O Ensaio neuroblasto: um ensaio para a Geração e Enriquecimento de células progenitoras neuronais de Diferenciando Progeny Neural Stem Cell utilizando citometria de fluxo

1. Configuração básica antes de prosseguir para Cultura Celular

1. NeuroCult Médio NSC basal e Suplementos NeuroCult NSC proliferação, são misturados a uma proporção de 9:1, respectivamente, para fazer médio NSC completa.
2. A 37 ° C banho de água é usada para aquecer o meio.
3. Quantidade apropriada de inactivado pelo calor soro fetal de vitelo (FCS) é descongelado.
4. Quantidade apropriada de soluções de reserva do factor de crescimento incluindo o factor de crescimento epidérmico (EGF a 10 ug / ml), factor de crescimento básico de fibroblastos (b-FGF, 10 ug / ml) e 0,2% de solução de heparina em salina tamponada com fosfato (PBS) são descongeladas.
5. Frascos de cultura de tecidos (T25, T75 e T175 ou) são necessários para NSC expansão e de diferenciação.
6. A cultura de tecidos tratados 96 e placas de 24 poços e lamelas de vidro são necessários para cultivar células ordenados.

2. Isolamento e Expansão (Passaging) de NSCs

1. -Tronco neurais e progenitores são isoladas e se expandiu a partir do mouse bchover, tal como descrito nos protocolos separadas ^{1, 2 e 3.}
2. Quando o neuroesferas (neuroesferas primária ou passadas) estão prontos para subcultura (150-200 um de diâmetro), as esferas meio contendo é transferida para um tubo de cultura apropriado tamanho estéril tecido, e centrifugado a 800 rpm (110 g) durante 5 min à temperatura ambiente.
3. O meio sobrenadante é removido e as esferas são re-suspensas em 1 ml de pré-aquecida a 0,05% de tripsina-EDTA.
4. Após a incubação num banho de água 37 ° C durante 2-3 min, um volume igual de inibidor de tripsina de soja é adicionado à suspensão de células para parar a actividade da tripsina.
5. Para assegurar que a tripsina foi completamente inactivada, a suspensão de células é suavemente pipetados para cima e para baixo 3-5 vezes.
6. Após centrifugação a 800 rpm (110 g) durante 5 min, o sobrenadante é removido e as células são re-suspensas em 1 ml de meio de NSC completa.
7. 10 ul da suspensão celular é misturada com 90 uL de trypan azul para realizar uma contagem de células.
   Nota: Outras diluições de células adequadas pode também ser usado.
   
8. As células são então utilizadas para subcultura ^{1, 2} ou para a diferenciação, como descrito abaixo.

3. Diferenciação de tronco neurais e células progenitoras, O Ensaio neuroblastos (NBA)

1. Células resultantes de neuroesferas dissociadas são plaqueadas a uma concentração de 2-3 x 10 ⁵ células / ml em meio NSC completo suplementado com 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml de bFGF, 1 ul / ml de heparina a 0,2% e 5% FCS inactivado pelo calor, em um frasco de cultura apropriado tamanho do tecido. 5 ml de meio é usado para T25, 20 ml para T75 e 40 ml para frascos T175.
   Nota: FCS fará com que as células para anexar firmemente ao substrato e não há necessidade de revestimento dos frascos para cultura NBA.
   
2. Cultofrascos Ure são então incubadas em 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO _2, durante 3-4 dias. Este período é chamado fase de proliferação, durante o qual a descendência NSC anexar para o substrato e proliferam como uma monocamada de células.
3. Quando a cultura se torna confluente de 90-95%, o meio de cada balão está ligado ao meio de NSC completo suplementado com FCS 5%, sem quaisquer factores de crescimento.
4. Frascos de cultura são novamente incubadas em 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO ₂ por mais 3-4 dias. Este período é chamado estágio de diferenciação, durante o qual progenitores neuronais aparecem no topo de uma monocamada astrocítica e proliferam para fazer as colónias de células neuronais imaturas. No dia 4-5 do estágio de diferenciação, a cultura está pronto para o isolamento das células neuroblasto usando a tecnologia de citometria de fluxo.

