寄生虫は鶏のモデルに遺伝的に駆動される自己免疫性シャーガス心臓病を誘発される

Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hecht, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. J. Vis. Exp. (65), e3716, doi:10.3791/3716 (2012).

乳児期および小児期に取得したクルーズトリパノソーマ急性感染症は無症候性に見えますが、慢性感染例の約三分の一が三十年以降にシャーガス病を示しています。自己免疫と寄生虫の永続性は、シャーガス病^1、2の病態を説明する理論を競っています。シャーガス病の原虫の永続性と自己免疫が果たす役割を分離するために、我々はTを接種する受精卵の空気室でクルーズ 。成熟した鶏の免疫システムは Tに対してタイトな生物学的障壁であるクルーズと感染症は、成長³の最初の週の終わりまでに、その免疫システムの開発に根絶されています。雛は孵化時に寄生虫フリーですが、彼らは寄生虫ミトコンドリアのキネトプラストDNA（kDNA）がその子孫に転送され、そのゲノム内に統合されたminicircle保持します。ニワトリゲノムのkDNA minicircle統合のドキュメントは、ターグによって得られたetedプライムTAIL-PCR、サザンハイブリダイゼーション、クローニング、シークエンシング^3、4。 kDNAは、統合をminicircle破裂転写と免疫系因子のオープンリーディングフレームは、ホスファターゼ（GTPアーゼ）、アデニル酸シクラーゼとホスホリラーゼ（PKC、NF-κBの活性化、PI-3K）は、細胞生理学、成長、分化^、3、5に関連付けられている^{- 7、}および他の遺伝子の機能。エフェクター細胞傷害性リンパ球による目標心拍繊維の除去に起因する重篤な心筋炎は、ヒトのシャーガス病に見られるものと類似した炎症性心筋症を示すkDNA変異ニワトリで見られます。特に、心不全および骨格筋の弱点は、1番染色体⁸のジストロフィン遺伝子のkDNAの破裂と大人の鶏に存在しています。同様のgenotipic変化はエフェクターCD45 +、CD8γδ+、CD8αリンパ球によって行わ組織の破壊に関連付けられています。したがって、この原虫感染症は、遺伝的に駆動される自己免疫疾患を誘発することができます。

1。寄生虫の成長

1. T.のトリポマスティゴート形態を育てるクルーズベレニスとβ-ガラクトシダーゼ発現Tulahuen T.マウス筋細胞におけるクルーズ MHOM/CH/00 C4（L6）は5％、10％FSB、100 IU / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、250 nMのL-グルタミン（pH 7.2）でダルベッコ最小必須培地中で培養37 CO _2℃上清培地中のフリースイミングtrypomastigotesは、​​鶏卵に接種するために使用した。
2. 20％FBSを含むDMEM中で成長したブラジル·リーシュマニア（LB）LTB300株式を栽培しています。指数増殖期のLB前鞭毛型リーシュマニアフォームが卵^9を接種するために使用されていました。

2。受精卵鶏卵の寄生虫の接種

1. 100 Tの懸濁液を接種クルーズは、ステージの空気室の上に卵の殻に直径2mmの穴を介して培養液10μlにtrypomastigotesX肥沃な卵。胚細胞への病原性寄生虫の侵入と複製は、ビデオのS1に示されています。対照群は、次のとおりです。）制御鶏と、b）モックコントロールの卵は、培養培地の10μlを受信し、培養液の10μlの100ポンドの前鞭の懸濁液を接種c）はステージX受精卵T.。 cruzi及びLbはキネトプラストファミリーに属する。それぞれ、これらの原虫は、細胞質内または¹⁰宿主細胞のparasitophorous液胞の自由成長する。
2. 粘着テープで穴をシールします。
3. T.をインキュベートクルーズトリパノソーマに感染した卵とモックと感染制御のサンプル37.5℃、21日間の65％の湿度。
4. 3週間32℃で24時間、その後、インキュベーターで孵化雛を保持します。

