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 JoVE Immunology and Infection

फफूंद की औपनिवेशीकरण, रेणूजनक और mycotoxins का उत्पादन की मात्रा कर्नेल bioassays का उपयोग

*, *, , ,

Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University

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Cite this Article: फफूंद की औपनिवेशीकरण, रेणूजनक और mycotoxins का उत्पादन की मात्रा कर्नेल bioassays का उपयोग

Christensen, S., Borrego, E., Shim, W. B., Isakeit, T., Kolomiets, M. Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays. J. Vis. Exp. (62), e3727, doi:10.3791/3727 (2012).

Abstract: फफूंद की औपनिवेशीकरण, रेणूजनक और mycotoxins का उत्पादन की मात्रा कर्नेल bioassays का उपयोग

अनाज के सड़ बीज संक्रमण कवक दुनिया भर में अनाज उत्पादन के लिए सबसे बड़ा आर्थिक चुनौतियों में से एक बन गया है, मानव और पशुओं के स्वास्थ्य के लिए गंभीर जोखिम का उल्लेख नहीं है. अनाज उत्पादन के अलावा, मक्का यकीनन सबसे अधिक प्रभावित फसल, अनाज अखंडता और mycotoxin के बीज संदूषण में रोगज़नक़ प्रेरित नुकसान के लिए कारण. मक्का उत्पादकों और खाद्य और फ़ीड प्रोसेसर के लिए दो सबसे अधिक प्रचलित और समस्याग्रस्त mycotoxins aflatoxin और fumonisin, Aspergillus flavus और Fusarium verticillioides द्वारा उत्पादित, क्रमशः रहे हैं.

आणविक संयंत्र रोगज़नक़ बातचीत में हाल ही के अध्ययन विशिष्ट कवक संक्रमण और mycotoxin के 1,2,3,4,5,6 संदूषण के लिए संयंत्र प्रतिक्रियाओं के साथ जुड़े तंत्र को समझने में वादा दिखा दिया है. क्योंकि कई प्रयोगशालाओं कर्नेल assays के अध्ययन करने के लिए संयंत्र रोगज़नक़ बातचीत का उपयोग कर रहे हैं, वहाँ अलग अलग जैविक मापदंडों को बढ़ाता के लिए एक मानकीकृत पद्धति के लिए एक की जरूरत है तो है,विभिन्न प्रयोगशालाओं से परिणाम पार से विश्लेषित किया जा सकता है. बीज पर मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य साधन के लिए, हम प्रयोगशाला में गिरी assays और बाद के तरीकों को विकसित किया है कवक विकास, बायोमास, और mycotoxin संदूषण यों. चार निष्फल मक्का गुठली कांच की शीशियों में एक कवक निलंबन (6 10) के साथ inoculated हैं और एक पूर्व निर्धारित अवधि के लिए incubated रहे. नमूना शीशियों तो hemocytometer, ergosterol आधारित बायोमास विश्लेषण द्वारा रहे हैं conidia की गणना के लिए उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC), aflatoxin मात्रा का ठहराव एक AflaTest fluorometer विधि का उपयोग, और HPLC द्वारा fumonisin मात्रा का ठहराव के द्वारा चयनित.

Protocol: फफूंद की औपनिवेशीकरण, रेणूजनक और mycotoxins का उत्पादन की मात्रा कर्नेल bioassays का उपयोग

