El ensayo neuroblasto: un ensayo para la generación y enriquecimiento de las células progenitoras neuronales de la diferenciación de la progenie de células madre neurales Usando citometría de flujo

1. Configuración básica Antes de proceder a la cultura de la célula

1. NeuroCult Medio Basal y NSC NeuroCult Suplementos NSC proliferación se mezclan en una proporción 9:1, respectivamente, para hacer medio completo NSC.
2. Un baño de agua 37 ° C se utiliza para calentar el medio.
3. Cantidad apropiada de calor inactiva suero fetal bovino (FCS) se descongela.
4. Cantidad apropiada de las soluciones madre de factor de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento epidérmico (EGF a 10 g / ml), factor de crecimiento básico de fibroblastos (b-FGF en 10 g / ml) y 0,2% de solución de heparina en tampón fosfato salino (PBS) se descongelan.
5. Frascos de cultivo de tejidos (T25, T75 y T175 o) son necesarios para la expansión del Consejo de Seguridad Nacional y la diferenciación.
6. El cultivo de tejidos tratados 96 y placas de 24 pocillos y cubreobjetos de vidrio se necesitan para el revestimiento con células seleccionadas.

2. El aislamiento, y Expansión (pases) de NSCs

1. Madre neuronales y progenitores se aislaron y expandieron a partir del ratón blluvia como se describe en protocolos separados ^{1, 2 3.}
2. Cuando el neuroesferas (neuroesferas primarias o passaged) están listos para el subcultivo (150-200 micras de diámetro), las esferas medio que contiene se transfiere a un tamaño apropiado estéril tubo de cultivo de tejidos, y se centrifuga a 800 rpm (110 g) durante 5 min a temperatura ambiente.
3. El medio sobrenadante se retira y las esferas se re-suspendió en 1 ml de pre-calentado 0,05% de tripsina-EDTA.
4. Después de la incubación en un baño de agua 37 ° C durante 2-3 min, un volumen igual de inhibidor de tripsina de soja se añade a la suspensión de células para detener la actividad de la tripsina.
5. Para garantizar que la tripsina ha sido completamente inactiva, la suspensión celular se pipetearon suavemente hacia arriba y hacia abajo 3-5 veces.
6. Después de centrifugación a 800 rpm (110 g) durante 5 min, el sobrenadante se retira y las células se re-suspendió en 1 ml de medio completo NSC.
7. 10ul de la suspensión celular se mezcla con 90 l de trypan azul para realizar un recuento de células.
   Nota: Otros diluciones apropiadas de células también puede ser utilizado.
   
8. Las células se utilizan entonces para subcultivo ^{1, 2} o para la diferenciación como se describe a continuación.

3. Diferenciación de células madre neurales y células progenitoras, el ensayo de neuroblastos (NBA)

1. Las células resultantes de neuroesferas disociadas se sembraron a una concentración de 2-3 x 10 ⁵ células / ml en el medio completo NSC suplementado con 20 ng / ml de EGF, 10 ng / ml de bFGF, 1 l / ml de 0,2% y 5% de heparina inactivado por calor FCS en un frasco de cultivo de tejido del tamaño apropiado. 5 ml de medio se utiliza para T25, T75 20 ml y 40 ml de matraces T175.
   Nota: FCS hará que las células se adhieren firmemente al sustrato y no hay necesidad de recubrimiento de los matraces para el cultivo de la NBA.
   
2. Cultoure frascos se incuban en un 37 ° C humidificado incubadora con 5% de CO ₂ durante 3-4 días. Este período se denomina etapa de proliferación, durante el cual progenie NSC adjuntar al sustrato y proliferar como una monocapa de células.
3. Cuando el cultivo se convierte en un 90-95% confluentes, el medio de cada matraz se cambia a la completa medio NSC suplementado con 5% de FCS sin factores de crecimiento.
4. Frascos de cultivo se incuba de nuevo en un 37 ° C humidificado incubadora con 5% de CO ₂ durante otros 3-4 días. Este período se denomina etapa de diferenciación, durante el cual los progenitores neuronales aparecen en la parte superior de una monocapa de astrocitos y proliferan para hacer colonias de células inmaduras neuronales. En el día 4-5 de la etapa de diferenciación, la cultura está listo para el aislamiento de las células de neuroblastos que utilizan la tecnología de citometría de flujo.