4. Preparação de células por citometria de fluxo

Trypsinização

1. A cultura de diferenciar progenitura NSC no dia 4-5 do estágio de diferenciação é lavada uma vez com uma quantidade apropriada de PBS (2 ml por T25, 4 ml de T75 e 8 ml para T175 balão) para remover FCS a partir da cultura.
   Nota: FCS blocos Tripsina-EDTA atividade.
   
2. Em seguida, uma quantidade suficiente de pré-aquecida a 0,05% de tripsina-EDTA (2 ml por T25, 4 ml de T75 e 8 ml para T175 balão) é adicionado a cada frasco para cobrir a monocamada de células e incubado durante 1-2 min em uma 37 ° C incubadora humidificada.
3. O balão é verificada ao microscópio para avaliar o efeito de Tripsina-EDTA sobre a cultura. O balão é então realizada com uma mão e atingiu firmemente com a outra mão para desalojar as células da parte inferior do balão.
4. Volume igual de inibidor de tripsina de soja é adicionado ao balão para extinguir a actividade da tripsina. A suspensão de células é suavemente pipetados para cima e para baixo para assegurar a inactivação de tripsina e para conseguir uma célula única homogéneasuspensão.
   Nota: Alternativamente, meio suplementado com FCS 5% pode ser usado para extinguir a actividade da tripsina.
   
5. Para remover não diferenciados aglomerados, a suspensão de células é passada através de um filtro de malha 40-m de tamanho.
6. A suspensão de células é então centrifugado a 800 rpm (110g) durante 5 min, o sobrenadante é removido e as células são re-suspensas num volume apropriado de meio NSC completa.
7. O volume final de suspensão de células é ajustada de modo que a densidade de células não exceda 2-3x10 ⁶ -cells/ml. A densidade celular elevada pode causar o bloqueio de fluxo na máquina de citometria de fluxo.
8. Se você gostaria de isolar as células neuronais apenas com base em suas propriedades físicas, agora você pode continuar a FACS de classificação, conforme descrito na parte 4.
9. Antes de triagem, iodeto de propídio (PI, Sigma, 500 ug / ml em PBS) é adicionado a uma concentração de 1 ul / ml de suspensão de células para excluir as células mortas.

Ao vivo cell imunomarcação

Para alcançar uma pureza mais elevada de células neuronais, colhido única célula a partir da cultura NBA podem ser coradas para PSA-NCAM (um marcador de início imaturos progenitores neuronais) e, em seguida, as células positivas a partir da população neuronal pode ser isolado utilizando a máquina de FACS.

1. Depois de realizar uma contagem de células, a suspensão de célula única a partir da cultura NBA é dividido em quatro grupos:
   • Células de grupo, por si só serve como um controlo para ajustar os parâmetros e portões (0,5-1 x 10 ⁶ células).
   • Células mais PI, serve como um controlo para ajustar os parâmetros e portões (0,5-10 x 10 ⁶ células). Células pi negativo deste grupo pode também ser classificados com base nas características físicas de células.
   • Secundário sozinho grupo (isotipo de controlo), que também serve como um controlo para ajustar os parâmetros e portões (1-2 x 10 ⁶ células).
   • Imunomarcação grupo (8-10 x 10 ⁶ células) que é corado para PSA-NCAM para atingirpurificação adicional das células imaturas neuronais. Para excluir as células mortas sobre a classificação, PI é adicionado a esse grupo também.
2. Para iniciar imunomarcação, as células são centrifugadas a 800 rpm (110 g) durante 5 min. O sobrenadante é removido e as células são re-suspensas em 100 uL de meio de NSC completa.
3. Ficoeritrina (PE) anticorpo anti-PSA-NCAM conjugado é adicionado a uma razão de 10 ul / 5-10 x 10 ⁶ células para a suspensão de células a serem coradas para PSA-NCAM. Da mesma forma, um ratinho conjugada PE IgG1 anticorpo de controlo de isotipo é adicionado à suspensão de células de isotipo de controlo. Seguir as instruções sobre a folha de especificação anticorpo em relação à concentração de anticorpo a ser utilizado. A suspensão de células é então misturada suavemente e incubada à temperatura ambiente durante 10-15 min no escuro.
4. As suspensões de células (PSA-NCAM e os tubos de controlo de isotipo) são então centrifugadas a 800 rpm (110 g) durante 5 min, o sobrenadante é removido e as células são re-suspended em 1 ml de meio de NSC completa.
5. Para remover o excesso de un-delimitadas anticorpos a partir das amostras, 4 passo é repetido 2-3 vezes.
6. Depois de re-suspensão de células num volume apropriado de meio, iodeto de propídio (PI, Sigma, 500 ug / ml em PBS) é adicionado a uma concentração de 1 ml / ul das suspensões de células (células mais PI, isotipo de controlo e PSA- NCAM coradas amostras) para excluir as células mortas quando analisados ​​por citometria de fluxo.
7. 15 ml tubos estéreis falcon contendo 1 ml de meio completo estão preparados para recolher as células ordenados de populações de células diferentes.