1. मक्का कर्नेल bioassay

  1. पहले दो सप्ताह पहले, संस्कृति 28 में आलू Dextrose अग्रवाल (पीडीए) पर कवक रोगज़नक़ों डिग्री सेल्सियस
  2. समान आकार और आकार के साथ गुठली का चयन करें, अधिमानतः चपटा ताकि वे bioassay शीशियों के नीचे के साथ स्तर है, और 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूबों में जगह रखना. एक ही वातावरण में किया गया चयनित गुठली चाहिए समवर्ती उत्पादन के लिए समान बीज उम्र और metabolite रचना सुनिश्चित.
  3. ट्यूब 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 6% सोडियम hypochlorite के साथ मिलाते हुए 70% इथेनॉल, बाँझ पानी के साथ 1 मिनट और 10 मिनट के साथ गुठली बाँझ सतह. , तीन बार कुल्ला, 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए, जबकि बाँझ पानी के साथ जारी रखने मिलाते हुए. पैट autoclaved तौलिए पर सूखे गुठली है.
  4. Aspergillus flavus के संक्रमण की सुविधा के लिए, एक 18 जी 0.5 सेमी की गहराई में सुई के साथ भ्रूण तरफ एक छोटा सा घाव बना सकते हैं. हालांकि, हमारे अनुभव में एक बड़ा घाव Fusarium verticillioides संक्रमण के लिए की जरूरत है. गुerefore, एक रेजर ब्लेड का उपयोग करने के लिए 0.5 मिमी की गहराई में भ्रूण के पक्ष में कटौती.
  5. Autoclaved 0.01% बीच 20 spores को आजाद कराने के लिए और कम से कम 4 autoclaved जाली की परतों के माध्यम से फ़िल्टरिंग गुरुत्वाकर्षण द्वारा फुई हटाने समाधान के बारे में 5 मिलीलीटर में सुसंस्कृत प्लेटें scraping द्वारा inoculum निलंबन तैयार करते हैं. Hemocytometer साथ बीजाणु एकाग्रता की गणना और 10 6 spores / ए के लिए मिलीग्राम के लिए समायोजित flavus या एफ verticillioides. रोगज़नक़ या मेजबान की अन्य प्रजातियों का उपयोग अगर, यह महत्वपूर्ण है के लिए उपयुक्त संक्रमण के लिए inoculum की सांद्रता का मूल्यांकन.
  6. एक प्लास्टिक कंटेनर (29.2 सेमी x 18.7 सेमी X 8.3 सेमी) कागज तौलिये के पांच चादरें और बाँझ पानी की 100 मिलीलीटर के साथ लाइन में नमी कक्ष बनाएँ. नहीं चैंबर पानी या हवा तंग और अतिरिक्त पानी कागज तौलिये को नम रखने के लिए प्रयोग भर में जोड़ा जाना चाहिए.
  7. जगह एक autoclaved 20 मिलीलीटर कांच जगमगाहट शीशी में चार गुठली और उनके बड़े पैमाने पर रिकॉर्ड. 200 μl बीजाणु निलंबन के साथ टीका लगाना,टोपी, और समान रूप से निलंबन के साथ कोट गुठली के लिए भंवर. टोपी ढीला करने के लिए स्वतंत्र रूप से हवा और नमी कक्ष में विनिमय जगह की अनुमति है.

नोट: इन तरीकों में वर्णित उन से बीज या अन्य कवक के लिए, inoculum की आवश्यकता की राशि अलग हो सकता है और प्रयोगात्मक प्राप्त किया जाना चाहिए सकता है.

  1. 28 ° 7 दिनों के लिए सी या जब तक वांछित एक 12-h-light/12-h-dark photoperiod के तहत गुठली सेते हैं.

2. Conidia गणन

  1. संक्रमण की अवधि के बाद, जगमगाहट संक्रमित गुठली और भंवर 1 मिनट के लिए अच्छी तरह से युक्त शीशियों 5 autoclaved 0.01% बीच 20 मिलीलीटर जोड़ें.
  2. एक विस्तृत बोर विंदुक टिप का उपयोग करना है, तुरंत 2.0 मिलीलीटर Eppendorf 0.01% बीच 20 (या कमजोर के रूप में संक्रमण पर निर्भर करता है की जरूरत है) का 1.8 मिलीग्राम से युक्त ट्यूबों में बीजाणु निलंबन के दो अलग - अलग 200 μl aliquots के हस्तांतरण के द्वारा कमजोर.
  3. प्रत्येक 200 μl अशेष भाजक दो बार की परिगणना करने में एक 4 hemocytometer के साथऔर उपचार के बीच conidia के स्तर की तुलना.