4. De preparación de células para citometría de flujo

Trypsinización

1. El cultivo de diferenciar progenie NSC en días 4-5 de la etapa de diferenciación se lava una vez con una cantidad apropiada de PBS (2 ml para T25, 4 ml para T75 y 8 ml para T175 matraz) para eliminar FCS a partir del cultivo.
   Nota: FCS bloques de tripsina-EDTA actividad.
   
2. A continuación, una cantidad suficiente de pre-calentado 0,05% de tripsina-EDTA (2 ml para T25, T75 4 ml para y 8 ml para T175 matraz) se añadió a cada matraz para cubrir la monocapa de células y se incubaron durante 1-2 minutos en un 37 ° C humidificado incubadora.
3. El matraz se observa bajo el microscopio para evaluar el efecto de tripsina-EDTA en el cultivo. El matraz se mantiene entonces con una mano y golpeó firmemente con la otra mano para desalojar las células de la parte inferior del matraz.
4. Volumen igual de inhibidor de tripsina de soja se añade al matraz para saciar actividad de la tripsina. La suspensión celular se pipetearon suavemente hacia arriba y hacia abajo para asegurar la inactivación de tripsina y para lograr una sola célula homogéneasuspensión.
   Nota: Como alternativa, el medio suplementado con 5% de FCS se podría utilizar para apagar la actividad de la tripsina.
   
5. Para quitar no disociadas grumos, la suspensión de células se hace pasar a través de un filtro de malla 40-micras de tamaño.
6. La suspensión de células se centrifuga a 800 rpm (110g) durante 5 min, el sobrenadante se retiró y las células se resuspenden en un volumen apropiado de medio completo NSC.
7. El volumen final de la suspensión celular se ajusta de modo que la densidad celular no exceda de 2-3x10 ⁶ -cells/ml. Alta densidad celular puede causar un bloqueo en el flujo de la citometría de flujo de la máquina.
8. Si a usted le gustaría aislar a las células neuronales solo en base a sus propiedades físicas, ahora se puede proceder a la clasificación FACS como se describe en la parte 4.
9. Antes de su clasificación, yoduro de propidio (PI, Sigma, 500 ug / ml en PBS) se añade a una concentración de 1 l / ml de suspensión celular para excluir las células muertas.

Vivo cell inmunomarcación

Para lograr una mayor pureza de las células neuronales, cosechado sola célula de la cultura NBA se pueden teñir para PSA-NCAM (un marcador de principios de progenitores neuronales inmaduras) y después las células positivas de la población neuronal se puede aislar utilizando la máquina FACS.

1. Después de realizar un recuento de células, la suspensión de células individuales a partir del cultivo NBA se divide en cuatro grupos:
   • Las células solas de grupo, sirve como un control para ajustar los parámetros y las puertas (0,5-1 x 10 ⁶ células).
   • Las células más PI, sirve como un control para ajustar los parámetros y las puertas (0,5-10 x 10 ⁶ células). PI células negativas de este grupo también se pueden clasificar según las características físicas células.
   • Secundaria solo (control de isotipo) grupo que también sirve como un control para ajustar los parámetros y las puertas (1-2 x 10 ⁶ células).
   • Inmunomarcaje grupo (8-10 x 10 ⁶ células) que se tiñe para PSA-NCAM para lograrpurificación adicional de las células neuronales inmaduras. Para excluir las células muertas sobre la clasificación, el PI se añade a este grupo también.
2. Para iniciar inmunomarcaje, las células se centrifugan a 800 rpm (110 g) durante 5 min. Se elimina el sobrenadante y las células se re-suspendió en 100 l de medio completo NSC.
3. Ficoeritrina (PE) conjugado anti-PSA-NCAM anticuerpo se añade en una proporción de 10 l / 5-10 x 10 ⁶ células de la suspensión de células que se tiñeron para PSA-NCAM. De la misma manera, un PE ratón conjugado anticuerpo IgG1 isotipo de control se añade a la suspensión de células de control isotipo. Siga las instrucciones sobre la hoja de especificaciones anticuerpo con respecto a la concentración de anticuerpo que se utiliza. La suspensión celular se mezcla entonces suavemente y se incubaron a temperatura ambiente durante 10-15 minutos en la oscuridad.
4. Las suspensiones de células (PSA-NCAM y tubos control de isotipo) A continuación se centrifuga a 800 rpm (110 g) durante 5 min, el sobrenadante se retira y las células son re-suspended en 1 ml de medio completo Consejo de Seguridad Nacional.
5. Para eliminar el exceso de anticuerpos no-acotados de las muestras, de 4 pasos se repite 2-3 veces.
6. Después de volver a suspender las células en un volumen apropiado de medio, yoduro de propidio (PI, Sigma, 500 ug / ml en PBS) se añade a una concentración de 1 l / ml de las suspensiones de células (células más PI, el control de isotipo y PSA- NCAM-manchado muestras) para excluir las células muertas cuando se analizaron por citometría de flujo.
7. 15 ml estériles tubos Falcon que contienen 1 ml de medio completo se preparan para recoger las células ordenados de poblaciones de células diferentes.

5. Fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) de las neuronas inmaduras

1. La máquina FACS se establece en función de su manual de instrucciones del usuario a través de la citometría de flujo técnico de expertos instalación.
2. Tampón fosfato salino (PBS) o cualquier otra solución adecuada Depending en las instrucciones del fabricante, se podría utilizar como fluido de vaina a 28 PSI a través de una boquilla 90 micras.
3. La presión diferencial en el sistema se ajusta de tal manera que la tasa de gatillo tipo no exceda de 2500 eventos por segundo.
4. La suspensión de células a partir de las células solas grupo se ejecuta a través de la máquina FACS.
5. En primer lugar, las células (los acontecimientos) se trazan en función de su tamaño (dispersión frontal (FSC), la luz) frente a la complejidad interna (dispersión lateral (SSC) de la luz) para distinguir las diferentes poblaciones celulares. Para ello, los parámetros de tensión para el FSC y SSC debe ajustarse de modo que las células se puede ver en la trama citometría de flujo.
6. Para excluir grupos de células y jubones, las células se trazan primero basado en el área de dispersión frontal (FSC-A) en función del ancho de pulso de dispersión hacia adelante (FSC-W) y la población de células sola es cerrada ya que la población 1 (P1). Luego, las células P1 se trazan sobre la base de área de dispersión lateral (SSC-A) versus dispersión lateral ancho de pulso (FSC-W) y esta vez las células individuales son gated que la población 2 (P2). Después de haber establecido estos dos puertas consecutivas, grupos o dobletes (ancho de pulso de alta del FSC y de alta anchura de pulso de cooperación Sur-Sur) están siendo excluidos.
7. Para excluir las células muertas o dañadas, las células individuales (P2) se trazan sobre la base de la reactividad frente al PI FSC-A y la única población de células vivas es cerrada.
8. Soltero células vivas se trazan sobre la base de FSC frente a SSC para distinguir las diferentes poblaciones de células basadas en el tamaño celular y la granularidad interna. En esta etapa, dos poblaciones de células principales son activados con la certificación FSC ^bajo la CSE ^baja (P3) y FSC ^alta CSE ^alta (P4), las poblaciones de células.
9. Para ordenar PSA-NCAM inmuno-reactiva las células neuronales inmaduras de la población del FSC ^bajo la CSE ^baja, primera ^baja de la población FSC cooperación Sur-Sur ^bajo el control de las células (además de IP y control de isotipo) los grupos se ha trazado sobre la base de inmunoreactividad PE frente a FSC-A y el negativo Las células son cerrada (P5), y luego las células positivas de PSA-NCAMgrupo de manchas son cerrada ya que la población 6 (P6).
10. Después de ajustar todas las puertas necesarias, las células de los intereses se clasifican en 15 ml en tubos estériles de cultivo de tejidos que contienen 1 ml de medio de NSC.
11. Ordenar las células se centrifugan a 1200 rpm (240 g) durante 5 min.
12. El sobrenadante se desecha y el sedimento se resuspendió en un volumen apropiado de medio (dependiendo del tamaño de pellets) y un recuento de células se lleva a cabo.
13. Las células se cultivaron entonces en poli-L-ornitina revestidos placas de 96 pocillos a una densidad de 20-30 x 10 ³ células / pocillo en 200-250 l de medio completo NSC con 5% de FCS y 20 ng / ml humana recombinante BMP4 ⁵ .