3。 DNA抽出のための取得のサンプル

1. 末梢血単核細胞は、ニワトリから得られた。）Tから孵化cruziの接種卵、b）管理するステップと、c）の培養液10μlを受信モック、dは）LB接種卵から孵化し、鶏のから白血球細胞は、標準プロトコル¹¹に記載のDNA抽出のために処理されます。
2. 鶏から採取し、不毛の卵母細胞（<5ミリメートル）からT.を接種した卵から孵化した鶏から採取した精液からもDNAを抽出クルーズ 、制御卵^3、4から孵化した鶏から。
3. TからkDNAを抽出します。他の⁹の説明に従って、 クルーズ上鞭毛型のフォームや、また、Lbとの前鞭から、。

4。使用したプライマーとプローブ

PCR増幅と熱条件に対して使用したプライマーを表1に示す。

サザンブロットハイブリダイゼーションに使用されるプローブは次のとおりだった：

1. 野生型minicircle（〜1.4キロバイト）配列をプリTからfied クルーズ上鞭毛型フォーム。
2. 私は、野生型kDNAのダイジェストNSIによって得られた断片（362 bp）をMinicircle。
3. Tcz1 / 2プライマーを用いて寄生虫のDNAの増幅によって得られた核DNA（nDNA）反復配列（188 bp）を。プローブは、1％アガロースゲル³から精製した。
4. のLb前鞭から野生型minicircle（〜0.820キロバイト）シーケンス。

5。 PCR解析

1. 感染雛および非感染のコントロールからのゲノムDNAを標準的なPCR手順を実行し、Tを使ってモッククルーズ nDNA Tcz1 / 2 ¹²とkDNA s35/s36 ¹³プライマー。また、原生動物の特定のLB3とLB5プライマー（ 表1）を使用して、Lb は 、感染、卵から孵化したニワトリからのゲノムDNAでPCRを実行します。
2. 100 ngのテンプレートDNA、プライマー、2 U Taq DNAポリメラーゼ、0.2mMのdNTPを、各ペアの0.4μMおよび1.5 mMのMgClを反応ミックスを作る
3. 68℃72℃/ 1分°C冷蔵前に5分の最後の拡張子が付いた時に95℃で5分、30秒の30サイクル°C/30秒95のサーモプログラム°Cに設定します。
4. _[α-32 P]で標識した特異的なプローブとのハイブリダイゼーションのためのアルカリ法ランダムプライマーラベリングキット（Invitrogen社製を使用してdATPをして正に帯電したナイロンメンブレン（GEライフサイエンス）に転送され1.3％アガロースゲルで増幅産物を分析する、カールスバッド、カリフォルニア州）。

6。ゲノムサザンブロット

1. MBO Iおよび/ ​​またはEco RIで（Invitrogen）を体内組織のDNAサンプルに組み込まminicirclesのシングルカットを作る酵素を使用しています。
2. 感染制御の鶏からと毒性T.を接種した卵から孵化したニワトリからDNAを消化クルーズでは、形成されます。
3. 対象は TからのDNAの消化クルーズと鶏のテストサンプルから、4℃で50 Vで一晩0.8％アガロースゲルで電気泳動に
4. 正に荷電したナイロン膜に分離したDNAバンドを転送します。
5. ラジオラベルkDNAプローブを用いたDNAバンドをハイブリダイズする。
6. 65℃で15分間回膜を洗浄°2X SSCおよび0.1％SDSでC、65倍で15分間°C 0.2×SSCおよび0.1％SDS、および時刻の変数期間のオートラジオグラフの各。