3. Aflatoxin मात्रा

  1. 1 नमूना से 50 मिलीलीटर ब्लेंडर कप के लिए 80% मेथनॉल और 0.05 ग्राम, NaCl कवर और 1 मिनट के लिए उच्च गति पर मिश्रण के 20 मिलीग्राम के साथ गुठली जोड़ें.
  2. एक साफ संग्रह पोत पर एक fluted फिल्टर पेपर प्लेस और फिल्टर में निकालने डालना.
  3. एक साफ बर्तन करने के लिए स्थानांतरण छानना की 10 मिलीलीटर, 20 मिलीलीटर आसुत एच 2 हे, और मिश्रण अच्छी तरह से.
  4. एक साफ कप में 1.5 माइक्रोन गिलास microfibre फिल्टर के माध्यम से फिल्टर नमूना.
  5. फ़िल्टर निकालने के 1 मिलीग्राम Afla टेस्ट स्तंभ के लिए लागू करें और संपीड़ित हवा का उपयोग कर, स्तंभ के माध्यम से 1-2 बूँदें / दूसरा जब तक खाली की दर पर फ़िल्टर निकालने को मजबूर है.
  6. स्तंभ दो बार 1 मिलीग्राम के साथ आसुत एच 2 हे धो 1-2 बूंद / 2 जब तक हवा के माध्यम से आता है स्तंभ के माध्यम से पारित करने के लिए.
  7. 1ml 100 / ड्रॉप दूसरा कांच क्युवेट में एकत्र दर 1-2% HPLC ग्रेड मेथनॉल के साथ elute स्तंभ.
  8. जोड़नाAfla टेस्ट प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक डेवलपर के 1 मिलीग्राम और मिश्रण अच्छी तरह से. को कैलिब्रेटेड fluorometer में रखें क्युवेट और 60 सेकंड में पढ़ें.

नोट: जब Aflatest FGIS प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, fluorometer से माप नमूना का एक प्रारंभिक 50 ग्राम 100 मिलीलीटर में निकाले पर आधारित गणना की है. यदि आप पानी के साथ नमूना के कमजोर पड़ने पर विचार, 1 मिलीग्राम स्तंभ लागू करने के लिए नमूने के 0.166 ग्राम का प्रतिनिधित्व करता है. तो, जब प्रोटोकॉल को संशोधित करने, तुम खाते में नमूना आकार में मतभेद और प्रारंभिक निष्कर्षण समाधान लेने की जरूरत है. उदाहरण के लिए, कर्नेल की 2 ग्राम 20 मिली 80% मेथनॉल में निकाले जाते हैं. यह 0.1 ग्राम / मिलीलीटर है. जब इस नमूने के 1 मिलीग्राम 2 मिलीलीटर पानी के साथ मिलाया जाता है, तरल में नमूने के अनुपात अब 0.033 ग्राम / एमएल. अगर इस नमूने 100 पीपीबी की एक fluorometer पढ़ देता है, वास्तविक एकाग्रता नमूना के 0.166 के अनुपात है, कि है, = पीपीबी (0.166 ग्राम एक्स 100 पीपीबी) / 0.1 ग्राम), या 166 पीपीबी पर आधारित है. वैकल्पिक aflatoxin quantifi के लिएकटियन तरीकों, 7 संदर्भ देखें.

