten ). C) PSA-NCAM ⁺ sortierten Zellen aus FSC ^niedrigen SSC ^{geringe Bevölkerungsdichte} (fast alle der sortierten Zellen sind Neuronen). Ursprüngliche Vergrößerung, 20 x.

Abbildung 5. Sortiert unreifen Neuronen differenzieren zu GABAergen Neuronen (A) und Express DARPP-32 (B), einem Marker für mittlere stachelige Neuronen.

Die Möglichkeit, definierte neuronale Zellpopulationen zu isolieren (dh Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten) lösen könnten einige der Hindernisse bei der klinischen Anwendung der neuralen Stammzellen (NSCs) verbunden sind. Erstens ermöglicht es uns für die vollständige Charakterisierung der Ausgangspopulation von Spenderzellen. Zweitens erlaubt es uns, einen bestimmten Zelltyp oder eine Kombination von verschiedenen Zelltypen mit einem bestimmten Verhältnis zu verwenden, je nach Art oder das Stadium der Erkrankung. Schließlich können mit hoch angereichertem vordifferenzierten neuralen Vorläuferzellen drastisch verringern mögliche unkontrollierte Proliferation und Bildung von Tumoren mit Hilfe heterogener neuralen Vorläuferzellen, die bona fide NSC ⁶ zugeordnet. Im Allgemeinen Differenzierung neuronaler Stammzellen in 5-10% neuronalen Zellen und mehr als 80% Astrozyten führen. Mit dem NBA-Methode der Differenzierung, wird der Anteil der neuronalen Zellen um bis zu 20-30%, aber immer noch gibt es viele Astrozyten und anderen Stamm-und progenitor Zellen in der Kultur, die nicht wünschenswert sein, wenn man die Absicht hätte, um reinen neuronalen Zellen in vitro zu studieren oder um ihre therapeutische Wirkung in Tiermodellen von neurologischen Krankheiten studieren kann. In diesem Protokoll, nutzten wir inhärenten Unterschiede in den physikalischen und fluoreszierenden Eigenschaften zur Differenzierung NSC Nachkommen zu reinigen unreifer neuronaler Zellen ^5. Unsere Methodik der Durchflusszytometrie Reinigung erhöht den Prozentsatz der neuronalen Zellen 20 bis 30% auf 75-97% ohne nachweisbare Astrozyten und un-differenzierte bona fide neuralen Stamm-und Vorläuferzellen.

Die Anwendung dieser Methodik für die menschliche NSCs profitieren könnten neuronale Zellersatztherapie in der neurologischen Erkrankung. Dieser Ansatz könnte auch für In-vitro-Studien, die hoch gereinigten neuronalen Vorläuferzellen wie Wirkstoff-Screening, Neurotoxikologie, Entwicklungsstudien und Elektrophysiologie benötigen nützlich.

Um konsequent generate hohe Qualität unreifen Neuronen aus NSCs von E14 Maus ganglionären Eminenzen erzeugt, empfehlen wir:

1. Nicht zu lassen, die Kugeln zu groß werden. Große Neurosphären werden mit mehr und weniger Zelltod neurogenen Fähigkeiten assoziiert.
2. Nicht zu vergessen die Kugeln für mehr als 2-3 Minuten trypsinieren. Verlassen Trypsin für mehr als 3 Minuten verursacht Schäden an den Zellen und senkt ihre neurogenen Effizienz.
3. Nicht zu lassen, die proliferierenden Monoschicht geworden over-konfluent. Dies kann mit ihrer normalen Differenzierung stören. Immer, wenn das Medium wechseln Kultur erreicht etwa 90% Konfluenz.
4. Um der Kultur eine mittlere Veränderung am Tag vor der Sortierung. Dieses konditionierte Medium am Tag der Art gesammelt werden und für Plattieren von Zellen. Dieses Medium enthält eine Menge von nicht identifizierten löslichen Faktoren aus den Astrozyten, die Ihnen helfen die sortierten unreifen neuronalen Zellen zu überleben und zu erwerben, einen reiferen Phänotyp wird.
5. Als Nachteile dieses technologie, vorbei an Zellsuspension obwohl Durchflusszytometrie Maschine mit einigen Risiken einschließlich Scherkraft, die die Zellen schädigen könnten und verursachen den Zelltod nach Sorte und auch Pilz-oder bakterielle Kontamination verbunden sein könnte. Um Schäden durch Scherkräfte zu vermeiden, empfehlen wir sortieren die Zelle mit einer angemessenen Geschwindigkeit, und mit Recht Hüllfluid (PBS wird empfohlen) und Düsen richtige Größe (90-100 um) nicht zu lassen, die Art Trigger-Rate mehr als 2500 Ereignisse / Sekunde. Um Verunreinigungen zu vermeiden, stellen Sie sicher das Instrument ordnungsgemäß mit Desinfektionsmittel, bevor Reagenzien Art gereinigt und auch Antibiotika in Ihrem Medium zu sammeln.