7。首相TAIL-PCR標的

1. 3ウォークイン図1に示すように、PCRをネストされたサイクルで^2を設定し、特定のプライマーとkDNAプライマーを組み合わせて変更されたTAIL-PCR法によりニワトリゲノムに組み込まれminicircle kDNAの増幅を取得します。
2. 主要なサイクル：各反応は、200 ngのテンプレートDNA、2.5mMのMgCl _2、及びkDNAプライマー（S34またはS67）0.4μM、0.2 mMのdNTPsを、2.5 UのTaqプラチナ（Invitrogen社、カールスバッド、Cが含まれていますA）。別に、GGプライマー0.04μM（GG1にGg6、 表1）との組み合わせでkDNAプライマーを使用しています。 57.9から60.1に温度を設定温度kDNAプライマーおよび59.9から65.6°CのCR-1プライマーのC。これらの温度がより高いであることに注意してください（〜45°C）TAIL-PCR ¹⁰で使用される任意の縮重プライマーに必要です。前報³に記載された温度とサイクル（MyCycleサーモ、バイオ·ラッドラボラトリーズ、ヘラクレス、CA）を使用します。
3. 二次サイクル：水の主要なサイクル1時40分（V / V）からのPCR産物を希釈します。 kDNAプライマーS35とS35センスは同じGGのプライマーと一緒に、以前のものに置き換えられました。
4. 第三紀のサイクル：水の二次サイクル1:10（v / v）のからのPCR産物を希釈し、別々に、S67のアンチセンスまたはS36でGGのプライマーを組み合わせたものです。
5. クローン直接pGEM T easyベクター（プロメガ、マディソン、WI）において：PCR第三サイクル製品のクローンを作成するkDNAプローブとハイブリダイズ最後の増幅の産物。
6. kDNAプローブと配列とのハイブリダイゼーションによりクローンを選択します。
7. T.からkDNAの300 pgのミックスtpTAIL-PCRを検証するkDNAにさらされることはありませんコントロールの鳥からのDNA 200 ngのクルーズ 。温度と増幅サイクルは、テスト鳥のDNAのために使用されているのと同じです。

8。シャーガス病クリニックの現れ

1. Tから孵化したニワトリの成長と発展を監視するクルーズでは、卵を感染と健常者の死亡や病気の症状のために毎週、毎日、非感染卵から孵化した。
2. それらの鶏の臨床的異常（ 図2）を検出し、電気軸、心拍数と不整脈^3を評価するために心電図（ECG）記録を行います。
3. 対象kDNA変異と拡張心室国連のECG記録に毎月の鶏を制御ipolarはAVF（左脚）、AVL（左腕）、およびAVR（右腕）を導き、心肥大³の示唆にある、左に平均電気軸のずれを評価する。

9。病理学と免疫化学的解析

1. kDNA変異鶏の自然死した後、レコード心と体重インデックス（ 図3）。同じ年齢、性別の制御鶏にもインデックスを取得します。
2. 心臓、食道、腸、骨格筋、肺、肝臓、腎臓からセクションを取る。
3. の組織が ​​パラフィンに埋め込 ​​む、（pH7.4）を10％緩衝ホルマリン、4μmのヘマトキシリン-エオシン（HE）染色および組織学的分析（ 図3）の厚さの切片にカットを修正しました。
4. β-ガラクトシダーゼを発現する原虫を接種した卵とX-Gal-染色の対象から孵化した胚からの収穫とbisectが組織^9。
5. 1で胚組織の残りの半分を修正しました。ホルマリン0％、pH7.4で、ステップ9.3の手順に従ってください。
6. 4μm薄いパラフィン包埋組織切片を切り取り、顕微鏡検査のためのガラススライド上にマウントします。
7. 抗T.に対するヒトchagasic抗血清（1:1024希釈）でのX-Gal染色青色のセルを示す切片をインキュベートしクルーズ抗原 。
8. セクションのPBS、pH7.4の瞬間、5分ごとに洗浄します。
9. フルオレセイン標識ウサギ抗ヒトIgGを有する第2のインキュベーションによって胚組織に青色細胞を染色。
10. カバースリップを、PBS（ステップ8）を使ってマウントしセクションを洗い、Tを共局在のために502 nmの波長、200倍、少なくともUV光の下で審査時に緑色のライトアップ青色の細胞を観察する胚細胞でのクルーズ 。

