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 JoVE Clinical and Translational Medicine

질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

1, 1, 1, 2, 1

1Texas Therapeutics Institute, University of Texas Health Science Center at Houston, 2Deptartment of Pediatrics, Baylor College of Medicine

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Cite this Article: 질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

Jiang, H., Parthasarathy, D., Torregrossa, A. C., Mian, A., Bryan, N. S. Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity. J. Vis. Exp. (64), e3722, doi:10.3791/3722 (2012).

Abstract: 질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

질소 산화물은 (NO) 생물 학적 시스템 (혈액 순환에 이하 일초) 1로 극히 짧은 살고있다 이원 자유 라디칼이다. 아니오는 포함한 필수 기능을 조절, 우리의 신체에서 생산되는 가장 중요한 신호 분자 중 하나를 고려 없지만 혈압, 면역 반응 및 신경 통신 규제에 국한되지 수 있습니다. 따라서 생물 학적 매트릭스에서의 정확한 탐지 및 부량는 건강과 질병에서 NO의 역할을 이해하기 위해 중요합니다. NO 이러한 짧은 생리적 반 생활을 통해 어떠한 생화학의 반응 제품의 탐지를위한 대안 전략이 개발되었습니다. 여러 생물 학적 구획의 관련 없음의 metabolites의 양을 정함은 생체내에에 관해서는 어떠한 생산, 생체 이용률과 신진 대사에 중요한 정보를 제공합니다. 간단히 같은 혈액이나 혈장과 같은 하나의 구획을 샘플링하는 것은 전체 보의 정확한 평가를 제공하지 않을 수 있습니다특히 조직에서 어떠한 자격을 마구 없습니다. 실험 동물의 선택 조직으로 혈액을 비교하는 기능까지 건강과 질병의 어떠한 생체 진단 및 전조 유틸리티 등 기초 과학 및 임상 의학 간의 격차를 해소하는 데 도움이됩니다. 따라서 관심의 특정 조직에 혈장 또는 혈액 어떠한 상태의 추정은 더 이상 유효한 접근하지 않습니다. 그 결과, 방법 개발 및 생체내의 실험 동물의 여러 구획의 NO 및 NO-관련 제품 / metabolites의 탐지 및 부량을 허용하는 검증받을 것을 계속한다. 과 질산염 (NO 3 -) - 아질산 (NO 2) 최종 산화에 대한 수용성 guanylyl cyclase (SGC)의 활성화에 어떠한 synthases에 의해 생산에서 어떠한 생화학의 설립 패러다임은 생체내에서 NO의 효과의 일부분에 해당됩니다. S-nitrosothi을 형성하는 단백질 thiols, 차 아민 및 금속과 NO 및 NO-파생 metabolites의 상호 작용ols (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs) 및 nitrosyl-헴는 각각 NO의 cGMP 독립적인 효과를 나타내며 어떠한 의한 SGC의 활성화로 생리학 가능성만큼이나 중요하다. 생리학에서 NO의 진정한 이해는 동시에 여러 구획을 샘플링 생체내 실험에서에서 파생됩니다. 질소 산화물 (NO) 방법론은 어떠한 생화학에 대해서도 많은 논쟁과 토론의 복잡하고 종종 혼란 과학 및 초점이다. 우리의 능력을 구체적에 대한 어떠한 경첩과 관련된없는 새로운 메커니즘 및 신호 전달 경로의 해설은 선택과 sensitively 눈치채지 못한 어떠한와 관련된 모든 복잡한 생물 학적 매트릭스의 어떠한 제품과 metabolites을 수량. 여기서는 HPLC에 의한 아질산염과 질산염의 신속하고 민감한 분석 방법뿐만 아니라 NO의 분자 소스뿐만 아니라 전 생체내과를 결정하는 화학 derivitazation와 체외의 오존 기반 chemiluminescence에서 사용하는 생물 학적 시료의 여유 없음의 검출을 제시장기 목욕 myography.