Nota: para recubrir 96 pocillos, 100 l de poli-L-ornitina solución de trabajo (1,5 ml de poli-O y 8,5 ml de PBS estéril) se añade a cada pocillo y la placa se incubó en un incubador a 37 ° C durante al menos un hora. A continuación, el poli-O se elimina y cada pocillo se lavó tres veces con PBS estéril(Dejar que el PBS permanecen en el pozo durante 10 minutos cada vez). Utilizar 500 l de poli-L-ornitina solución de trabajo / bien si placas de 24 pocillos se utilizan.

14. Las células se fijan en diferentes puntos temporales después de la orden usando paraformaldehído al 4% y immunostained de adecuados marcadores de células neuronales y gliales para evaluar el fenotipo de las células seleccionadas de diferentes poblaciones de células.

6. Los resultados representativos

En el cultivo de ensayo neuroblasto diferenciación (NBA), células cultivadas en placas adjuntar al sustrato de cultivo de tejidos y crecer como una monocapa. Dependiendo de la densidad inicial de siembra de células, la cultura se convierta en una cultura del 90-95% confluentes después de 3-4 días. En esta etapa, una monocapa de células, principalmente los astrocitos pueden ser visualizados por debajo con células pequeñas y redondas progenitoras neuronales en la parte superior ^4,5 (Figura 1). Después de cambiar el medio a un medio de factor de crecimiento libre, las células progenitoras neuronales empezardividiendo rápidamente y generar grupos de células inmaduras neuroblast en la parte superior de la monocapa astrocítico en 4-5 días (Figura 2). Análisis de citometría de flujo de disociar la cultura de la NBA en 4-5 días de la etapa de diferenciación, se muestran dos poblaciones de células principales, ^bajo el FSC y FSC CSE ^{baja alta alta} SSC basado en el tamaño celular (FSC) y granularidad interna (SSC) (Figura 3). Inmuno-fluorescencia análisis de las células ordenados demuestra que las células neuronales se encuentran principalmente en las poblaciones ^{de bajo} FSC CSE ^baja (con más del 75% de ellos expresan β-tubulina III), mientras que las células ordenados de la población ^{de alto} FSC cooperación Sur-Sur son en su mayoría ^{de alta} GFAP astrocitos inmunorreactivas (Figura 4). Purificación adicional de las células neuronales inmaduras hasta cerca de la homogeneidad (97%) se podría lograr con la selección positiva de PSA-NCAM células de infrarrojos de la población del FSC ^bajo la CSE ^baja (Figura3, 4). Enriquecidos células neuronales generados a partir de los aislados de NSCs E14 eminencias ratón ganglionares adquirir un fenotipo GABAérgica y expresa DARPP-32, un marcador de neuronas espinosas medias, la diferenciación (Figura 5).

Figura 1. Neuroblasto cultivo de ensayo a partir de células madre de ratón E14 neuronales en el día 4 de la etapa de proliferación. Este cultivo en monocapa se compone de células planas astrocíticos (puntas de flecha) y debajo de todo el las células progenitoras neuronales (flechas) en la parte superior. Original amplificación; 20 x.

. Figura 2 neuroblasto cultivo de ensayo a partir de células madre de ratón E14 neuronales en el día 4 de la etapa de diferenciación: un contraste de fase), B) la tinción de inmunofluorescencia. Tenga en cuenta el cúmulo de células neuronales inmaduras (flechas en A B) en la parte superior de la monocapa astrocítico (cabezas de flecha en una tinción, GFAP en B). Original amplificación; 20 x.

. Figura 3 parcelas representativas de clasificación: A). FSC frente a SSC plan de ordenación antes de la exclusión de dobletes y las células muertas. B, C). Ordenar las parcelas de exclusión de dobletes sobre la base de FSC y SSC ancho de pulso. D). La exclusión de las células muertas y dañadas basado en inmunoreactividad yoduro de propidio. E). FSC frente a SSC terreno después de la exclusión de dobletes y las células muertas, mostrando las dos principales poblaciones de la etiqueta como el FSC, SSC ^{baja baja} y las ^altas poblaciones del FSC SSC ^alta. F, G). Ordenar las parcelas para aislar PSA-NCAM células inmaduras de infrarrojos de la población de ^bajos FSC CSE ^baja.