10。心臓障害の表現型免疫系細胞

1. kDNA陽性から陰性コントロールkDNA鶏の心臓の組織切片における表現型免疫エフェクター細胞である。
2. でスライドを配置する5分ごとに100％〜70％キシレンにして、無水エタノール、PBSで4回洗浄の提出前にワックスを溶かすために30分間65℃でパラフィン包埋組織のセクションを参照してください。
3. 蒸留水、空気乾燥でスライドをすすぎ、そしてSouthernBiotech、バーミンガム、アラバマ州から得られた特異的なモノクローナル抗体（フルオレセインまたはR-フィコエリスリン標識モノクローナル抗体）で扱います。
   1. 抗ニワトリは富栄-1（BU-1およびBu-1 _bのアレル氏70から75 kDa）をしたMab AV20近交系ニワトリのB細胞抗原に単相行列を認識するマウスを使用しています。
   2. 抗ニワトリCD45、マウスを使用してIgアイソタイプIgM1κ鶏胸腺系統細胞（氏の190 215-kDaのバリアント）に固有の。
   3. マウスを使用して、抗ニワトリTCRγδ+（氏は90-kDaのヘテロ二量体）のMab胸腺依存CD8α+ T細胞に特異的。
   4. 抗ニワトリのMab鶏α鎖（34 kDaの氏）へのCD-8固有の番を認識するマウスを使用して胸腺、脾臓、心臓、および他の組織内の電子CD8細胞。
   5. 排他的に食細胞系の単球/マクロファージを認識するマウス抗ニワトリKuL01を使用しています。
4. 5分ごとに湿ったチャンバー内で90分間、特定の抗表現型抗体とインキュベートした後、0.1 M PBS、pH7.4でスライドを3回洗浄します。
5. 赤と緑の蛍光標識された細胞（ 図4）を検出するために、それぞれ、発光波長567のフィルターと502 nmの蛍光灯顕微鏡下で試験するための緩衝グリセリンとスライドを組み立てます。

11。データ解析

1. ニワトリゲノムデータベース（使用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031を BLASTN系列分析のため）。
2. E値のスコアを決定するためにClustalWのアライメントを使用しています。
3. GIを採用RIリピートマスキングアルゴリズムは、（検閲http://girinst.org/censor/index.phpキメラ配列内の反復配列の異なるクラスのローカライズのため）。
4. WU-BLASTNで修飾されたマトリックス³の助けを借りて、kDNA配列において潜在的なgRNAsを識別するために、キネトプラスト挿入および削除シーケンスの検索ツール（KISS）を採用しています。
5. T.を使用して、クルーズシーケンス http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164から8-133-s1.fas kDNAホストのDNAキメラのgRNAs-で検索する。 11.6）をそれぞれ使用するスチューデントのtとKolmorovスミルノフテストを、電気軸の偏差の間に、実験群と対照群で得られた心臓/体重インデックスの間に有意差を検出すると、死亡率の孵化鶏の群間に有意差を検出するためにTからcruziの私noculated卵とコントロールから。

12。代表的な結果

100病原性Tの接種肥沃な鶏の卵の空気室にクルーズの trypomastigotesが大幅に生きている孵化した雛の比率を減らすことはありません。約60％のハッチ健康なヒナと40％が孵化時に胚の液化または胚死を受ける可能性があります。生き残った雛は、ゲノムに組み込まれkDNAのminicircleシーケンスを保持します。しかし、いくつかの雛が孵化後数週間で心臓肥大と失敗して死ぬことが期待されている。残りの雛は、外側に健康な成人に成長します。人生のすべての段階で、その血単核細胞から抽出したDNAは、PCR kDNAの増幅ではなく、nDNAが得られます。ターゲットを絞ったサブプライムTAIL-PCR ^3、4、クローン化されている製品とシーケンスがkDNAが5にmacrochromosomes 1のコーディング領域を中心に統合されたminicircles表示されます。複数kDNA iを示す鶏細胞の増殖と分化、免疫系の調節因子、DNA修復をコードする遺伝子にntegrationsは、自己の標的組織（ 図3）の拒絶を受けるための候補である。たとえば、細胞膜に細胞骨格を結合するタンパク質をコードする、ジストロフィン遺伝子（ 図5）の破裂でkDNAの変異を示す鶏は、自己免疫炎症性心筋症や障害を開発するための候補である。

これらのゲノムの変更は、Lbは 、感染した卵から孵化した雛で見ていません。 T.の間に違いがあります。 クルーズと Lb kDNA minicircles、T.クルーズ K DNAは CA-豊富な曲がったDNAは、複製、転写開始のための特定のサイトと見なされている保存された各CSB1を提示する領域（CR）、CSB2、とCSB3地域が点在する4つの可変領域（VR）と平均1.4kbの構造をminicircle組換え、および横方向のDNAの転送のために、Lbは kDNA minicircle（平均サイズは820 bp）をVRに続く単一のCRが含まれています。 CRはCSB1（GGGCGT） と Tのものと異なるCSB2（CCCCGTTC）ブロックを、保存されているクルーズ minicircles ^{15、16、17。} Lbは CSB3は（GGGGTTGGTGTA）Tに12 NTS相同性を示すことを考慮するとクルーズのいずれかLbが kDNA minicircleが使用されるテクニックによって表示されない場合がありますか、それは、多分、まったくニワトリゲノムに統合することはできませんことが多く、低周波で統合されていると考えています。