Protocol: 질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

1. 전체 혈액 수집

  1. 인간이나 NEM / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)가 들어있는 튜브에 실험 동물의 정맥 혈액을 수집합니다.
  2. 즉시 7분 대한 rcf는 (상대 원심력) 혈장 및 적혈구 세포 펠렛을 준비하는 14,300에서 benchtop 원심에 혈액을 다운 스핀.
  3. 고성능 액체 크로마 토그래피 (HPLC)와 chemiluminescence 검출 (CLD) 분석을 위해 플라즈마 샘플을 준비합니다.
    HPLC : 플라즈마, 석출물 플라즈마 단백질까지 10 분간 13,200 rpm으로 소용돌이와 원심 분리기에서 차가운 메탄올의 1시 1분 볼륨을 추가합니다. HPLC 분석을위한 뜨는 수집합니다.
    CLD : 나누어지는 구체적으로 분석 nitrosothiols에 sulfanilamide 및 mercuric 염화와 샘플 및 preinc​​ubate.
  4. HPLC 및 CLD 분석에 붉은 세포 펠렛을 준비합니다.
    HPLC : 10 밀리미터 NEM, 2.5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 ferricyanide 10 밀리미터를 포함 hypotonic 용해 용액에 추가 1시 4분 붉은 세포 펠릿. 와동은 철저하고 1시 1분 메탄올, 와동과 centrif 추가침전물 단백질까지 10 분 동안 13,200 rpm으로 uge. HPLC 분석을위한 뜨는 수집합니다.
    CLD. 10 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2.5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 Ferricyanide 10 밀리미터를 포함 hypotonic 용해 용액에 1시 4분 붉은 세포 펠렛을 추가합니다. 나누어지는 샘플 nitrosothiols의 특정 검색에 대해 sulfanilamide 및 mercuric 염화물을 포함 튜브합니다.

2. 조직 추출 및 준비

  1. NO metabolites의 조직 수준을 결정하기 위해서는 위에서 설명한 시료 준비를 위해 혈액을 무료로 조직을 수확 먼저 필요합니다. 전체 혈액의 교환은 좌심실의 꼭대기를 통해 생리 버퍼가 기적으로 열립니다. 모든 혈액이 제거되면 관심 휴지 그런 다음 수확 할 수 있습니다.
  2. 조직 샘플을 Homogenize 및 HPLC 및 CLD 분석을 위해 위에서 설명한 샘플을 준비합니다.

3. 내피 기능에 대한 대동맥 반지 격리

조직 장기 목욕

  1. 마우스가 anest 될 것입니다이상 반응 핀치를 상대하고, 이전 수술로 자궁 전위를 받아야 할 때까지 디에틸 에테르로 hetized. thoracotomy는 흉부 및 복부 대동맥을 폭로하기 위해 수행됩니다. 25 게이지 주사기는 좌심실의 꼭대기에 삽입 및 산소 Krebs Henseleit 버퍼와 혈액의 무료 perfused있다.
  2. 오른쪽 심방은 혈액을위한 출구를 제공하기 위해 절단됩니다. 복부 대동맥이 제거되고 adventitia으로 지워지게됩니다.
  3. 반지는 2mm 길이 세그먼트로 잘라 생리적 완충 용액으로 목욕 4 채널 조직 장기 목욕 (DMT 720MO, 광고 인 스트 루먼트)에 장착됩니다.
  4. 선박 고리는 37 ° C.에 산소 Krebs 버퍼 (95% O 2 5 % CO 2)와 함께 10-ML 장기 욕조에 보관됩니다 한 g의 요구는 각 대동맥 고리 (이전 실험에서 결정된 최적 vasomotor 기능에 적합한 시작 장력)에 위치합니다. 여덟 채널 진수 브리지 (Powerlab) 및 데이터 수집 소프트웨어 (차트 버전 5.2.2)모든 힘을 측정을 기록하는 데 사용 기쁩니다.
  5. 반지는 각 장기의 욕조에서 버퍼와 80분마다 20 분 동안 평형을 변경할 수있게됩니다. 80 분 대한 평형 후, 1 μm의 제품 phenylephrine은 submaximal 수축 각 고리에 추가됩니다.
  6. 안정화되면, 이러한 아세틸콜린과 같은 내피 작용제는 선박 휴식 어떠한 생산과 노출된 정도를 확인하지에 추가됩니다. 아세틸콜린에 대한 선량 반응 후, 목욕탕은 질소 산화물, 평활근의 반응을 파악하고 100 %의 휴식을위한 가치를 얻을 나트륨 nitroprusside의 외인성 소스로 씻어서 recontracted 후 처리됩니다.
  7. 어떠한 썩은 고기를 명확하게 선박 휴식 NO 및 억제의 석방을 설명하기 위해 욕조에 추가할 수 없습니다.