5. Fluorescência-activated cell sorting (FACS) de neurônios imaturos

1. A máquina FACS está configurado com base em sua instrução manual do usuário através do fluxo de técnico especialista em citometria de instalação.
2. Salina tamponada com fosfato (PBS) ou qualquer outra solução adequada depending em instruções do fabricante, poderia ser usado como fluido de bainha menos 28 PSI através de um bocal 90 uM.
3. Pressão diferencial no sistema é ajustada de tal modo que a taxa de gatilho tipo não exceda 2500 eventos por segundo.
4. A suspensão de células a partir das células por si só grupo é executado através da máquina de FACS.
5. Primeiro, as células (eventos) são traçados com base em seu tamanho (Forward Scatter (FSC) luz) versus complexidade interna (Side Scatter luz (SSC)) para distinguir diferentes populações de células. Para fazer isso, os parâmetros de tensão para o FSC e SSC deve ser ajustada de modo que as células pode ser visto na trama de citometria de fluxo.
6. Para excluir aglomerados de células e doublet, as células são primeiro traçado com base na área de dispersão para a frente (FSC-A) versus largura de impulso para a frente de dispersão (FSC-W) ea população única célula é fechado como população 1 (P1). Em seguida, as células P1 são traçados com base na área do lado de dispersão (SSC-A) x largura de pulso de dispersão lateral (FSC-W) e este tempo as células individuais são gated como população 2 (P2). Tendo estabelecido esses dois portões consecutivos, grupos ou dupletos (largura de pulso de alta FSC e SSC alta largura de pulso) estão sendo excluídos.
7. Para excluir células mortas ou danificadas, as células individuais (P2) são plotados com base na PI reatividade contra FSC-A ea população única célula viva está fechado.
8. Individuais de células vivas são traçados com base no FSC contra SSC para distinguir diferentes populações de células com base no tamanho da célula e granularidade interna. Nesta fase duas populações celulares principais são gated como FSC ^baixo SSC ^baixo (P3) e de ^alta FSC SSC ^elevada (P4) populações de células.
9. Para classificar PSA-NCAM imuno-reativas imaturos células neuronais da população SSC FSC ^{baixo baixo,} primeiro o FSC população SSC ^{baixo baixo} do controle de células (mais PI e isotipo controle) grupos é traçado com base na imunorreatividade PE contra FSC-A eo negativo As células são gated (P5), e, em seguida, as células positivas de PSA-NCAMgrupo manchado são gated como população 6 (P6).
10. Depois de ajustar todas as portas necessárias, as células de interesses são classificados em 15 ml de tubos de tecido estéreis de cultura contendo 1ml médio NSC.
11. As células são então classificadas centrifugada a 1200 rpm (240 g) durante 5 min.
12. Sobrenadante é eliminado eo sedimento é re-suspenso em um volume apropriado de meio (dependendo do tamanho pellet) e uma contagem de células é realizada.
13. As células são então plaqueadas em poli-L-ornitina revestidos placas de 96 poços a uma densidade de 20-30 x 10 ³ células / poço em 200-250 ul de meio completo com NSC FCS 5% e 20 ng / ml humana recombinante BMP4 ⁵ .