4. Fumonisin बी 1 (FB1) विश्लेषण

  1. जब कवक मकई गुठली पर उगाया जाता है, आंदोलन के बिना कमरे के तापमान पर acetonitrile / पानी (50/50, v / v) की 10 मिलीलीटर के साथ रात भर नमूने निकाल सकते हैं. बाद में, विआयनीकृत पानी (6 मिलीग्राम) के साथ (2 मिलीग्राम) निकालने मिश्रण, और इस मिश्रण को लागू करने (8 मिलीग्राम) C-18 ठोस चरण निष्कर्षण के लिए सीधे.
  2. नमूना लोड हो रहा है, इससे पहले कि acetonitrile की 2 मिलीलीटर पानी के 2 मिलीग्राम द्वारा पीछा के साथ rinsing द्वारा C-18 ठोस चरण निष्कर्षण स्तंभ पूर्व शर्त.
  3. नमूना लोड करने के बाद, स्तंभ पानी के 2 मिलीग्राम / acetonitrile पानी (15/85, v / v) के 2 मिलीग्राम के बाद से धोया जाता है. / Acetonitrile पानी (70/30, v / v) के 2 मिलीग्राम से HPLC विश्लेषण (FB1 युक्त) के लिए नमूना eluted है.
  4. ओ - phthaldehyde के (OPA) के साथ एक 0.1 मिलीग्राम borate बफर (0.05 एम बोरिक acid/0.05 एम सोडियम borate [50/50, v / v], 8.5 पीएच) और 0.1 युक्त शीशी स्तंभ प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक 0.1 मिलीलीटर स्थानांतरित के द्वारा FB1 Derivatize मिलीलीटर (0.1 मिलीग्राम / मिलीग्राम aceton में OPAitrile mercaptoethanol) - 0.5% के साथ.
  5. 10 मिनट के बाद acetonitrile/0.01 एम बोरिक एसिड (40/60, v / v) की 0.5 मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो.
  6. Shimadzu HPLC नियंत्रण रेखा 20AT एक विश्लेषणात्मक Zorbax ODS (4.6 150 मिमी) स्तंभ और एक चर तरंग दैर्ध्य Shimatzu आरएफ 10Axl प्रतिदीप्ति डिटेक्टर (उत्तेजना 335 एनएम / 440 एनएम उत्सर्जन) के साथ सुसज्जित प्रणाली पर FB1 विश्लेषण.
  7. एक रेखीय ढाल (विलायक एक: acetonitrile/0.1 एम (40/60) सोडियम फास्फेट, 3.3 पीएच, विलायक बी: acetonitrile / 0.1 एम (60/40) सोडियम फास्फेट, 3.3 पीएच) प्रयोग किया जाता है और ढाल कार्यक्रम निम्नानुसार है: 100% 100% 10 मिनट, 5 मिनट के लिए 100% बी में बी.
  8. HPLC द्वारा FB1 मानकों का विश्लेषण, और चोटी के क्षेत्र मापन के लिए मानक वक्र उत्पन्न किया जाता है. इसके बाद शिखर FB1 मानक वक्र के साथ क्षेत्रों की तुलना द्वारा एक नमूना FB1 स्तर यों.

5. Ergosterol विश्लेषण

  1. संस्कृति 7-14 दिनों के लिए मकई गुठली पर कवक.
  2. Meth: ऊष्मायन अवधि के बाद, क्लोरोफॉर्म की 10 मिलीलीटर जोड़ेंप्रत्येक शीशी में anol (02:01 वी / वी). एक बार जोड़ा, नमूने अच्छी तरह से हिला और फिर कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए अंधेरे में शीशियों सेते हैं.
  3. 24 बजे के बाद नमूने अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा और यह 0.45 उम नायलॉन झिल्ली के माध्यम से फिल्टर.
  4. Shimadzu HPLC नियंत्रण रेखा 20AT एक 4.6 यू ODS-C18 (200, 250 ± 4.6 मिमी) स्तंभ और एक Shimadzu एसपीडी 20A / यूवी तुलना डिटेक्टर 282 एनएम पर नजर रखने के लिए सेट के साथ सुसज्जित प्रणाली में सीधे नमूना इंजेक्षन.
  5. मोबाइल चरण के रूप में 1.5 एमएल / मिनट की एक प्रवाह की दर में मेथनॉल (100%) का उपयोग करें. एक मानक वक्र HPLC ग्रेड ergosterol से उत्पन्न करने के लिए नमूने के शिखर क्षेत्रों की तुलना द्वारा नमूनों में ergosterol की मात्रा का ठहराव का निर्धारण करते हैं.