表1。素数は、PCR増幅に使用されます。 * Tm値=平均アニーリング温度℃、

図1。TP TAIL-PCRの戦略は、 セキショクヤケイのゲノムにトリパノソーマ kDNA統合を検出するために使用される。 A）kDNAのフラグメントとのキメラ配列が保存さminicircle（ダークブルー）とチキン¹⁰ゲノム（緑）の4番染色体（AY237306）で座NW_001471687.1に統合された変数（ライトブルー）の地域のホストを取得するために使用した特異的プライマーセット（GG1にGg6）。 B）TP TAIL-PCR増幅は鶏特有のGG1にGg6プライマーとの組み合わせでminicircle特有のS34またはS67のプライマーのアニーリングによる（一次サイクル）を開始しました。希薄化後の製品は、S35（センス/アンチセンス）プライマーとGGのプライマーの組み合わせで二次サイクルのテンプレートを提供した。第三サイクルでは、二次製品の希釈は、GGのプライマーとの組み合わせでkDNA S36またはS67のアンチセンスプライマーを用いて増幅を行っただ。 C）これらの増幅産物を1％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜に転写し、特定のkDNAプローブとハイブリダイズさせた。肯定的な信号を示すサンプルは、統合のポイントを決定するためのクローニングのために使用された。 kDNAとGg6にGG1をターゲットの組み合わせは、ゲルの上に表示されます。シーケンシャルPCR反応はkDNA minicircles（青）と鳥類のシーケンス（緑）を使用してターゲットkDNAホストのDNA配列を増幅した。 （ 熱帯病 ³ 放置PLoSのより転載）。

図2：遺伝子組換えT.からミトコンドリアkDNA minicircleの統合によって変更された9ヶ月の鶏における障害心機能の臨床症状クルーズ 。コントロール9ヶ月歳chickeの鮮やかな赤い櫛と櫛紫のコントラストを示すミトコンドリアkDNA変異鶏の貧しい人々の血液の酸素化nは心臓の損傷から無料。 （ 熱帯病 ³ 放置PLoSのから変更された）。

図3。kDNA変異を有するセキショクヤケイの病理肉眼的及び顕微鏡。 A）心肥大、心不全で死亡した9ヶ月歳編インチB）非感染9ヶ月の鶏から心臓を制御します。 C）細胞傷害性リンパ球による標的の心臓細胞の除去：免疫リンパ球による標的細胞の溶解すると最小限の除去単位（円）描かれています。 D）コントロール心臓組織（ 熱帯病 ³ 放置PLoSのから変更された）。

図4図3に示すようにkDNA変異鶏の心臓部を浸潤免疫系細胞の免疫細胞化学的解析。心臓ルで識別される）CD45 +リンパ球（矢印）フィコエリスリンで標識した特異的モノクローナル抗体によるsions。 B）CD8 +心臓の深刻な破壊に関与するγδ免疫リンパ球（矢印）。 C）豊富なCD8α+ T細胞は、心臓の細胞溶解すると重篤な病変に存在する。インサートはコントロール感染ニワトリの心臓における免疫系細胞（ 熱帯病 ³ 放置PLoSのから変更された）の不在を示しています。

図5。ジストロフィン遺伝子のkDNAを統合したF2子孫で拡張型心筋炎症性心筋症シャーガス病のような。胸腔（心臓重量= 16グラム）の大半を占める10カ月齢の鶏のA）拡張型心筋症心臓。 B）ダーク円形単核細胞の浸潤とkDNA変異鶏の心筋を破壊します。 10ヶ月歳の制御鶏のC）正常な心臓の大きさ（重さ7グラム）。 D）制御ニワトリの心臓の正常組織には。 （PLoSの顧みられない熱帯から変更されたアル症^3）。