Nota: para o revestimento 96 poços, 100 ul de Poli-L-ornitina solução de trabalho (1,5 ml de poli-O e 8,5 ml de PBS estéril) é adicionado a cada poço ea placa é incubada numa incubadora a 37 ° C durante pelo menos uma horas. Em seguida, o poli-S é removido e cada poço é lavado três vezes com PBS estéril(Deixe o PBS permanecem no poço durante 10 min de cada vez). Use 500 uL de poli-L-ornitina solução de trabalho / poço se placas de 24 poços são utilizados.

14. As células são então fixadas em pontos de tempo diferentes após ordenação usando paraformaldeído a 4% frio e imunocoradas para adequadas marcadores de células neuronais e gliais para avaliar o fenótipo de células ordenados de populações de células diferentes.

6. Os resultados representativos

No neuroblasto cultura diferenciação de ensaio (NBA), células plaqueadas anexar para o substrato de cultura de tecidos e crescer como uma monocamada. Dependendo da densidade inicial de células em placas, a cultura vai se transformar em uma cultura de 90-95% confluentes após 3-4 dias. Nesta fase, uma monocamada de células, principalmente astrocíticos pode ser visualizado por baixo com pequenas redondas células progenitoras neuronais em ^4,5 topo (Figura 1). Depois de mudar o meio para um meio de fator de crescimento livre, as células progenitoras neuronais começardividindo rapidamente e gerar grupos de células neuroblasto imaturas no topo da monocamada astrocítica em 4-5 dias (Figura 2). Análise de citometria de fluxo da cultura NBA dissociado em dia 4-5 do estágio de diferenciação, mostra duas populações de células principais; FSC ^baixo SSC ^baixa e ^alta FSC SSC ^elevada com base no tamanho da célula (FSC) e granularidade interna (SSC) (Figura 3). Imuno-fluorescente análise das células ordenados mostra que as células neuronais são principalmente localizados nas populações FSC ^baixos SSC ^baixo (com mais de 75% deles expressando β-III tubulina), enquanto as células ordenadas a partir da população FSC SSC ^{alta alta} são na sua maioria GFAP astrócitos imunorreactivos (Figura 4). A purificação adicional da imaturos células neuronais até homogeneidade próximo (97%) poderia ser alcançado com a selecção positiva de células PSA-NCAM IR a partir da população FSC SSC ^{baixo baixo} (Figura3, 4). Enriquecidas células neuronais gerados a partir dos NSCs isoladas de E14 eminências rato ganglionares adquirir um fenótipo GABAérgico e expressa DARPP-32, um marcador de neurónios espinais médio, na diferenciação (Figura 5).

Figura 1. Cultura ensaio neuroblasto de E14 de mouse células-tronco neurais no dia 4 de estágio de proliferação. Esta cultura de monocamada consiste de células planas astrocíticos (pontas de seta) debaixo e redondos células progenitoras neuronais (setas) na parte superior. Aumento original; 20 x.

. Figura 2 cultura ensaio neuroblasto de E14 de mouse células-tronco neurais no dia 4 de estágio de diferenciação: um contraste de fase), de coloração B) imunofluorescência. Observe o aglomerado de células neuronais imaturas (setas em A B) na parte superior da monocamada astrocítica (cabeças de seta em A coloração GFAP, em B). Aumento original; 20 x.

Figura 3. Parcelas de classificação representativos: A). FSC vs SSC trama tipo antes exclusão de dupletos e células mortas. B, C). Parcelas de classificação para a exclusão de dupletos com base no FSC e SSC largura de pulso. D). Exclusão de células mortas e danificadas com base na imunorreactividade de propídio iodeto. E). FSC vs SSC trama após a exclusão de dupletos e células mortas, mostrando os dois principais populações rotulados como de ^baixa FSC SSC ^baixo e os FSC ^altas populações SSC ^elevadas. F, G). Parcelas de classificação para isolar as células PSA-NCAM IR imaturas do FSC população SSC ^{baixo baixo.}

Micrografias Figura 4. Representativos de células ordenadas a partir de diferentes populações um dia após o plaqueamento. A) FSC ^baixo população SSC ^baixa (mais de 75% destas células são neurónios). B) FSC ^alta população SSC ^elevada (a maioria destas células são astrócitos ). C) PSA-NCAM ⁺ células classificados do FSC população SSC ^{baixo baixo} (quase todas as células são classificadas neurônios). Ampliação Original; 20 x.