6. प्रतिनिधि परिणाम

टीका और दो से तीन दिनों के लिए एक नमी कक्ष में ऊष्मायन के बाद, कवक विकास गुठली पर प्रदर्शित करने के लिए शुरू करना चाहिए. सात दिनों के बाद उपचार, इलाज के पौधों पर वनस्पति विकास स्पष्ट रूप से दिखाई हो, whilई नकली नियंत्रण असंक्रमित होना चाहिए (चित्रा 1 बी, शीर्ष). अब ऊष्मायन की काल अधिक प्रचुर वनस्पति विकास (चित्रा 1 बी, नीचे) के लिए अनुकूल हैं. शर्तों के तहत इस के साथ साथ वर्णित (चित्रा 2 जी) ए, flavus जंगली प्रकार 3357 प्रदर्शित 8, 6, और 8 दिन, क्रमशः में बसाना, aflatoxin, संचय, और conidia उत्पादन की अधिकतम मान (चित्रा 2, एसी) NRRL. हालांकि, जब mycotoxin संदूषण और conidiation के ergosterol की प्रति यूनिट की तुलना में थे, सबसे बड़ा स्तर 4 और 6 दिनों में मनाया गया, क्रमशः (चित्रा 2, डे) चित्रा 2 एफ. इन कवक बायोमास पर निर्भर अधिकतम मूल्य टिप्पणियों को सारांशित. दिलचस्प है, 4-6 दिनों के बाद - टीका के बीच, गुठली न्यूक्लिक एसिड गिरावट, के रूप में पाठ्यक्रम समय (चित्र 2H, नीचे) पर नमूनों से कुल शाही सेना द्वारा देखा से गुजरना है.

हमारे अपने सहित कई अध्ययनों, examin हैएड एफ मक्का 2,8,9,10,11,12 गुठली पर verticilliodies संक्रमण और सफलतापूर्वक समय अंक की टिप्पणियों के लिए के रूप में 7-13 दिनों का इस्तेमाल किया. विधियों का प्रयोग यहाँ बताया, fumonisin 3,500-8,000 एनजी / छ 4,13 कर्नेल और ergosterol स्तर के सीमा से रेंज स्तर 5,000-10,000 से और fumonisin (ऊपर) और (नीचे ergosterol के लिए एनजी / छ गिरी 14,13 चित्रा 3 प्रतिनिधि चोटियों से पता चलता है ) chromatograms HPLC से. Ergosterol का मापन भी absorbance के 15 स्पेक्ट्रा के माध्यम से बाहर किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. कवक बायोमास, रेणूजनक, और mycotoxin उत्पादन और कर्नेल bioassays से वनस्पति के विकास के लिए प्रतिनिधि परिणाम की मात्रा का ठहराव के लिए फ्लो चार्ट. ए) फ्लो चार्ट मौलिक जैविक मक्का गुठली पर कवक रोगजनन का आकलन किया मापदंडों की मात्रा का ठहराव के लिए वर्णित विधि रूपरेखा. बी) के प्रतिनिधिकर्नेल bioassays के लिए परिणाम है. शीर्ष ए, (NRRL3357) B73 आनुवंशिक पृष्ठभूमि में मक्का गुठली पर वनस्पति विकास flavus. बीज 10 6 spores / एमएल और चित्रों के 200 μl 7 दिनों के बाद टीका लिया गया साथ inoculated थे. तल, एफ. verticillioides B73 पृष्ठभूमि 13 दिनों के बाद संक्रमण में गुठली का टीका. गुठली 10 6 spores / एमएल की 200 μl साथ inoculated थे.