図6。kDNA変異ニワトリとヒトのシャーガス病の比較病理学。 kDNA変異鶏のA）重症心筋炎とターゲットの心臓細胞の溶解する。シャーガス心臓病の場合、免疫リンパ球によるB）重症心筋炎と標的細胞の溶解する。 kDNA変異鶏の免疫リンパ球による心筋細胞のC）除去。ヒトのシャーガス病の免疫リンパ球による心筋細胞のD）除去。ヘマトキシリン​​とエオシンで染色した。 （Memóriasから変更されたかセルバンテスオズワルド·クルス 、リオデジャネイロ^14）。

生涯T.への影響を受けやすい哺乳類とは対照的に、 cruziの感染症は 、鶏がTに難治性であるクルーズトリパノソーマ感染 。鶏のモデルシステムの主な利点は、胎児の免疫系の開発において、初期感染の除去です。したがって、鶏の本体内に残っている唯一の寄生虫のDNAは、いくつかの遺伝子座で統合されています。

病原性Tの最適な量の使用クルーズは、肥沃な卵に接種しtrypomastigotesニワトリ胚のゲノムにkDNAのminicirclesの統合を取得に向けた重要なステップです。 100 trypomastigotesを接種した卵からのライブ雛の​​孵化率は500寄生虫で得られたものよりも4倍高くなっています。注意は卵の空気室に培養液の10μLに寄生虫懸濁液を接種するために注意する必要があります。卵白の漏れがあってはなりません。最適な条件下で、細胞内寄生虫感染が行わwiを取るその後感染が自然免疫によって排除されています。数時間一週間のための宿主細胞に進み内部インキュベーションと寄生虫乗算した後、薄い。 kDNAの統合は、生きている感染症を必要とし、初期胚の鶏の卵に裸minicirclesの接種は、統合にはなりません。 kDNA陽性胚およびコントロールは、37.5°Cと65％の湿度で制御された条件下で飼育する必要があります。雛は33℃の室温で2週間のケージに保管されています。その後、鶏が22℃の部屋で1.5メートル幅の通路で区切られた懸濁ラックにケージに保管され℃で濾過空気と動物福祉の条件を確保するために一定の疲労下の正圧である。大人の鶏焼きそば供給され、生後5ヶ月で卵を産む、完全な成長と成熟を達成するために飲用水道水を飲んでています。 T.を扱う際の衛生手順のメンテナンスは、結果の再現性に不可欠であるクルーズでは、接種肥沃な鶏の卵に。

T.鶏のモデルシステムのcruziの感染症は 、胚の成長の早い時期の免疫システムの開発の後に根絶されています。さらに、感染フリー、T.から孵化雛であることにクルーズでは、寄生虫抗原に対する寛容である、特定の抗体の欠如に、卵を接種した。細胞傷害性リンパ球（最小限の除去装置は、 図3）によって目標心拍細胞の拒絶反応は、免疫学的監視の³遺伝子型の変更や故障を示すkDNA変異ニワトリで見られます。遺伝子型変更されたT細胞は、体内で自己組織の拒絶反応の加速を示す。主な病変部位では、シャーガス病の特徴である心です。 （サーベイランス）生理学からphysiopathologic状態への通路は、細胞傷害性リンパ球³のクローン増殖を示すkDNA変異ニワトリで見られます。

T彼transkingdomモデルシステムは、T.によるゲノムの修飾に起因する、寄生虫誘発性、遺伝的に主導型自己免疫疾患（ 図6）を示します。 クルーズ kDNAは、統合をminicircle。これらの変更は、LB-接種卵から孵化した雛で見ていません。

この現象は自己組織の拒絶反応を防ぐために薬物の心筋に浸潤特異的T細胞の表現型の骨髄前駆細胞の抑制、組織適合性健康な骨髄の移植が必要な場合がありますkDNA変異鶏の炎症性自己免疫性心筋症の実験的治療法を示唆している。

利害の衝突が宣言されません。

我々はナンシーR.シュトゥルム、免疫学、微生物学および分子生物学科、原稿読み取りのために重要な医学部のデビッドゲフィン学校、カリフォルニア大学ロサンゼルス校、世話になっています。研究·CNPqの全国協議会、および研究開発 - FAPDF、ブラジル、財団は、研究をサポートしていました。我々は、ブラジリア、ブラジルの大学から、アレッサンドロO.ソウザ、マリアC. Guimaro、シロコルデイロ、アナ·デ·カシアローザ、Roseneide·アウベス、ラファエル·アンドラーデの技術的な援助に感謝します。

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