4. 대표 결과

이노-20 전용 HPLC의 이용은의 아질산염과 질산염의 구체적이고 민감한 검출을 위해 높은 처리량 방법을 사용하기 쉽게 제공합니다생물 학적 매트릭스. 감지 및 원래의 크로마토 그램의 원리는 그림 1에 표시됩니다. 이 방법은 아질산염과 질산염을 결정하는 생물 학적 샘플을 사용할 수 있습니다. NO metabolites의 CLD 기반 감지 NO의 분자 소스를 결정하는 화학 derivitization 단계가 필요합니다. chemiluminescence 검출기를위한 동시 산화 denitrosation 및 reductive denitrosation위한 실험 설정은 그림 2에 표시됩니다. 오른쪽의 반응 용기는 PBS 산도 7.4의 800mM ferricyanide으로 가득차 있으며, 왼쪽에있는 반응 용기는 감소 denitrosation위한 초산 (그림 2A)에 칼륨 요오드화물 / 요오드 혼합으로 가득합니다. 전체 설정은 그림 2B에 표시됩니다. 그림 3은 그룹의 특정 denitrosation의 아질산을 감지하고 계량 수 assays, nitrosothiols, nitrosamines뿐만 아니라 nitrosyl 헴 제품을 보여줍니다. 이 방법은 이전에 descri되었습니다침대 4,5 검증. 이러한 중요한 생화 학적 분석은 쉽게 내피 실험 동물에있어서 어떠한 생산을 결정하지 위해 절연 대동맥 고리에 대한 기능적 연구와 상호하실 수 있습니다. 이것은 고전 pharmacological 실험은 쉽고 정확하게 내피 기능과 생산 아니오를 평가할 수 없습니다. 이러한 아세틸콜린과 같은 내피 agonists에 선박 반응을 측정하는 것은 바로 다음 실험 동물의 혈액과 조직에서 발견 생화학 생체와 상호하실 수 있습니다 내피 어떠한 생산을 결정할 수 없습니다. 아세틸콜린에 대한 선량 반응의 전형적인 표현은 그림 4에 표시됩니다. 정상적인 내피 기능과 건강한 컨트롤 마우스는 휴식에 의해 아세틸콜린에 반응한다. 내피 기능 장애와 쥐 (hypercholesterolemic 생쥐)는 동일한 자극에 어떠한 생산을 줄일 수 없다 때문에 감소 휴식을 보여줍니다.

그림 1
무화과우레 1. 이노-20 및 샘플 크로마토 그램에 의한 아질산염과 질산염의 검출 원리. 아질산염과 질산염에 대한 검색의 이노-20 방식의 (위) 도식. (아래) 10 pmol의 아질산염과 질산염의 표준 chromotogram는 이노-20 (아질산염과 질산염 100 nm의 솔루션을 100 μl)에 주입. 100 μl 주입 부피 각 음이온 1 NM의 감도. 단백질이나 색 종 아무도 간섭 없습니다.

그림 2
정화 질소 산화물 가스의 기상 탐지와 요오드화물 / 요오드 검정을 사용 ferricyanide하고 reductive denitrosation에 의해 모두 산화 denitrosation를 사용하여 그림 2. CLD 실험 설정.

그림 3
그림 3. (패널) 그룹의 특정 chemic있는 샘플 preincubation 의해 reductive denitrosation 분석에서 아질산염의 Chemiluminescence 감지, RSNO, RNNO알 시약. 피크 영역의 뺄셈은 아질산염과 RSNOs의 검출을 허용합니다. ferricyanide의 산화 denitrosation 솔루션을 사용하여 nitrosyl 헴 종의 (패널 B) Chemiluminescent 탐지. 이 방법은 RSNOs (GSNO 또는 SNO-알부민) 또는 RNNO (NO-pyrrolidine와 N-nitroso-알부민)과 노 교차 반응으로 NO-헴 제품에만 적용됩니다.