A Figura 5. Ordenado neurónios imaturos diferenciar em neurónios GABAérgicos (A) e expressas DARPP-32 (B), um marcador para médio neurónios espinais.

A capacidade de isolar populações definidas de células neurais (neurônios, ou seja, astrócitos e oligodendrócitos) pode resolver alguns dos impedimentos associados à aplicação clínica de células-tronco neurais (NSCs). Em primeiro lugar, permite-nos para caracterizar completamente a população inicial de células do doador. Em segundo lugar, nos permite usar um tipo particular de célula ou uma combinação de diferentes tipos de células com um rácio específico, dependendo da natureza ou da fase da doença. Por último, utilizando altamente enriquecido pré diferenciadas progenitores de células neurais pode diminuir drasticamente a proliferação descontrolada possível e formação de tumores associados à utilização de precursores neurais heterogêneas contendo bona fide NSC ^6. Geralmente diferenciação de células estaminais neurais irá resultar em células neuronais 5-10% e mais de 80% astrócitos. Utilizando o método de NBA de diferenciação, a percentagem de células neuronais irá aumentar até 20-30%, mas ainda há muitos astrócitos e tronco e outra pcélulas rogenitor na cultura, o que não pode ser desejável se um seria pretende estudar puros células neuronais in vitro ou para estudar o seu efeito terapêutico em modelos animais de doenças neurológicas. Neste protocolo, aproveitamos diferenças inerentes nas propriedades físicas e fluorescentes de diferenciação progênie NSC para purificar as células neuronais imaturas ^5. Nosso fluxo de metodologia de citometria de purificação aumenta a porcentagem de células neuronais de 20-30% para 75-97% sem astrócitos detectáveis ​​e não-diferenciada-tronco de boa-fé neural e células progenitoras.

A aplicação desta metodologia para NSCs humanos pode beneficiar a terapia de reposição celular neuronal na doença neurológica. Esta abordagem pode também ser útil para estudos in vitro que necessitam altamente purificada de células progenitoras neuronais, como o rastreio de drogas, neurotoxicologia, estudos de desenvolvimento e electrofisiologia.

Para ser capaz de consistentemente generate alta qualidade neurônios imaturos de NSCs gerados a partir de E14 de mouse eminências ganglionares, recomendamos:

1. Não deixar que as esferas crescer muito grande. Neuroesferas grandes estão associados com a morte de mais células e habilidades menos neurogênicos.
2. Para não trypsinize as esferas por mais de 2-3 minutos. Deixando tripsina durante mais de 3 minutos provoca danos para as células e diminui a sua eficiência neurogénica.
3. Para não deixar a monocamada proliferando-se sobre-confluentes. Isto pode interferir com o seu processo de diferenciação normal. Sempre, alternar médio quando a cultura atinge cerca de 90% de confluência.
4. Para dar ao meio de cultura uma mudança no dia antes de classificação. Este meio condicionado pode ser recolhidas no dia da espécie e utilizados para as células de revestimento. Este meio contém uma série de fatores solúveis não identificados a partir das células astrocíticos que ajudarão os ordenados imaturos células neuronais para sobreviver e adquirir um fenótipo mais maduro.
5. Como desvantagens para este tecnologia, passando suspensão de células que máquina citometria de fluxo pode ser associada a alguns riscos, incluindo força de cisalhamento que podem danificar as células e causar morte celular em espécie e também a contaminação por fungos ou bactérias. Para evitar danos por força de cisalhamento, recomendamos classificando o celular em uma velocidade adequada, e usando fluido bainha direita (PBS é recomendado) e bicos tamanho certo (90-100 mm) para não deixar a taxa de disparo tipo, mais de 2500 eventos por segundo. Para evitar a contaminação, certifique-se o instrumento foi devidamente limpo utilizando reagentes desinfetante antes de espécie e também usar antibióticos em seu meio de coleta.