Micrografías de la figura 4. Representante de las células ordenadas de distintas poblaciones un día después de placas. A) FSC ^baja población de la CSE ^baja (más del 75% de estas células son las neuronas). B) FSC ^alta población de cooperación Sur-Sur ^{de alto} (la mayoría de estas células son los astrocitos ). C) PSA-NCAM ⁺ células ordenados de FSC ^baja población de la CSE ^baja (casi todas las células seleccionadas son las neuronas). Aumento original, de 20 x.

Figura 5. Clasificar las neuronas inmaduras se diferencien en neuronas GABAérgicas (A) y expresa DARPP-32 (B), un marcador de neuronas espinosas medias.

La capacidad de aislar las poblaciones definidas de células neuronales (neuronas, es decir, astrocitos y oligodendrocitos) podría resolver algunos de los impedimentos asociados con la aplicación clínica de células madre neurales (NSC). En primer lugar, nos permite caracterizar completamente la población a partir de las células del donante. En segundo lugar, nos permite utilizar un tipo de célula particular, o una combinación de diferentes tipos de células con una proporción específica, dependiendo de la naturaleza o la etapa de la enfermedad. Por último, el uso altamente enriquecido antes de progenitores de células neuronales diferenciadas puede disminuir dramáticamente la posible proliferación incontrolada y la formación de tumores asociados con el uso de los precursores neuronales heterogéneos que contienen buena fe NSC ^6. Generalmente diferenciación de las células madre neurales se traducirá en células neuronales 5-10% y más de 80% astrocitos. Utilizando el método de la NBA de la diferenciación, el porcentaje de las células neuronales se incrementará hasta un 20-30%, pero todavía hay un montón de astrocitos y madre y otros progenitor células en la cultura, que no puede ser deseable si uno pretende estudiar puras células neuronales in vitro o para estudiar su efecto terapéutico en modelos animales de enfermedades neurológicas. En este protocolo, nos aprovechamos de las diferencias inherentes en las propiedades físicas y fluorescentes para diferenciar la progenie Consejo de Seguridad Nacional para purificar las células neuronales inmaduras ^5. Nuestra metodología de purificación de la citometría de flujo se incrementa el porcentaje de células neuronales de un 20-30% a 75-97% sin astrocitos detectables y no-diferenciada de buena fe, madre neurales y células progenitoras.

La aplicación de esta metodología para NSCs humanos podrían beneficiarse la terapia de reemplazo neuronal celular en la enfermedad neurológica. Este enfoque también podría ser útil para los estudios in vitro que necesitan altamente purificado las células neuronales progenitoras, tales como la detección de drogas, neurotoxicología, estudios de desarrollo y la electrofisiología.

Para ser capaz de consistentemente GEnerado de alta calidad, las neuronas inmaduras de NSCs generados a partir de E14 eminencias ganglionares de ratón, le recomendamos:

1. No permitas que las esferas crecen demasiado. Neuroesferas grandes se asocian con la muerte celular cada vez menos capacidad neurogénica.
2. No trypsinize las esferas de más de 2-3 minutos. Dejando de tripsina durante más de 3 minutos causa daños a las células y disminuye su eficiencia neurogénica.
3. No dejar que la proliferación de la monocapa confluente convertido con el paso-. Esto puede interferir con su proceso de diferenciación normal. Siempre, cambiar de medio cuando el cultivo alcance aproximadamente el 90% de confluencia.
4. Para dar a la cultura de un cambio medio en el día antes de clase. Este medio condicionado se pueden recoger en el día de clase y se utiliza para las células de galvanoplastia. Este medio contiene una gran cantidad de no identificados los factores solubles de las células de los astrocitos que ayudarán a las células neuronales inmaduras ordenados para sobrevivir y adquirir un fenotipo más maduro.
5. Como desventajas de este tecnología, pasando por la suspensión de células, aunque la máquina de citometría de flujo podría estar asociado con algunos riesgos, incluida la fuerza de cizallamiento que podrían dañar las células y provocar la muerte celular en clase y la contaminación también hongos o bacterias. Para evitar daños por la fuerza de corte, se recomienda la clasificación de la célula a una velocidad adecuada, y el uso de fluido de vaina derecha (PBS se recomienda) y boquillas adecuadas tamaño (90-100 m) de no permitir que la tasa de activación tipo de más de 2500 eventos por segundo. Para evitar la contaminación, asegúrese de que el instrumento ha sido limpiado correctamente el uso de reactivos desinfectantes antes de clase y también utilizan los antibióticos en el medio de la recolección.