그림 4
그림 4. 절연 대동맥 고리에서 전의 생체내 기관 목욕 후 HPLC 및 CLD에 의해 감지 생화학 생체와 상호하실 수 있습니다 내피 NO 생산의 직접적인 측정을 제공합니다. 이 수치는 더 이상 생산 감소하지 인해하도록 내피 기능 장애와 생쥐의 감소 휴식을 보여줍니다.

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Discussion: 질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

방법은 여러 생물 학적 구획의 관련 없음의 metabolites의 부량 위해 여기에서 설명한 내피에 의한 NO의 기능 측정과 상호 수있는 건강과 질병의 어떠한 생물의 지문 채취를 허용합니다. 이러한 방법은 높은 처리량을 위해 적응을위한 잠재력을 지닌 간단한 샘플 준비가 필요합니다. 이러한 분자의 상대적인 수량은 질환의 실험적 모델과 인간의 환자에서조차 직렬 샘플 수가 NO의 생산과 신진 대사 운명을 이해하는 데 도움이됩니다. 인위적으로 시료 준비하는 동안 이러한 제품의 일부를 생산 어떠한 기반 생체 많은 분석 방법을 감지하지에 많은 함정이 있습니다. 생물 학적 샘플에서 아질산염에주의 회계 인해 시스테인 thiols 6 nitrosothiols 7 artifactual 형성과의 반응에 중요합니다. 무산소 조건에서 아질산의 특정 검출을위한 CLD 기반 방법론은의로 연결다른 생물 학적 구획 8 특정 아질산 환원 효소 효소의 활동으로 인해 일관성있는 결과입니다. 여기에서 설명한 방법을 모두 잘 문서화 및 확인과 유물 9 제거하거나 줄이기 위해 고려 단계를 고려하고 있습니다. 우리는 유물을 방지하기 위해 필요한 핵심 단계를 설명합니다. NO metabolites의이 다중 구획 검사는 인간에 진단 또는 전조 유틸리티가있을 수 후 병원이나 표준 실험실 분석을 위해 사용할 수있는 표준 방법의 개발 있도록 관련 생체 식별에 도움이 될 것입니다. 질산과 아질산염은 질산염 10,11의 enterosalivary 순환에 의해 아니오로 축소되지 의하여 인간의 질소 순환의 최근 인식은 이제 특정 질병의 어떠한 상태에 대한 잠재적인 biomarker로 타액을 사용하는 잠재력을 최대 열립니다. 어떠한 상황과 데이트도하는 것은 환자에서 진단 목적으로 일상적으로 사용되는 표준 혈액 화학의 일부가 아닙니다. 일NO 많은 질병 과정의 중요한 자연이 준 충격 적이네요있다. 궁극적으로, 쉬운 작품이 어떠한 관련 생체 결정 수준을 사용하고 충분한 검증 후에 아마도 급속한 침대 쪽이 포인트의 케어 assays는 분자 의학에서의 역할에 대한 진정한 예의가 될 것입니다. 그것은 인간의 검증을위한 동물 모델에서 어떠한 상태를 결정하지 위해 표준 및 정확한 분석을 검증하고 개발 분야의 집중과 통합 노력이 시점에서 조심스러운 것입니다. 이 프로토콜에 설명된 방법은 다른 사람들이 신속하게 이러한 측정을위한 합의 방식을 채택할 수 있습니다.

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Disclosures: 질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Acknowledgements: 질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

저자 홍 지앙 박사에게 감사를 표합니다 그리고 Deepa Parathasarthy, 시속, 기술 지원 BDS.

Materials: 질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

Name Company Catalog Number Comments
N-ethylmaleimide Thermo Fisher Scientific, Inc. 23030
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Potassium Ferricyanide Fluka 60299
HPLC Eicom Corp ENO-20
Autosampler Alcott
DMT Myograph ADInstruments
PowerLab ADInstruments
Chemiluminescent EcoPhysics CLD 88Y
Centrifuge Eppendorf 5415D
Acetylcholine Sigma-Aldrich A6625
R-(-) Phenylephrine Sigma-Aldrich P6126

References: 질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

  1. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).
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  9. Bryan, N.S. & Grisham, M.B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic. Biol. Med. 43 (5), 645-57 (2007).
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