चित्रा 2
चित्रा 2. Aspergillus flavus गिरी bioassay समय के पाठ्यक्रम. B73 गुठली 10 6 spores / एमएल Aspergillus flavus conidial निलंबन के 200 μl साथ inoculated थे और 2-8 दिनों (जी) के लिए incubated रहे. (; मतलब एसई ± n = 3-4) सभी मान 4 गुठली की सूखी वजन औसत से निर्धारित किया गया है. ए) (ergosterol के आधार पर) के औपनिवेशीकरण, (बी) aflatoxin, और ऊपर वर्णित विधि का उपयोग कर (सी) conidiation मात्रा गया. ई) aflatoxin और (एफ) conidiation के प्रदर्शित किए जाते हैंकवक बायोमास रूप घंटे ergosterol के माध्यम से मापा के एक समारोह के रूप में. एफ) ergosterol, aflatoxin संचय के, और कवक बायोमास के एक समारोह के रूप में conidiation के लिए अधिकतम मान - प्रत्येक मात्रा के लिए अधिकतम मूल्य 100% करने के लिए सेट मनाया गया. (एच) समय - पाठ्यक्रम से कुल शाही सेना के लेन प्रति 1 μg.

चित्रा 3
चित्रा 3 प्रतिनिधि fumonisin (ऊपर) B1 और ergosterol (नीचे) Fusarium verticillioides (M3125) से संक्रमित गुठली से अलग के लिए उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) की chromatograms.

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Discussion: फफूंद की औपनिवेशीकरण, रेणूजनक और mycotoxins का उत्पादन की मात्रा कर्नेल bioassays का उपयोग

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Disclosures: फफूंद की औपनिवेशीकरण, रेणूजनक और mycotoxins का उत्पादन की मात्रा कर्नेल bioassays का उपयोग

Acknowledgements: फफूंद की औपनिवेशीकरण, रेणूजनक और mycotoxins का उत्पादन की मात्रा कर्नेल bioassays का उपयोग

हम उनकी तकनीकी सहायता के लिए से ब्रैंडन Hassett और कार्लोस Ortiz, शुक्रिया अदा करना चाहूँगा. यह काम NSF के आइओबी - 0544428 अनुदान, IOS 0951272, और डॉ. माइकल Kolomiets के लिए IOS - 0925561 द्वारा समर्थित किया गया था, और खाद्य और कृषि USDA राष्ट्रीय संस्थान (NIFA), Afri प्लांट ब्रीडिंग और शिक्षा अनुदान # 2,010-85,117 -20,539 डीआरएस. सेठ मरे, थॉमस Isakeit, और माइकल Kolomiets के.

Materials: फफूंद की औपनिवेशीकरण, रेणूजनक और mycotoxins का उत्पादन की मात्रा कर्नेल bioassays का उपयोग

Name Company Catalog Number Comments
Potato Dextrose Agar Fisher Scientific S71659A
Tween-20 Fisher Scientific BP337-100
Plastic incubation container Sterilite 1713LAB06
Blender Vicam 20200
24 cm Fluted Filter Papers Vicam 31240
1.5 m glass microfibre Vicam 31955
Afla Test column Vicam G1024
Afrla Test Developer Vicam 32010
Methanol Vicam 35016
Acetonitrile Fisher Scientific AC14952-0025
Ethanol Fisher Scientific AC39769-0025
C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) Fisher Scientific 60108-304
O-phthalaldehyde (OPA) Sigma-Aldrich 79760-5g
Boric acid Fisher Scientific BP168-500
Sodium borate Fisher Scientific RDCS0330500
Mercaptoethanol Fisher Scientific 45-000-231
Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) Shimadzu Corporation LC-20AT
Zorbax ODS column (4.6x150mm) Agilent Technologies 443905-902
Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector Shimadzu Corporation RF-10AXL
Sodium phosphate Fisher Scientific AC38987-0010
FB1 standards Sigma-Aldrich F1147-1mg
Chloroform VWR international MK444410
13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) Pall Corporation 4426
Ergosterol Sigma-Aldrich 45480-50G-F
Scintillation vials VWR international 66021-602
Sodium Chloride Vicam G1124

References: फफूंद की औपनिवेशीकरण, रेणूजनक और mycotoxins का उत्पादन की मात्रा कर्नेल bioassays का उपयोग

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